Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por el Ministerio de educación ERC CZ conceder LL1205, la concesión de la beca Agencia de República Checa 18-17529S y por FEDER/FSE del proyecto centro de investigación de patogenicidad y virulencia de los parásitos (no. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. tampones y soluciones
<ol><li>Preparar las soluciones a continuación. Degas todos los búferes para cromatografía de líquidos. Añadir inhibidores de proteasa, ADP y benzamidine justo antes del uso.<ol>
<li>Preparar tampón de Tris buffer A: 50 mM con ácido clorhídrico (Tris-HCl) pH 8.0, sacarosa de 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5 mM aminocaproico ácido (ACA) y la proteasa inhibidores (10 amastatin μm, 50 μm bestatina, 50 μm pepstatin, leupeptin μm 50 y 50 μm diprotin A).</li>
		<li>Preparación de tampón B:...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

El protocolo para F1-purificación de ATPasa de T. brucei se desarrolló en base a métodos previamente publicados para el aislamiento de F1-complejos de ATPasa de otras especies13,14. El método no requiere ninguna modificación genética (p. ej., etiquetado) y produce un complejo activo con todas las subunidades presentes. El paso crucial es la liberación facilitada de cloroformo de la F1-ATPasa de la membrana...

El tipo F ATP sintasas son membrana-limite rotación complejos de multiproteínas translocación de protón de pareja a través de membranas transductoras de energía de las bacterias, mitocondrias y cloroplastos con la formación de ATP. Detalles moleculares del mecanismo rotacional de la síntesis de ATP son conocidos principalmente por los estudios estructurales de purificada bacterianas y mitocondriales ATP sintasas y sus Subcomplejos de mando1. Tipo F ATP sintasa se organiza en moléculas de membrana-intrínsecas y extrínsecas de la membrana. La parte extrínseca de la membrana, conocida como F1-ATPasa, contiene tres sitios catalíticos, donde se produce la fosforilación del Adenosín difosfato (ADP) a ATP o la reacción reversa. F1-ATPasa puede liberarse experimentalmente la parte intrínseca de la membrana mientras que conserva su capacidad de hidrolizar pero no sintetizar, ATP. El sector unida a la membrana, llamado Fo, media la translocación de la proteína, que impulsa la rotación de la parte central de la enzima. La F1 y Fo sectores están conectados por los tallos centrales y periféricos.
Los primeros intentos purificar la F1-ATPasa de la levadura de florecimiento y la fecha de las mitocondrias de corazón bovino hacia la década de 1960. Estos protocolos utilizados extraen las mitocondrias, que fueron interrumpidas por sonicación, fraccionado por la precipitación de sulfato amónico o protamina, seguido de cromatografía opcional pasos y tratamiento térmico2,3,4 ,5,6. La purificación fue grandemente mejorada y simplificada por el uso de cloroformo, que libera fácilmente la F1-ATPasa de la membrana mitocondrial fragmentos7. La extracción de cloroformo entonces fue utilizada para extraer F1- ATPasas de varios animales, plantas y fuentes bacterianas (p. ej., hígado de rata8, maíz9, Arum maculatum10y de Escherichia coli 11). Más purificación de liberado cloroformo F1-ATPasa por cromatografía de afinidad o de exclusión de tamaño (SEC) produjo una proteína altamente pura compleja, que era conveniente para la determinación de la estructura de alta resolución por cristalografía de rayos x, como documentado por las estructuras de F1-ATPasa de corazón bovino12,13 y14de la Saccharomyces cerevisiae. F1-estructuras de ATPasa también se determinaron de organismos que son difíciles de cultivar y, por lo tanto, la cantidad de la materia biológica inicial fue limitada. En este caso, F1-ATPase subunidades fueron artificialmente expresados y montados en el complejo de e. coli, y la enzima entera heteróloga se purificó por cromatografía de afinidad a través de una subunidad etiquetada. Tal planteamiento condujo a la determinación de F1-estructuras de la ATPasa de dos especies bacterianas termófilas, Geobacillus stearothermophilus15 y thermarum Caldalkalibacillus16, 17. sin embargo, esta metodología es algo inadecuada para eucariotas F1- ATPasas puesto que se basa en el aparato protheosynthetic procariotas procesamiento postraduccional y montaje complejo.
