Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Эта работа финансировалась министерством образования КЧП CZ Грант LL1205, Грант Грант агентства Чешской Республики 18-17529S и ЕФРР/ПФ проекта центр исследований патогенности и вирулентности паразитов (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. буферов и решения
<ol><li>Подготовка решения, перечисленные ниже. Дега все буферы для жидкостной хроматографии. Добавление ADP, benzamidine и ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.<ol>
<li>Подготовка буфера A: 50 мм буфер Tris с соляной кислоты (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 М сахарозы, 5 мм benzamidine, 5 ?...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

Протокол для F1-АТФазы очистки от т. brucei был разработан на основе опубликованных ранее методы для изоляции F1-АТФазы комплексы от других видов13,14. Метод не требует каких-либо генетические модификации (например, маркировка) и дает полно?...

F-типа СПС synthases мембраны прыгните вращающихся multiprotein комплексов транслокации Протон что пара через преобразователя энергии мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов с образованием АТФ. Молекулярные вращательного механизма синтеза АТФ известно главным образом из-за структурных исследований очищенный бактериальных и митохондриальной synthases СПС и их Субкомплексы1. F-тип АТФ-синтазы организована в внутренние мембраны и мембраны внешняя постановление. Мембраны внешняя часть, известный как F1-АТФазы, содержит три катализатора сайты, где происходит фосфорилирование аденозиндифосфат (ADP) СПС или обратной реакции. F1-АТФазы могут быть освобождены экспериментально от мембраны неотъемлемой части молекулы при сохранении ее способность гидролизуют, но не синтезировать, СПС. Мембраны прыгните сектора, называется Fo, посредником транслокации белка, который управляет вращение центральной частью фермента. F1 и Fo секторов соединены Центральной и периферической стеблей.
Первые попытки очистить F1-АТФазы от начинающего дрожжей и бычьего сердца митохондрий Дата обратно в 1960-х. Эти протоколы, используемые извлечены митохондрий, которые были сорваны sonication, фракционированный высыпанием аммония или протамина сульфат, следуют необязательные хроматографии шаги и термической обработки2,3,4 ,5,6. Очистки была значительно улучшена и упрощена путем использования метилхлороформа, который легко выпускает F1-АТФазы от митохондриальной мембраны фрагменты7. Хлороформ добыча затем используется для извлечения F1- ATPases от различных животных, растений и бактерий источников (например, печени крыс8, кукуруза9, Арум maculatum10и Escherichia coli 11). Дальнейшей очистки хлороформ выпущена F1-АТФазы хромотографией сродства или размер исключение (SEC) принесли очень чистый белок комплекс, который подходит для определения структуры с высоким разрешением, рентгеноструктурного анализа, как документально подтверждено структур F1-АТФазы из сердца быка12,13 и14 Saccharomyces cerevisiae. F1-АТФазы структуры были определены также от организмов, которые трудны для того культивировать и, таким образом, сумма первоначального биологического материала было ограничено. В данном случае, F1-АТФазы подразделения были искусственно выразил смонтирован в комплекс в E. coli, и весь гетерологичных фермента был очищен, близость хроматографии через тегами субъединицы. Такой подход привел к определению F1-АТФазы структур из двух термофильных бактерий видов,15 Geobacillus stearothermophilusи Caldalkalibacillus thermarum16, 17. Однако эта методология довольно непригодна для eukaryotic F1- ATPases, поскольку он опирается на прокариот protheosynthetic аппарат, Посттрансляционная обработки и сложные Ассамблеи.
Добыча на основе хлороформ ранее использовался для изоляции F1- ATPases от digenetic одноклеточными паразитами Trypanosoma cruzi18 и т. brucei19, важные млекопитающих патогенов, вызывая Америки и Африканские trypanosomiases, соответственно и от Моногенные паразитов насекомых Crithidia fasciculata20. Эти очищения привело лишь к простой описание F1- ATPases, так как не нисходящие приложения были использованы в полной мере характеризуют состав, структура и ферментативные свойства комплекса. Эта статья описывает оптимизированный метод для F1-АТФазы очищение от стадии искусственного насекомого жизненного цикла т. brucei. Метод разработан на основании установленных протоколов для изоляции говядину и дрожжи F1- ATPases21,22. Процедура дает очень чистые и однородные фермента подходит для в vitro ферментативные и тормозящий анализов, подробные proteomic характеристика по масс-спектрометрии23и структуры определения24. Протокол очистки и знания о F1-АТФазы структуры на атомном уровне открывает возможность для разработки экранов для определения малых молекул ингибиторов и помощь в разработке новых лекарств против африканских trypanosomiases. Кроме того, этот протокол может быть адаптирована для очистки F1-АТФазы от других живых организмов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-АТФазы является мембрана внешняя каталитического подкомплекса F-тип АТФ-синтазы, фермент, который использует Протон движущей силой через биологические мембраны для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Изоляции нетронутыми F1-АТФазы от его собственного источника является необходимым условием для характеризуют состав белков, кинетические параметры и чувствительность к ингибиторы фермента. Очень чистые и однородные F1-АТФазы может использоваться для структурных исследований, которые дают понимание молекулярных механизмов синтеза АТФ и гидролиз. Эта статья описывает процедуру для очистки F1-АТФазы от Trypanosoma brucei, возбудителя африканской trypanosomiases. F1-АТФазы изолирован от митохондриальной пузырьки, которые получаются путем гипотонический лизис из трипаносом в vitro культивировали. Везикулы механически фрагментированы, sonication и F1-АТФазы освобождается от внутренней митохондриальной мембраны экстракцией хлороформ. Энзимный комплекс является неразделимая подряд анион обмен и хроматография размер исключение. Чувствительных масс-спектрометрии методы показали, что очищенный комплекс лишена практически любых белковых загрязнений и, таким образом, представляет собой подходящий материал для определения структуры кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии. Изолированные F1-АТФазы экспонатов гидролитическая деятельность СПС, которая может быть полностью тормозится азид натрия, мощным ингибитором synthases F-типа СПС. Очищенный комплекс остается стабильным и активным в течение трех дней при комнатной температуре. Количество осадков в сульфат аммония используется для длительного хранения. Аналогичные процедуры используются для очистки F1- ATPases с тканями растений и млекопитающих, дрожди или бактерии. Таким образом, представленные протокол может служить в качестве ориентира для F1-АТФазы изоляции от других живых организмов.

