Name: cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU at JoVE.com

ونحن ممتنون لمركز الأسهم كولاي على MG1693؛ وورمباسي؛ مركز علم الوراثة كاينورهابديتيس الذي تموله الوطنية معاهد للصحة للبحوث البنية التحتية برامج Office (P40OD010440) لسلالات؛ بينكوس زاك للمشورة الإحصائية؛ قد فنغ للمواد الكيميائية؛ لوك شنايدر وشارف أندريا سانديب كومار برينر جون للتدريب والمشورة، والدعم، ومناقشة مفيدة؛ ومختبرات كورنفيلد و Schedl لردود الفعل على هذه المخطوطة. هذا العمل كان تدعمها جزئيا في "المعاهد الوطنية للصحة" [R01 AG02656106A1 إلى، GM100756 R01 للملخص] وزمالة "مؤسسة العلوم الوطنية" بريدوكتورال [دج-1143954 و 1745038 تأيين لصنع]. المعاهد الوطنية للصحة ومؤسسة العلوم الوطنية لا بأي دور في تصميم الدراسة، وجمع وتحليل وتفسير البيانات، ولا في كتابة المخطوطة.

1-إعداد البكتيريا المسماة إيدو
<ol><li>
تنمو ثقافة كاتب MG1693. الإشريكيّة القولونية MG1693 (كولاي) يحمل طفرة في ثيا.
	<ol>
<li>الانتصارات خارج MG1693 كولاي من مخزون والغليسيرول مجمدة على أجار مرق (رطل) ليسوجيني 120 مم طبق بيتري. الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
		<li>تلقيح من ك...

<ol>
	<li>Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+and+CDK-2+regulate+proliferative+cell+fate+and+cell+cycle+progression+in+the+C.+elegans+germline.">Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline.</a> Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).</li><li>Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analyses+of+the+mitotic+region+in+the+Caenorhabditis+elegans+adult+germ+line.">Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line.</a> Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).</li><li>Seidel, H. S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+quiescence+maintains+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cells+independent+of+GLP-1/Notch.">Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li><li>Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+accumulation+of+the+proliferating+cell+nuclear+antigen+PCN-1+transitions+from+continuous+in+the+adult+germline+to+intermittent+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Cell+Cycle+Analysis.">elegans Cell Cycle Analysis.</a> Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).</li><li>ThermoFisher. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).</li><li>Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+reproductive+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hansen, D., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferation+versus+meiotic+fate+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+of+S+phases,+X+chromosome+replication,+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line.">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li><li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans.">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li><li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline.">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).</li><li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li><li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., M&#252; Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3,+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation.">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes &amp; development. 13 (17), 2258-2270 (1999).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crawley, O., Barroso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin-interacting+protein+WAPL-1+regulates+meiotic+chromosome+structure+and+cohesion+by+antagonizing+specific+cohesin+complexes.">Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes.</a> eLife. 5 (2), 1-26 (2016).</li><li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling,+impairment+of+cell+cycle+progression,+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+incorporated+into+DNA.">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK.</a> in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).</li><li>Vos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De Cell Counter Plugin. , (2015).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (2016).</li><li>Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+promotes+germline+proliferation+in+C.+elegans.">Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans.</a> Development. 137 (4), 671-680 (2010).</li><li>Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-autonomous+DAF-16/FOXO+activity+antagonizes+age-related+loss+of+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).</li><li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFB+and+Insulin+Signaling+Regulate+Reproductive+Aging+via+Oocyte+and+Germline+Quality+Maintenance.">TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance.</a> Cell. 143 (2), 299-312 (2010).</li><li>Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-18/PTEN+locally+antagonizes+insulin+signalling+to+couple+germline+stem+cell+proliferation+to+oocyte+needs+in+C.+elegans.">daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans.</a> Development. , 4230-4241 (2015).</li><li>Cinquin, A., Chiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+Stem+Cell+Cycling+Balances+Self-Renewal+and.">Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and.</a> Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).</li><li>Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+Detection+of+Two+Thymidine+Analogues+(CldU+and+IdU)+in+Primary+Tissue.">Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).</li></ol>

إعداد البكتيريا المسماة إيدو (الخطوة 1) أمر حاسم لهذا البروتوكول، والنقطة الأولى لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. الشباب المنحرفين الكبار البرية من نوع التسمية جداً موثوق في ح 4 نبض إيدو، مما يجعل هذا عنصر تحكم مفيدة لكل دفعة جديدة من البكتيريا المسماة إيدو. بالإضافة إلى ذلك، سوف تسمية مع الكيمي...