La extracción de cloroformo-basado fue utilizada previamente para aislar F1- ATPasas de trematodos unicelulares parásitos Trypanosoma cruzi18 y T. brucei19importantes patógenos mamíferos causando americano y Tripanosomiasis africanas, respectivamente y de parásito de insectos monogénica Crithidia fasciculata20. Estas purificaciones condujeron sólo a una simple Descripción de la F1- ATPasas, puesto que no hay aplicaciones posteriores fueron utilizadas para caracterizar completamente la composición, estructura y características enzimáticas del complejo. Este artículo describe un método optimizado para la F1-purificación de la ATPasa de la etapa del ciclo de vida de insectos cultivados de T. brucei. El método se desarrolla en base a los protocolos establecidos para el aislamiento de bovinos y levadura F1- ATPasas21,22. El procedimiento produce enzima altamente pura y homogénea adecuada para en vitro enzimática inhibitoria ensayos y, proteómicos detallada caracterización por espectrometría de masas23y estructura determinación24. El protocolo de purificación y el conocimiento de la F1-estructura de la ATPasa a nivel atómico abre una posibilidad para el diseño de pantallas para identificar inhibidores de molécula pequeña y ayudar en el desarrollo de nuevos fármacos contra la tripanosomiasis africanas. Por otra parte, el protocolo puede ser adaptado para purificar F1-ATPasa de otros organismos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPasa es un subcomplex catalítico membranas extrínsecas de tipo F ATP sintasa, una enzima que utiliza la fuerza motriz de protones a través de membranas biológicas para producir trifosfato de adenosina (ATP). El aislamiento de la intacta F1-ATPasa de la fuente nativa es un requisito previo esencial para caracterizar la composición proteica, parámetros cinéticos y sensibilidad a los inhibidores de la enzima. Un altamente pura y homogénea F1-ATPasa puede ser utilizada para estudios estructurales, que proporcionan la penetración en mecanismos moleculares de la síntesis de ATP y a la hidrólisis. Este artículo describe un procedimiento para la purificación de la F1-ATPasa de Trypanosoma brucei, el agente causal de la tripanosomiasis africanas. F1-ATPasa está aislada de las vesículas mitocondriales, que son obtenidas por lisis hipotónica de tripanosomas en vitro cultivados. Las vesículas son fragmentadas mecánicamente por sonicación y F1-ATPasa se libera de la membrana interna mitocondrial por la extracción de cloroformo. El complejo enzimático es más purificado por intercambio del anión consecutivos y cromatografía por exclusión de tamaño. Técnicas de espectrometría de masas sensibles demostraron que el complejo purificado está desprovisto de cualquier contaminantes de la proteína y, por lo tanto, representa el material adecuado para la determinación de la estructura por cristalografía de rayos x o microscopia del cryo-electrón. Los aislados de F1-ATPasa exhibe actividad hidrolítica de la ATP, que puede ser inhibida totalmente por la azida sódica, un inhibidor potente del tipo F ATP sintasas. El complejo purificado permanece estable y activo por lo menos tres días a temperatura ambiente. Precipitación por sulfato de amonio se utiliza para almacenamiento a largo plazo. Procedimientos similares se han utilizado para la purificación de F1- ATPasas de los tejidos de mamíferos y plantas, levaduras y bacterias. Así, el protocolo presentado puede servir como una guía para la F1-aislamiento de ATPasa de otros organismos.

