Name: isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei
Uploaded: 2019-01-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Bu eser Eğitim Bakanlığı ERC CZ tarafından finanse edildi LL1205, 18-17529S, Çek Cumhuriyeti Grant ajansı hibe vermek ve Merkezi araştırma patojenitesi ve parazit (No virülans ERDF/ESF tarafından proje CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

1. arabellekleri ve çözümleri
<ol><li>Aşağıda listelenen çözümleri hazırlayın. Sıvı kromatografi için tüm arabellekleri degas. ADP, benzamidine ve proteaz inhibitörleri kullanmadan önce ekleyin.<ol>
<li>Hidroklorik asit (Tris-HCl) pH 8.0, 0.25 M sukroz, 5 mM benzamidine, 5 mM ile arabellek A: 50 mM Tris tampon aminocaproic asit (ACA) ve proteaz inhibitörleri (10 µM amastatin, 50 µM bestatin, 50 µM pepstatin, 50 µM leupeptin ve 50 µM diprotin A) hazırlayın.</li>
		<li>Arabellek B: 50 mM Tris-HCl...

<ol>
	<li>Walker, J. E., Wikstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure,+mechanism+and+regulation+of+ATP+synthases.">Structure, mechanism and regulation of ATP synthases.</a> Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).</li><li>Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+I.+Purification+and+properties+of+soluble+dinitrophenol-stimulated+adenosine+triphosphatase.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase.</a> The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).</li><li>Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation.</a> XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).</li><li>Racker, E., Horstman, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+resolution+of+the+enzymes+catalyzing+oxidative+phosphorylation.+13.+Structure+and+function+of+submitochondrial+particles+completely+resolved+with+respect+to+coupling+factor.">Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).</li><li>Senior, A. E., Brooks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+mitochondrial+oligomycin-insensitive+ATPase.+I.+An+improved+method+of+purification+and+the+behavior+of+the+enzyme+in+solutions+of+various+depolymerizing+agents.">Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).</li><li>Tzagoloff, A., Meagher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+mitochondrial+membrane+system.+V.+Properties+of+a+dispersed+preparation+of+the+rutamycin-sensitive+adenosine+triphosphatase+of+yeast+mitochondria.">Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).</li><li>Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+adenosine+triphosphatase+from+submitochondrial+particles.">A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles.</a> Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).</li><li>Tyler, D. D., Webb, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+properties+of+the+adenosine+triphosphatase+released+from+the+liver+mitochondrial+membrane+by+chloroform.">Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform.</a> Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).</li><li>Hack, E., Leaver, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alpha-subunit+of+the+maize+F1-ATPase+is+synthesised+in+the+mitochondrion.">The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion.</a> The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).</li><li>Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+F1-ATPase+from+cuckoo-pint+(Arum+maculatum)+mitochondria.+A+comparison+of+subunit+composition+with+that+of+rat+liver+F1-ATPase.">Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase.</a> Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).</li><li>Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Escherichia+coli+adenosine+triphosphatase+with+aurovertin+and+citreoviridin:+inhibition+and+fluorescence+studies.">Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies.</a> Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).</li><li>Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+at+2.8+&#197;+resolution+of+F1ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Structure at 2.8 &#197; resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).</li><li>Lutter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria.">Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).</li><li>Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+features+of+the+rotary+catalytic+mechanism+revealed+in+the+structure+of+yeast+F1-ATPase.">Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase.</a> The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).</li><li>Shirakihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+thermophilic+F1-ATPase+inhibited+by+an+epsilon-subunit:+deeper+insight+into+the+epsilon-inhibition+mechanism.">Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism.</a> The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).</li><li>Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification,+crystallization,+and+properties+of+F1-ATPase+complexes+from+the+thermoalkaliphilic+Bacillus+sp.+strain+TA2.A1.">Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1.</a> Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).</li><li>Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+thermoalkaliphilic+F1-ATPase+from+Caldalkalibacillus+thermarum.">Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).</li><li>Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+triphosphatase+from+Trypanosoma+cruzi:+purification+and+properties.">Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).</li><li>Williams, N., Frank, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+ATP+synthase+of+Trypanosoma+brucei:+isolation+and+characterization+of+the+intact+F1+moiety.">The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).</li><li>Higa, A. I., Cazzulo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mg2+-activated+adenosine+triphosphatase+from+Crithidia+fasciculata:+purification+and+inhibition+by+suramin+and+efrapeptin.">Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).</li><li>Walker, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+and+subunit+stoichiometry+of+F1-ATPase+from+bovine+mitochondria.">Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria.</a> Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).</li><li>Mueller, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ni-chelate-affinity+purification+and+crystallization+of+the+yeast+mitochondrial+F1-ATPase.">Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase.</a> Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).</li><li>Gahura, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+F1-ATPase+from+Trypanosoma+brucei+is+elaborated+by+three+copies+of+an+additional+p18-subunit.">The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit.</a> The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).</li><li>Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+synthase+from+Trypanosoma+brucei+has+an+elaborated+canonical+F1-domain+and+conventional+catalytic+sites.">ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).</li><li>Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria+from+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei.</a> Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Speijer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+respiratory+chain+from+cultured+Crithidia+fasciculata.">Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).</li><li>Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+I-complex+in+Leishmania+tarentolae+is+an+uniquely-structured+F1-ATPase.">The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).</li><li>Carbajo, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+N-terminal+domain+of+the+OSCP+subunit+of+bovine+F1Fo-ATP+synthase+interacts+with+the+N-terminal+region+of+an+alpha+subunit.">How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit.</a> Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ground+state+structure+of+F1-ATPase+from+bovine+heart+mitochondria+at+1.9+&#197;+resolution.">Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 &#197; resolution.</a> The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).</li></ol>