Типичный очистки (рис. 1) начинается с митохондриальных везикулы (mitoplasts), изолированные на Percoll градиент от hypotonically лизированных 1 х 1011 11 procyclic 2 x 10 т. brucei клетки25 культивировали в стандарте Глюкоза богатые SDM-79 средних<sup class="xref"...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Этот протокол описывает очищение F1-АТФазы из искусственного насекомых стадии Трипаносомы brucei. Процедура дает чистый, однородной и активный комплекс подходит для исследования структурных и ферментативные.

Изоляции F1-АТФазы от паразитических протисты Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

Очистка F1-ATPase основана на классических биохимических методах, которые оказались решающими для нашего понимания механизма производства АТФ другими синтазы АТФ. Основным преимуществом этого метода является то, что он производит очень чистый фермент, пригодный для определения структуры с помощью рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии. Хотя этот протокол оптимизирован для изоляции F1-ATPase от трипаносом, он может быть адаптирован к другим источникам, таким как ткани или клетки культуры, а также к различным патогенным протеистам.Этот метод может привести к выявлению новых препаратов для лечения тяжелых заболеваний человека. Например, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase является аутентифицированной целью препарата для лечения туберкулеза. Для начала протокола, оттепель и мягко resuspend митохондриальных пузырьков, также известный как митопласты, ранее изолированные гипотонического лиза от одного раза 10 до 11 до 2 раз 10 до 11 клеток проциклической трипаносомы бруци в пяти миллилитров ледяной Buffer A.Keep образца охлаждается.Затем определите концентрацию белка в суспензии по бицинхониновой кислоте, или BCA, белковому анализу в соответствии с инструкциями производителя. Выполните серию разбавления BSA в ультра чистой воде, чтобы построить стандартную кривую. Разбавить небольшое количество образца от 20 до 100 раз с ультра чистой водой, чтобы вписаться в диапазон стандартов BSA.После расчета общего количества белка в образце, довести концентрацию белка до 16 миллиграммов на миллилитр, разбавляя его с дополнительными Buffer A.Then фрагмент митопластов в перевернутые пузырьки и мембраны штук sonication семь раз в течение 15 секунд каждый, с общей энергией от 70 до 100 джоулей на импульс с микротипом диаметром 3,9 миллиметра. При фрагментации инкубировать образец на льду в течение 30 секунд между импульсами. После звукового действия подвеска может показаться немного темнее.Отложения фрагментов мембраны путем ультрацентрифугации при 54 000 г в течение 16 часов или при 98 000 г в течение пяти часов при четырех градусах Цельсия. Декант супернатант и приступить к экстракции хлороформа. Рассчитайте объем буфера B на основе общего количества используемого буфера А.Перенесите замороженный осадок из центрифуги в гомогенизатор. Переусейте гранулы митохондриальных мембран в буфере B с помощью небольшого гомогенизатора Dounce. Перенесите подвеску на 50 миллилитровую коническую трубку.Удалите образец со льда, и сохранить образец и все решения при комнатной температуре для остальных шагов. Затем добавьте хлороформ, насыщенный двумя молярными трисами, скорректированными с HCl до pH 8.5, один к одному. Закройте крышку плотно, и встряхните образец энергично в течение ровно 20 секунд.Сразу же центрифуга смеси при температуре 8 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее перенесите верхнюю, пасмурную фазу на 1,6 миллилитров микротрубки. Добавьте ингибиторы протеазы в образец, чтобы заменить ингибиторы, удаленные при лечении хлороформом.Центрифуга образцов при температуре 13 000 г в течение 30 минут при комнатной температуре. После вращения перенесите супернатант на свежие микротрубки и повторите центрифугу, чтобы удалить оставшийся нерастворимый материал. Equilibrate пять миллилитров анионные обмена колонки прилагается к быстрой белковой жидкой хроматографии системы с 50 миллилитров буфера колонки с скоростью потока пять миллилитров в минуту до поглощения на 280 нанометров и проводимости стабилизировать.