في مجال التنمية الحيوانية، ملزمون بمئات الآلاف، والملايين، المليارات أو حتى تريليونات من انقسامات الخلية شكل الكائن الحي الكبار. دورة الخلية، تتكون مجموعة الأحداث الخلوية من G1 (الفجوة)، S (توليف)، G2 (الفجوة)، وتعريف M (الانقسام) السلسلة من الأحداث التي يتم تنفيذها كل انقسام الخلية. دورة الخلية من دينامية وتقدير أفضل في الوقت الحقيقي، الذي يمكن أن يكون صعباً من الناحية التقنية. تسمح التقنيات المعروضة في هذا البروتوكول بإجراء قياسات المراحل وتوقيت دورة الخلية من الصور لا تزال.
وضع العلامات مع النظير نوكليوزيد مثل 5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني (إيدو) أو 5-برومو-2'--ديوكسيوريديني (بردو) هو معيار الذهب لتحديد مرحلة ثانية في الدراسات المتعلقة بديناميات دورة الخلية في الكبار ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) خنثي germline1،2،3،،من45. إيدو وبردو يمكن استخدامها في أي ما يقرب من الخلفية الوراثية، كما أنها لا تعتمد على أي التركيب الوراثي. تصور بردو يتطلب المعالجة الكيميائية قاسية للكشف عن المستضد لجسم بردو مكافحة تلطيخ، الذي غالباً ما يكون غير متوافق مع تقييم علامات خلوية أخرى تصور تلطيخ يشترك مع الأجسام المضادة إضافية. على النقيض من ذلك، تصور إيدو يحدث عن طريق الكيمياء فوق تحت ظروف معتدلة وهكذا متوافق مع جسم تلطيخ شارك6،7.
خصوصية التسمية من الواضح منذ فقط دمج نويات النظير (5-اثينيل-2 '--ديوكسيوريديني) thymidine في الحمض النووي خلال المرحلة S. التصور يأخذ مكان في الأنسجة الثابتة. التسمية إيدو غير مرئي بنفسها حتى صبغة المحتوية على أزيد أو fluorophore يتفاعل تساهمي مع ألكاين في إيدو التي حفزت النحاس فوق الكيمياء8. وسم إيدو يمكن توفير المعلومات الفورية التي نواة في المرحلة S، استخدام نبضة قصيرة من وضع العلامات. إيدو يمكن أيضا تقديم معلومات حيوية، استخدام نبض--تشيس أو وسم المستمر؛ على سبيل المثال، في تجربة نبض--تشيس، التسمية هو المخفف في كل انقسام الخلية أو نشر نونديفيدينج كما تقدم الخلايا عن طريق التنمية.
Germline خنثي C. ايليجانس نظام نموذجي قوية للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية. Germline الكبار خط تجميع استقطاب مع الخلايا الجذعية التي وجدت في نهاية القاصي متبوعاً بالدخول والتقدم من خلال هو الطور الأول، بالتنسيق مع مراحل للجاميطات أكثر بروكسيمالي (الشكل 1). في نهاية الدانية، بويضات ناضجة وهي أوفولاتيد والمخصبة وتبدأ امبريوجينيسيس في الرحم9،،من1011. تسمى منطقة طويلة ~ 20 الخلية قطرها قرب الخلية الحافة البعيدة، التي تشمل الجذعية germline ركوب ميتوتيكالي، وخلايا السلف وهو S-مرحلة الخلايا لكن لا الخلايا في الطور الأول هو،2،منطقة السلف4 , 9 , 12-توفير أغشية الخلية فصل غير كامل بين الأنوية في germline القاصي، ولكن الخلايا منطقة السلف الخضوع للخلية الانقسامية ركوب الدراجات بشكل مستقل إلى حد كبير. مدة دورة الخلية الانقسامية متوسط الخلايا منطقة السلف germline في الشباب المنحرفين الكبار ح ~6.5؛ المرحلة G1 مختصر أو غائبا، ولا يحترم التتابع1،2،13. يحدث من خلال التمايز المباشر أساسا تمايز الخلايا الجذعية Germline ومما يفتقر إلى تضخيم عبور الشعب4. خلال التمايز في مرحلة باتشيتيني، حوالي 4 من أصل 5 نويات لن يشكل بويضات لكن بدلاً من الخضوع للمبرمج، بوصفها ممرضة الخلايا عن طريق التبرع بمحتوياتها هيولى إلى12،البويضات النامية14 , 15.
بالإضافة إلى وضع العلامات من الخلايا في مرحلة ثانية مع النظير نوكليوزيد، واحد تحدد الخلايا في الانقسام والانقسام الاختزالي استخدام تلطيخ جسم. نوى في الانقسام يتم إيمونوريكتيفي لمكافحة--والرمات--هيستون H3 (Ser10) جسم (تسمى pH3)7،16. نوى في الانقسام الاختزالي إيمونوريكتيفي إلى جسم المناهضة له-3 (بروتين كروموسوم هو محور)17. يمكن التعرف على النوى في منطقة السلف بغياب سموه-3، ووجود نوكليوبلاسميك REC-818، أو وجود وابل-119. كثافة وابل-1 أعلى في الغدد التناسلية الجسدية، عالية في المنطقة، والسلف ومنخفضة خلال وقت مبكر بروفاسيس هو19. عدة دورة الخلية القياسات الممكنة مع عدد قليل من الاختلافات في البروتوكول: أنا) تحديد الأنوية في مرحلة ثانية، وقياس مؤشر S-المرحلة؛ ثانيا) تحديد الأنوية في مرحلة م وقياس مؤشر المرحلة م؛ ثالثا) تحديد ما إذا كانت نواة الانقسامية أو هو S-المرحلة؛ رابعا) قياس مدة G2؛ V) قياس دوارتيون G2 + M + G1 المراحل؛ سادسا) قياس معدل دخول هو؛ سابعا) تقدير معدل التقدم هو.
يمكن للمرء أن قياسات دورة الخلية متعددة من أنواع قليلة من تجارب مختبر الرطب. البروتوكول أدناه وصف نبض 30 دقيقة وسم بتغذية C. ايليجانس الكبار المنحرفين مع إيدو المسماة البكتيريا وشارك التوسيم م-مرحلة الخلايا تلطيخ الخلايا المنطقة مع الأجسام المضادة-pH3، والسلف تلطيخ مع الأجسام المضادة-وابل-1. التغييرات فقط في فترة إيدو آر (الخطوة 2، 5)، نوع من الأجسام المضادة المستخدمة (الخطوة 5)، وتحليلات (الخطوة 8.3) المطلوبة للقياسات الإضافية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1019px;" width="1020">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td >E. coli MG1693</td>
			<td style="width:255px;">Coli Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:255px;">6411</td>
			<td style="width:255px;">grows fine in standard unsupplemented LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:255px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:255px;">OP50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C10337</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">900584-50MG</td>
			<td style="width:255px;">or use EdU provided in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glucose</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">D9434-500G</td>
			<td style="width:255px;">D-(+)-Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thiamine (Vitamin B1)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T4625-5G</td>
			<td style="width:255px;">Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thymidine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T1895-1G</td>