İletişim kuralı için F1-ATPaz arıtma T. brucei üzerinden F1yalıtım için temel alınarak daha önce yayımlanmış yöntemleri geliştirilmiştir-ATPaz kompleksleri diğer türler13,14. Yöntem herhangi bir genetik değişiklik gerektirmez (Örneğin, etiketleme) ve tüm alt mevcut ile tam etkin bir kompleks verimleri. Önemli bir adım kloroform kolaylaştırdı F1sürümüdür-ATPaz enzim membran bağl?...

F-tipi ATP synthases membran bağlı multiprotein kompleksleri arasında enerji transducing membranlar bakteri, mitokondri ve kloroplast ATP oluşumu ile bu iki proton translocation döner. Moleküler detaylarını ATP sentezi dönme mekanizması esas olarak saflaştırılmış bakteriyel ve mitokondriyal ATP synthases ve onların subcomplexes1yapısal çalışmalar nedeniyle bilinmektedir. F-tipi ATP sentaz membran içsel ve dışsal membran moieties düzenlenmiştir. F1olarak bilinen membran dışsal bölümü-ATPaz, adenozin nükleotittir (ADP) ATP veya ters tepki fosforilasyon oluştuğu üç katalitik siteleri içerir. F1-ATPaz serbest deneysel olarak membran-iç yan hidrolize ama değil sentez, ATP yeteneğini koruyarak. Fo, denilen membran bağlı sektör enzim'ın dönüşü sürücüler protein translocation aracılık eder. F1 ve Fo sektörlerde merkezi ve periferik SAP tarafından bağlanır.
İlk girişimleri F1arındırmak için-1960'larda başa mayası ve sığır kalp mitokondri tarihi ATPaz. Kullanılan bu protokollerin sonication, amonyum veya protamine sülfat yağış, ardından isteğe bağlı Kromatografi adım (lar) ve ısıl işlem2,3,4 tarafından şeker tarafından kesintiye mitokondri çıkarılan ,5,6. Arıtma büyük ölçüde geliştirilmiş ve kolayca F1bültenleri kloroform kullanılarak Basitleştirilmiş-ATPaz mitokondri zar parçaları7. Kloroform çıkarma sonra F1ayıklamak için kullanılan çeşitli hayvan, bitki ve bakteriyel kaynakları (Örneğin, fare karaciğer8, Mısır9, Arum maculatum10ve Escherichia coli - ATPases 11). Daha fazla arıtma kloroform serbest F1-ATPaz benzeşme veya boyut-dışlama Kromatografi (sn) tarafından x-ışını kristalografisi tarafından yüksek çözünürlüklü yapı belirlenmesi için uygun, bir son derece saf protein kompleksi, vermiştir olarak F1yapılar tarafından belgelenen-ATPaz sığır kalp12,13 ve Saccharomyces cerevisiae14. F1-ATPaz yapıları da yetiştirmek zor olan organizmalar tespit ve böylece, ilk biyolojik malzeme miktarını sınırlı. Bu durumda, F1-ATPaz alt birimleri yapay olarak ifade edilen ve E. colikompleksi içine monte ve bütün Contegra enzim etiketli bir alt birim benzeşme Kromatografi ile tarafından saflaştırıldı. Böyle bir yaklaşım F1belirlenmesine yol açtı-ATPaz yapıları iki termofilik bakteriyel türler, Geobacillus stearothermophilus15 ve Caldalkalibacillus thermarum16, 17. ancak, bu yöntem oldukça ökaryotik F1için uygun değildir - prokaryotik protheosynthetic aparatı, ardından işleme ve karmaşık derleme dayanan bu yana ATPases.
Kloroform tabanlı ayıklama daha önce F1ayırmak için kullanılan - ATPases tek hücreli digenetic parazitler Trypanosoma cruzi18 ve T. brucei19, Amerikan neden önemli memeli patojenlerin ve Afrika trypanosomiases, sırasıyla ve monogenic böcek parazit Crithidia fasciculata20. Bu purifications liderliğindeki F1' in sadece basit bir açıklaması için - herhangi bir aşağı akım uygulama tam bileşimi, yapısı ve karmaşık enzimatik özelliklerini tanımlamak için kullanılan bu yana ATPases,. Bu makalede, F1için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi-kültürlü böcek