Загрузите супернатант на уравновешенную колонку со скоростью потока в миллилитр в минуту. Подождите, пока поглощение на 280 нанометров стабилизируется на заднем плане. Нанесите 25 миллилитров линейного градиента буфера elution столбца от 0%до 100% при скорости потока 0,5 миллилитров в минуту и соберите одну миллилитровую фракцию.Анализ 10 микролитров каждой отдельной фракции, соответствующей основному пику элюции для гидролитической активности АТФ на миллилитр реакционной смеси анализом Pullman ATPase при рН 8.0. Бассейн фракций, которые демонстрируют активность ATPase. Сосредоточьте объединили образец мембранной ультрафильтрации с помощью спиновой колонки со 100 000 молекулярных фильтров PES для отсечения веса до 200-500 микролитров.Затем приступайте к хроматографии исключения размера. Equilibrate Superose 6 Увеличение колонки прилагается к жидкой хроматографии системы, по крайней мере 48 миллилитров буфера SEC со скоростью потока 0,5 миллилитров в минуту. Нанесите образец на столбец.Выполните хроматографию со скоростью потока 0,25 миллилитров в минуту, собирая при этом 0,25 миллилитровых фракций. Далее запустите 10 микролитров фракций, которые соответствуют пикам УФ-280 нанометрового следа абсорбционности на SDS-PAGE. Затем испачкаем образцы Кумасси Блю.Проанализировать фракции, соответствующие первому крупному пику, содержащем пик F1 для гидролитической активности АТФ и чувствительность азида по анализу Pullman ATPase. Затем выполните анализ BCA, чтобы определить концентрацию белка. Наконец, держите очищенный F1-ATPase при комнатной температуре и используйте его в течение трех дней после очистки для применения ниже по течению.Этот elution профиль хроматографии обмена аниона отображает абсорбцию УФ на 280 нанометров и концентрацию хлорида натрия в буфере элюции. Выбранные фракции были разделены на гель SDS-PAGE и окрашены красителем Coomassie Blue. Фракции, которые соответствуют основному пику элюции от хроматографии анионные обмены и содержат F1-ATPase, были объединились, сконцентрированы и использованы в качестве ввода для хроматографии исключения размера.Основным загрязнителем является дигидролипойл дегидрогеназа, которая высовывается из столбца хроматографии с исключением размеров в качестве дискретного пика. F1-ATPase elutes в первом доминирующем, в основном симметричном пике. Coomassie Blue окрашивание типичного шаблона полосы после разделения очищенных F1-ATPase через SDS-PAGE показывает спорадические слабые полосы, видимые над бета-подразделением, которые представляют собой подкомплексы альфа-три бета три головных убора, димеры и олигомеры альфа- и бета-подразделений, и лишены каких-либо загрязняющих веществ, обнаруживаемых масс-спектрометрией.Выполняя экстракции хлороформа, критический шаг протокола, важно встряхнуть образец энергично и перейти к центробежной разделения органических и aqueous фаз немедленно. После этой процедуры изолированный F1-ATPase можно подробно охарактеризовать масс-спектрометрией. Кроме того, он может быть использован в анализах активности или для структурных исследований, как самостоятельно, так и в присутствии различных ингибиторов или субстратных аналогов.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Выделение родственным РНК-белковых комплексов из клеток с использованием направленного на олигонуклеотиды элюция

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Эффективный метод для выделения высокоочищенного РНК из семян для использования в количественном анализе Транскриптом

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Быстрая изоляция Mitoribosome из клеток ГЭС

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Изоляция тканей внеклеточных пузырьков от печени

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Изоляция частиц липопротеинов из куриного яичного желтка для изучения бактериального патогена жирной кислоты Инкорпорации в Мембрана фосфолипиды

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Перевод Рибосома Сроднистого Очищения (TRAP) для изоляции РНК от эндотелиальных клеток In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Готовая к использованию qPCR для обнаружения ДНК из Trypanosoma cruzi или других патогенных организмов

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...