			<td style="width:255px;">BioReagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1880-1KG</td>
			<td style="width:255px;">MgSO4, Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:255px;">BP332-500G</td>
			<td style="width:255px;">Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P5379-500G</td>
			<td style="width:255px;">KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">A4514-500G</td>
			<td style="width:255px;">NH4Cl, Reagent Plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:255px;">US Biological</td>
			<td style="width:255px;">C13071058</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C3881-500G</td>
			<td style="width:255px;">CaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LB Broth (Miller)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L3522-1KG</td>
			<td style="width:255px;">Used at 25g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Levamisole</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L9756-5G</td>
			<td style="width:255px;">0.241g/10ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:255px;">Calbiochem Omnipur</td>
			<td style="width:255px;">6506</td>
			<td style="width:255px;">homemade PBS works just as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P1379-500ML</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules</td>
			<td style="width:255px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:255px;">15710</td>
			<td style="width:255px;">10ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">100% methanol</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">A454-1L</td>
			<td style="width:255px;">Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:255px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">16210-072</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1671330</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">rabbit-anti-WAPL-1</td>
			<td style="width:255px;">Novus biologicals</td>
			<td style="width:255px;">49300002</td>
			<td style="width:255px;">Lot G3048-179A02, used at 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">mouse-anti-pH3 clone 3H10</td>
			<td style="width:255px;">Millipore</td>
			<td style="width:255px;">05-806</td>
			<td style="width:255px;">Lot#2680533, used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A11012</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1256147, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A21236</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1511347, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">Vectashield antifade mounting medium containing 4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:255px;">H-1200</td>
			<td style="width:255px;">mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">nail polish</td>
			<td style="width:255px;">Wet n Wild</td>
			<td style="width:255px;">DTC450B</td>
			<td style="width:255px;">any clear nail polish should work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">S-medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">M9 agar</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nematode Growth Medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">dissecting watch glass</td>
			<td style="width:255px;">Carolina Biological</td>
			<td style="width:255px;">42300</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm laboratory film</td>
			<td style="width:255px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:255px;">PM-996</td>
			<td style="width:255px;">4 inch wide laboratory film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">petri dishes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Long glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:255px;">MidSci Avant</td>
			<td style="width:255px;">2926</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tips</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">500 mL Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">25G 5/8&#8221; needles</td>
			<td style="width:255px;">BD PrecisionGlide&#160;</td>
			<td style="width:255px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5ml glass centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Pyrex&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Borosilicate glass tubes 1ml</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">glass slides</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">no 1 coverslips 22 x 40 mm</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">no 1.5 may work, also</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">37 &#176;C Shaker incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clinical Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;">IEC</td>
			<td style="width:255px;">428</td>
			<td style="width:255px;">with 6 swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">20 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:255px;">4 &#176;C refrigerator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">-20 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Observer Z1 microscope</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Ultraview Vox spinning disc confocal system</td>
			<td style="width:255px;">PerkinElmer&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu

وكثيراً ما يستخدم تحليل دورة الخلية في حقيقيات النوى مورفولوجيا كروموسوم والتعبير و/أو الترجمة من منتجات الجينات المطلوبة لمختلف مراحل دورة الخلية، أو الإدماج من النظير نوكليوزيد. خلال المرحلة S، دمج بولمرس الحمض النووي النظير thymidine مثل إيدو أو بردو الصبغية الحمض النووي، وتمييز الخلايا لتحليلها. C. ايليجانس، نوكليوزيد إيدو التناظرية يتغذى على الديدان خلال الثقافة العادية ومتوافق مع تقنيات إيمونوفلوريسسينت. الفعل من C. ايليجانس نظام نموذج قوي للدراسات يشير إلى مسارات، والخلايا الجذعية، والانقسام، ودورة الخلية لأنها شفافة وسهلة وراثيا، وهو الطور الأول والتمايز الخلوي/الجاميطات التي تحدث في خطي الجمعية مثل الأزياء. هذه الميزات تجعل إيدو أداة عظيمة لدراسة الجوانب الحيوية للخلايا ركوب ميتوتيكالي والتنمية germline. هذا البروتوكول توضح كيفية إعداد البكتيريا إيدو بنجاح، وإطعامهم إلى البرية من نوع C. ايليجانس المنحرفين، تشريح الغدد التناسلية خنثي، ووصمة عار لإدماج إيدو في الحمض النووي، وصمة عار مع الأجسام المضادة للكشف عن مختلف دورة الخلية و صورة الغدد التناسلية علامات التنموية، وتحليل النتائج. البروتوكول توضح الاختلافات في الأسلوب والتحليل لقياس S-المرحلة مؤشر م-المرحلة الفهرس G2 المدة، مدة دورة الخلية، ومعدل الدخول هو، ومعدل تطور الطور الأول هو. هذا الأسلوب يمكن أن تتكيف مع دراسة دورة الخلية أو التاريخ الخلية في الأنسجة ومراحل والخلفيات الوراثية والظروف الفسيولوجية الأخرى.