yaşam döngüsü sahne alanı'ndan ATPaz arınma T. brucei. Yöntem dayalı olarak kurulan iletişim kuralları yalıtım sığır ve Maya F1- ATPases21,22için geliştirilmiştir. Yordamı son derece saf ve homojen enzim vitro enzimatik ve inhibitör deneyleri için uygun detaylı proteomik karakterizasyonu kütle spektrometresi23ve yapı belirlenmesi24tarafından verir. Arıtma Protokolü ve bilgi F1-ATPaz yapısı atomik düzeyde küçük molekül inhibitörleri tanımlamak ve Afrika trypanosomiases karşı yeni ilaçların geliştirilmesi yardım ekranları tasarlamak için bir olasılık açar. Ayrıca, protokol F1arındırmak için adapte edilebilir-ATPaz üzerinden diğer organizmalar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A0948</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amastatin Hydrochloride</td>
			<td>Glantham Life Sciences</td>
			<td>GA1330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminocaproic Acid</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>ThermoFischer Scientific/Pierce</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzamidine Hydrochloride</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>199001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bestatin Hydrochloride</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>B8385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cOmplete Tablets, Mini EDTA-free</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4693159001</td>
			<td>Protease inhibitor cocktail tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td>For pH adjustment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ile-Pro-Ile</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>I9759</td>
			<td>Alias Diprotin A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leupeptin</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A</td>
			<td>Sigma Aldrich/Merck</td>
			<td>P5318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Electrophoresis System</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td>328874</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DounceTissues Homogenizer 2 mL</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Vacuum Filtration Device</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>516-7017</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q HP, 5 mL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17115401</td>
			<td>Anion exchange chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 &#956;m, diameter 47 mm</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>18406--47------N</td>
			<td>Degasing solutions for liquid chromatography</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29091596</td>
			<td>Size-exclusion chromatography column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Pure 25</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>29018224</td>
			<td>Or similar FPLC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer Shimadzu UV-1601</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td></td>
			<td>Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor</td>
			<td>Beckman Coulture</td>
			<td></td>
			<td>Or similar ultracentrifuge and rotor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000</td>
			<td>BioLogics</td>
			<td>0-127-0001</td>
			<td>Or similar ultrasonic homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of f1-atpase from the parasitic protist trypanosoma brucei