Una purificación típico (figura 1) inicia con vesículas mitocondriales (mitoplasts) aisladas en el gradiente de Percoll de hypotonically sometidas a lisis 1 x 1011 a 2 x 1011 procíclicas T. brucei células25 cultivadas en estándar glucosa media27de SDM-79. Los mitoplasts están fragmentadas por sonicación, hilada, y se descarta el sobrenadante que contiene la matriz. Las memb...

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Este protocolo describe la purificación de F1-ATPasa de la etapa de insectos cultivada de Trypanosoma brucei. El procedimiento produce un complejo altamente puro, homogéneo y activo adecuado para estudios estructurales y enzimáticos.

Aislamiento de F1-ATPasa de los Protista parásito Trypanosoma brucei

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

La purificación de F1-ATPase se basa en un método bioquímico clásico que demostró ser crucial para nuestra comprensión del mecanismo de producción de ATP por otras sintetizadoras ATP. La principal ventaja de esta técnica es que produce una enzima altamente pura adecuada para la determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X o microscopía crioelectrólica. Aunque este protocolo está optimizado para el aislamiento de F1-ATPase de los tripanosomas, se puede adaptar a otras fuentes, como las células tisulares o de cultivo, y a varios protistas patógenos.Esta técnica puede conducir a la identificación de nuevos medicamentos para tratar enfermedades humanas graves. Por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase es un objetivo farmacológico autenticado para el tratamiento de la tuberculosis. Para comenzar el protocolo, descongelar y resuspend suavemente vesículas mitocondriales, también conocidas como mitoplastas, previamente aisladas por lisis hipotónica de una por 10 a la 11 a dos veces 10 a las 11 células de Trypanoma brucei procyclic en cinco mililitros de Buffer A.Keep la muestra refrigerada.A continuación, determinar la concentración de proteínas en la suspensión por el ácido bicinchoninico, o BCA, ensayo de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Realice una serie de dilución BSA en agua ultra pura para construir la curva estándar. Diluir una pequeña cantidad de la muestra de 20 a 100 veces con agua ultra pura para encajar en el rango de los estándares BSA.Después de calcular la cantidad total de proteínas en la muestra, llevar la concentración de proteína a 16 miligramos por mililitro diluirlo con Tampón adicional A.Luego fragmentar los mitoplastos en vesículas invertidas y piezas de membrana por sonicación siete veces durante 15 segundos cada una, con una energía total de 70 a 100 julios por impulso con una microtip con un diámetro de 3,9 milímetros. Mientras se fragmenta, incuba la muestra sobre hielo durante 30 segundos entre impulsos. Después de la sonicación, la suspensión puede parecer ligeramente más oscura.Sedimentar los fragmentos de membrana por ultracentrifugación a 54.000 g durante 16 horas o a 98.000 g durante cinco horas a cuatro grados centígrados. Decantar el sobrenadante y proceder con la extracción de cloroformo. Calcule el volumen del búfer B en función de la cantidad total de búfer A utilizado.Transfiera el sedimento congelado del tubo centrífugo al homogeneizador. Resuspender el pellet de las membranas mitocondriales en el búfer B con la ayuda de un pequeño homogeneizador Dounce. Transfiera la suspensión a un tubo cónico de 50 mililitros.Retire la muestra del hielo y mantenga la muestra y todas las soluciones a temperatura ambiente para los pasos restantes. A continuación, agregue cloroformo saturado con dos tris molares ajustados con HCl a pH 8.5, uno a uno. Cierre bien la tapa y agite la muestra vigorosamente durante exactamente 20 segundos.Centrifugar inmediatamente la mezcla a 8.400 g durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera la fase acuosa superior y turbia a microtubos de 1,6 mililitros. Añadir inhibidores de la proteasa a la muestra para reemplazar los inhibidores eliminados por el tratamiento con cloroformo.Centrifugar las muestras a 13.000 g durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del giro, transfiera el sobrenadante a microtubos frescos, y repita la centrifugación para eliminar cualquier material insoluble restante. Equilibrar la columna Q de intercambio de aniones de cinco mililitros unida a