حيث يلزم تركيب الدنا أن تدمج إيدو، يسع المرء أن يستنتج أن أنوية المسمى إيدو خضع S-المرحلة خلال الإطار الزمني وسم إيدو. واحد قد تفسر الأنوية هذه التسمية في 30 دقيقة تغذية مع إيدو المسماة البكتيريا كنواة في مرحلة ثانية في وقت تشريح. نوى أن التسمية في إيدو مستمر تعد تغذية التجر...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU at JoVE.com

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

يتم وصف أسلوب التصوير القائم التي يمكن استخدامها لتحديد المرحلة S وتحليل ديناميات دورة الخلية في germline خنثي C. ايليجانس استخدام thymidine في إيدو التناظرية. هذا الأسلوب يتطلب لا المتسلسلات ومتوافق مع صبغة إيمونوفلوريسسينت.

تحليل دورة الخلية في Germline C. ايليجانس مع إيدو التناظرية Thymidine

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول دورة الخلية وديناميات مجموعات الخلايا الجذعية الخط الجرثومي في C.elegans. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب transgenes ، فهي متوافقة مع التلطيخ المناعي ، ويمكن تعديلها لدراسة الخلايا في ظل ظروف مختلفة كثيرة. كنت متحمسا جدا عندما رأيت لأول مرة هذه الطريقة المستخدمة في مختبر Scheda.على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في دورة الخلية C.elegans، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على أسئلة أوسع حول الشيخوخة، والتغذية، أو تغيير الأنماط الجينية. عموما مختبرات جديدة لهذه الطريقة قد النضال مع التعابير الأولية أو C.elegans تلطيخ الدم. تبدأ باستخدام تقنية معقم لإضافة 200 ميكرولتر من 10 ملليمولار EdU في 100 ملليلتر من M9 العازلة والمكملات المناسبة لأربعة ملليلتر من المزروعة حديثا بين عشية وضحاها MG 1693 E.coli الثقافة.جعل الوديه يتطلب توازن دقيق بين EdU والتكملة ثيميدين. كما يجب أن تكون كمية من thymidine كافية لE القولونية لتنمو بشكل جيد، في حين أن كمية EdU يجب أن تكون كافية لدرع قوية ضد التسوية. بعد ما لا يزيد عن 24 ساعة في 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة، واستخدام تقنية معقمة لتقسيم الثقافة بين اثنين إلى أربعة أنابيب مخروطية 50 ملليلتر معقم للطرد المركزي.Resuspend بيلاتين أربعة ملليلتر من M9 العازلة الطازجة واستخدام نفس الماصة لتطبيق حوالي 8 قطرات من EdU المسمى E كولي MG1693 حل إلى مركز درجة حرارة الغرفة الفردية 60 ملليلتر M9 A حارس بتري الأطباق. لتغذية EdU البكتيريا المسماة إلى الديدان الخيطية، واستخدام برنامج تلفزيوني جديد لغسل C.Elegans من طبق متوسط نمو الخيطيات في أنبوب 1.5 ملليلتر والسماح للحيوانات لتسوية لفترة وجيزة عن طريق الجاذبية. غسل الحيوانات مرة واحدة إلى مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني واستخدام ماصة البسترة الزجاج لنقل الديدان الخيطية إلى وسط حديقة EdU في قطرة صغيرة من برنامج تلفزيوني.