F1-ATPaz F-tipi ATP sentaz, proton sebep kuvvet biyolojik membranlar arasında adenozin trifosfat (ATP) üretmek için kullanır bir enzim bir membran dışsal katalitik subcomplex olduğunu. Yalıtım bozulmadan F1-yerli kaynağından ATPaz enzim protein kompozisyon, kinetik parametrelerin ve inhibitörleri duyarlılık karakterize etmek için önemli bir önkoşul olduğunu. Son derece saf ve homojen F1-ATPaz ATP sentezi ve hidroliz moleküler mekanizmaları içgörü sağlamak yapısal çalışmalar için kullanılır. Bu makalede, F1arıtma için bir yordam açıklanır-ATPaz Trypanosoma brucei, Afrika trypanosomiases hastalığının üzerinden. F1-ATPaz kültürlü vitro Tripanozomlar üzerinden hipotonik lizis tarafından elde edilen mitokondrial veziküller yalıtılmış. Veziküller mekanik sonication ve F1tarafından parçalanmış-ATPaz kloroform çıkarma tarafından iç mitokondri zar--dan serbest bırakmak. Enzimatik karmaşık daha fazla ardışık anyon exchange ve boyutu-dışlama Kromatografi tarafından saf. Hassas kütle spektrometresi teknikleri arıtılmış karmaşık hemen hemen herhangi bir protein kirletici yoksun olduğunu ve bu nedenle, uygun malzeme yapı tayini için x-ışını kristalografisi veya cryo-elektron mikroskobu tarafından temsil eder, gösterdi. İzole F1-ATPaz sergileyen tamamen sodyum azid, güçlü inhibitörü olan F-tipi ATP synthases tarafından inhibe olabilir ATP hydrolytic etkinlik. Arıtılmış karmaşık oda sıcaklığında en az üç gün istikrarlı ve etkin kalır. Yağış amonyum sülfat tarafından uzun süreli depolama için kullanılır. Benzer yordamlar F1arıtma için kullanılan memeli ve bitki dokularında, Maya veya bakteri - ATPases. Böylece, sunulan Protokolü F1için bir kılavuz olarak hizmet verebilir-ATPaz izolasyon diğer organizmalar.

T. brucei hücreleri25 standardında kültürlü mitokondrial veziküller (mitoplasts) üzerinde 2 x 1011 procyclic hypotonically lysed 1 x 1011 Percoll degradeye izole tipik arıtma (Şekil 1) başlar glikoz zengini SDM-79 Orta27. Mitoplasts döndü, sonication tarafından parçalanmış ve matris içeren süpernatant atılır. Mitokondrial membranlar F1serbest bırakma...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei at JoVE.com

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Bu iletişim kuralı F1arıtma açıklar-ATPaz Trypanosoma bruceikültürlü böcek sahneden. Yordamı son derece saf, homojen ve aktif karmaşık yapısal ve enzimatik araştırmaları için uygun verir.

Yalıtım F1-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

F1-ATPase is a membrane-extrinsic catalytic subcomplex of F-type ATP synthase, an enzyme that uses the proton motive force across biological membranes to ...