un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida con 50 mililitros de tampón de columna Q a un caudal de cinco mililitros por minuto hasta que la absorbancia a 280 nanómetros y la conductividad se estabilicen.Cargue el sobrenadante en la columna equilibrada a un caudal de un mililitro por minuto. Espere hasta que la absorbancia a 280 nanómetros se estabilice en el fondo. Aplique un gradiente lineal de 25 mililitros del búfer de elución de columna Q de 0%a 100%a un caudal de 0,5 mililitros por minuto y recoja fracciones de mililitro.Ensayo de 10 microlitros de cada fracción individual correspondientes al pico de elución principal para la actividad hidrolítica ATP por mililitro de mezcla de reacción por el ensayo Pullman ATPase a pH 8.0. Acoba las fracciones que exhiben actividad ATPase. Concentrar la muestra agrupada por ultrafiltración de membrana utilizando una columna de espín con un filtro PES de corte de peso molecular de 100.000 a 200 a 500 microlitros.A continuación, proceda a la cromatografía de exclusión de tamaño. Equilibrar la columna Superose 6 Aumentar unida a un sistema de cromatografía líquida con al menos 48 mililitros de tampón SEC a un caudal de 0,5 mililitros por minuto. Aplique el ejemplo a la columna.Ejecute la cromatografía a un caudal de 0,25 mililitros por minuto, mientras recoge fracciones de 0,25 mililitros. A continuación, ejecute 10 microlitros de las fracciones que corresponden a los picos de la traza de absorbancia de 280 nanómetros UV en SDS-PAGE. Luego tiñe las muestras con Coomassie Blue.Ensayar las fracciones correspondientes al primer pico importante que contiene el pico de F1 para la actividad hidrolítica ATP y la sensibilidad azerí por el ensayo Pullman ATPase. A continuación, realice un ensayo de BCA para determinar la concentración de proteínas. Por último, mantenga el F1-ATPase purificado a temperatura ambiente y utilícelo dentro de los tres días posteriores a la purificación para aplicaciones posteriores.Este perfil de elución de una cromatografía de intercambio de aniones muestra la absorbancia UV a 280 nanómetros y la concentración de cloruro de sodio en el tampón de elución. Las fracciones seleccionadas se separaron en el gel SDS-PAGE y se teñiron con tinte Coomassie Blue. Las fracciones que corresponden al pico de elución principal de la cromatografía de intercambio de aniones y contienen la F1-ATPase se agruparon, concentraron y se utilizaron como entrada para la cromatografía de exclusión de tamaño.El principal contaminante es la dihidrolipoyl deshidrogenasa, que elue de la columna de cromatografía de exclusión de tamaño como pico discreto. El F1-ATPase elue en el primer pico dominante, en gran parte simétrico. La tinción Coomassie Blue de un patrón de banda típico después de la separación de la F1-ATPase purificada a través de SDS-PAGE muestra bandas débiles esporádicas visibles por encima de la subunidad beta, que representan suplentes de la tocado alfa tres beta tres, dimers y oligómeros de las subunidades alfa y beta, y están desprotegidas de cualquier contaminante detectable por espectrometría de masas.Durante la realización de la extracción de cloroformo, el paso crítico del protocolo, es esencial agitar la muestra vigorosamente y proceder a la separación centrífuga de las fases orgánica y acuosa inmediatamente. Siguiendo este procedimiento, el aislado F1-ATPase se puede caracterizar en detalle por espectrometría de masas. Además, se puede utilizar en ensayos de actividad o para estudios estructurales, ya sea por sí solo o en presencia de diversos inhibidores o análogos de sustrato.

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Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

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Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

El aislamiento de los complejos de ARN-proteína afín a partir de células usando elución dirigida por oligonucleótidos

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Investigación

Bioquímica

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Un método eficiente para el aislamiento de ARN altamente purificada a partir de semillas para uso en el Análisis Cuantitativo de transcriptoma

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Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

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