F1-ATPe'nin saflaştırılması, ATP üretiminin mekanizmasını diğer ATP sintraşları tarafından anlamamız açısından çok önemli olduğunu kanıtlayan klasik biyokimyasal yöntemlere dayanmaktadır. Bu tekniğin en büyük avantajı, X-ışını kristalografisi veya kriyo-elektron mikroskobu ile yapı tayini için uygun son derece saf bir enzim üretmesidir. Bu protokol, F1-ATPaz'ın tripatozomlardan izole edilmesi için optimize edilmiş olsa da, doku veya kültür hücreleri gibi diğer kaynaklara ve çeşitli patojenik protistlere uyarlanabilir.Bu teknik, ağır insan hastalıklarının tedavisinde yeni ilaçların belirlenmesine yol açabilir. Örneğin, Mycobacterium tuberculosis F-ATPase tüberküloz tedavisi için doğrulanmış bir ilaç hedefidir. Protokolü başlatmak için, çözülme ve yavaşça mitokondriyal veziküller, ayrıca mitoplastlar olarak bilinen, daha önce hipotonik lysis tarafından bir kez izole 10 için 11-2 kez 10 prosiklik Trypanosoma brucei 11 hücreleri buz gibi soğuk Buffer A.Keep örnek soğutulmuş beş mililitre.Daha sonra, bicinchoninic asit tarafından süspansiyon protein konsantrasyonu belirlemek, veya BCA, üreticinin talimatlarına göre protein tsay. Standart eğriyi oluşturmak için ultra saf suda BSA seyreltme serisi gerçekleştirin. BSA standartlarına uyacak şekilde numunenin küçük bir kısmını ultra saf suyla 20 ila 100 kez seyreltin.Örnekteki toplam protein miktarı hesaplandıktan sonra, protein konsantrasyonunu ek Tampon A ile seyrelterek mililitre başına 16 miligrama getirin.Sonra mitoplastları ters veziküller ve membran parçalarına yedi kez sonication ile 15 saniye, toplam enerji ile 70 ila 100 joules impuls başına 3,9 milimetre çapında bir mikro ucu ile. Parçalama sırasında, impulslar arasında 30 saniye boyunca buz üzerinde örnek kuluçka. Sonication sonra, süspansiyon biraz daha koyu görünebilir.Membran parçalarını ultrasantrifüj ile 16 saat veya 98,000 g'da ultrasantrifüj ile dört santigrat derecede beş saat boyunca tortulayın. Supernatant decant ve kloroform ekstraksiyon ile devam edin. Kullanılan Arabellek A'nın toplam miktarını temel alarak Arabellek B'nin hacmini hesaplayın.Donmuş tortuyu santrifüj tüpünden homogenizer aktarın. Küçük bir Dounce homogenizer yardımı ile Tampon B mitokondriyal membranların pelet resuspend. Süspansiyonu 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Numuneyi buzdan çıkarın ve kalan adımlar için numuneyi ve tüm çözümleri oda sıcaklığında tutun. Sonra pCl 8.5, bire bir HCl ile ayarlanmış iki azı tris ile doymuş kloroform ekleyin. Kapağı sıkıca kapatın ve numuneyi tam olarak 20 saniye boyunca şiddetle sallayın.Hemen oda sıcaklığında beş dakika boyunca 8, 400 g karışımı santrifüj. Daha sonra, üst, bulutlu sulu faz 1.6 mililitre mikrotüpler aktarın. Kloroform tedavisi ile çıkarılan inhibitörleri değiştirmek için numuneye proteaz inhibitörleri ekleyin.Numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 13,000 g'da santrifüj edin. Döndürmeden sonra, supernatant'ı taze mikrotüplere aktarın ve kalan çözünmez maddeleri çıkarmak için santrifüjünü tekrarlayın. Hızlı protein sıvı kromatografi sistemine bağlı beş mililitrelik anion değişimi Q sütununu dakikada beş mililitre likit bir akış hızıyla 280 nanometrede absorbans ve iletkenlik stabilize edene kadar dengeleyin.Süpernatant'ı, dengelendirilen kolona dakikada bir mililitre lik bir akış hızıyla yükleyin. 280 nanometredeki emicilik arka planda stabilize olana kadar bekleyin. Q sütun elüsyon arabelleği 25 mililitre doğrusal gradyan uygulayın 0,5 mililitre lik bir akış hızıyla %0'dan %100'e kadar ve bir mililitre kesir toplayın.PH 8.0'daki Pullman ATPase tsay'ın mililitre reaksiyon karışımında atp hidrolitik aktivitesi için ana elüsyon zirvesine karşılık gelen her bir fraksiyonun 10 mikrolitresini titretin. ATPaz aktivitesi sergileyen kesirleri birleştirin. 100,000 moleküler ağırlık kesme PES filtre ile 200-500 mikrolitre bir spin sütun kullanarak membran ultrafiltrasyon tarafından havuzlu örnek konsantre.Daha sonra boyut dışlama kromatografisine devam edin. Dakikada 0,5 mililitre likit bir akış hızıyla en az 48 mililitre SEC tamponu içeren sıvı kromatografi sistemine bağlı Superose 6 Artış sütununa dengeleyin. Örneği sütuna uygulayın.0,25 mililitre fraksiyonları toplarken, dakikada 0,25 mililitre lik bir akış hızında kromatografi çalıştırın. Daha sonra, SDS-PAGE'deki UV 280 nanometre emici izinin doruklarına karşılık gelen kesirlerin 10 mikrolitresini çalıştırın. Sonra coomassie mavi ile örnekleri leke.Pullman ATPase tsay ile ATP hidrolitik aktivitesi ve azit duyarlılığı için F1 tepesini içeren ilk büyük tepeye karşılık gelen kesirleri teşp edin. Sonra protein konsantrasyonu belirlemek için bir BCA tayini gerçekleştirin. Son olarak, saflaştırılmış F1-ATPaz'ı oda sıcaklığında tutun ve aşağı akım uygulamaları için saflaştırmadan sonraki üç gün içinde kullanın.Bir anion değişimi kromatografisinin bu elüsyon profili UV emiciliğini 280 nanometre de gösterir ve elüsyon tamponundaki sodyum klorür konsantrasyonunu gösterir. Seçilen kesirler SDS-PAGE jel üzerinde ayrılmış ve Coomassie Mavi boya ile boyanmış. Aniyon değişim kromatografisinden kaynaklanan ve F1-ATPe içeren majör elüsyon zirvesine karşılık gelen kesirler biraraya getirilmiş, konsantre edilmiş ve boyut dışlama kromatografisi için giriş olarak kullanılmıştır.En büyük kirletici dihidrolipoyl dehidrogenazdır, bu da ayrık bir tepe olarak boyut dışlama kromatografisi sütunundan uzaktır. F1-ATPe ilk baskın, büyük ölçüde simetrik tepe de eutes. Saflaştırılmış F1-ATPaz'ın SDS-PAGE ile ayrılmasından sonra tipik bir bant deseninin Coomassie Blue boyaması, alfa üç beta üç başlık, dimers ve alfa ve beta alt birimlerinin alt komplekslerini temsil eden ve kütle spektrometresi ile tespit edilebilen kirleticilerden yoksun olan beta alt biriminin üzerinde görülen düzensiz zayıf bantları gösterir.Protokolün kritik adımı olan kloroform ekstraksiyonu gerçekleştirirken, numuneyi şiddetle sallamak ve organik ve sulu fazların santrifüj ayrımına hemen devam etmek esastır. Bu işlemden sonra izole F1-ATPaz kütle spektrometresi ile ayrıntılı olarak karakterize edilebilir. Ayrıca, aktivite tahlillerinde veya yapısal çalışmalarda, kendi başına veya çeşitli inhibitörlerin veya substrat analoglarının varlığında kullanılabilir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Isolation of F1-ATPase from the Parasitic Protist Trypanosoma brucei

Unit 1

Membrane Transport and Active Transporters

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

Hızlı izole edilmesi HEK hücrelerden Mitoribosome

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver

Karaciğerden Doku Ekstrasellüler İzoles İzolasyon

Extracellular vesicles (EVs) can be released from many different cell types and detected in most, if not all, body fluids. EVs can participate in ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Membran fosfolipidler içine bakteriyel patojen yağ asidi kuruluş çalışması için tavuk yumurtası sarısı lipoprotein parçacıklarının yalıtım

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Ready-To-Use qPCR for Detection of DNA from Trypanosoma cruzi or Other Pathogenic Organisms

Trypanosoma cruzi veya Diğer Patojenik Organizmalardan DNA Tespiti için Kullanıma Hazır qPCR

Real-time PCR (qPCR) is a remarkably sensitive and precise technique&#160;that allows for amplifying&#160;minute amounts of nucleic acid targets from a ...