انتظر بضع دقائق حتى يتم امتصاص السائل واحتضان الثقافة لمدة 30 دقيقة على الأقل عند 20 درجة مئوية وفقًا للبروتوكول التجريبي. في نهاية الحضانة، استخدم ميليتين من برنامج تلفزيوني لطرد الديدان من لوحة ثقافة EdU في طبق تشريح الزجاج. بعد تشريح و تثبيت الشناء الخيطية كما سبق وصفها، شطف أنبوب زجاجي بوروسيليكات ملليلتر صغير وماصة طويلة من الزجاج البسترة مع PBS تكملها 0.1٪ توين 20 واستخدام ماصة لنقل السنادات الثابتة إلى الأنبوب في كمية صغيرة من توين برنامج تلفزيوني.جمع الغنود عن طريق الطرد المركزي واستخدام طويلة، رسمها من المرعى الزجاج ماصة لإزالة أكبر قدر ممكن من الخارقة دون إزعاج بيليه الغنود. للكشف EdU، إضافة 100 microLiters من فوق كوكتيل EdU إلى ال غونادس وتغطية أنبوب مع فيلم المختبر لاحتضان 30 إلى 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، وغسل الغدد الغدد الغدد الصوابع مرة واحدة مع 100 microLiters من رد فعل شطف العازلة، وأربع مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني توين.بعد الغسيل الأخير، إضافة 25 microLiters من مضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة تستكمل مع DAPI إلى العينة. في حين أن المتوسطة تستقر على الرناد، ضع لوحة كبيرة 2.5٪agarose على شريحة مجهر زجاجي قياسية. ثم تسطيح مع شريحة ثانية.بعد ذلك، استخدم ماصة طويلة من الزجاج البسترة والحفاظ على كل من السائل والسناد في الطرف الضيق من الماصات لتقليل فقدان العينة عند نقل ال غونا إلى لوحة. باستخدام رمش ملتصق بواكة المسواك، قم بتوزيع السنادس على وسادة أغاروز وإزالة أي جزيئات الغبار. ثم خفض ببطء غطاء زجاجي مستطيل زلة على الشنطة، مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء، وإزالة أي حل الزائدة مع نسيج المختبر.عد الخلايا في ثلاثة أبعاد يأخذ بعض الممارسة بشكل موثوق. استخدام فيجي خلية العداد في المكونات وسيناريو مثل علامات الخلايا لإزالة أي مكررة يساعد على جعل التهم استنساخها. بعد السماح للغطاء زلة لتسوية بين عشية وضحاها، واستخدام الخلية عداد المكونات في وفيجي لحساب يدويا كل نواة، ووضع العلامات على كل نواة الفردية وفقا لوجود أو غياب phosphohistone ثلاثة EdU أو pregenetor تسمية خلية المنطقة.إشارة EdU تشارك في الترجمة مع إشارة DAPI. في بعض النوى، تغطي إشارة EdU جميع الكروموسومات، بينما في النوى الأخرى، تُترجم إشارة EdU إلى واحد إلى اثنين من البانكتا الساطعة، على الأرجح على الكروموسوم X، الذي يتكرر في وقت متأخر من مرحلة S. إشارة EdU من 30 دقيقة ناجحة وضع العلامات المترجمة إلى ما يقرب من نصف النوى في منطقة pregenetor.في حين أن هذه التقنية تعمل باستمرار في أنواع الحيوانات البرية الشباب الكبار، جزء كبير من تزاوج 5 أيام hermaphrodites القديمة فشل في تسمية في نبض EdU 30 دقيقة. ويمكن تقدير مدة G2 من خلال تحليل النسبة المئوية للنيات في المرحلة M التي هي إيجابية EdU على مدار الوقت، مما يسمح بحساب متوسط والحد الأقصى للمدة G2. ويمكن تقدير مدة G2 وG1 من النسبة المئوية لجميع نوى المنطقة قبلية التي هي إيجابية EdU، مما يسمح بحساب الحد الأقصى للمدة من المراحل مجتمعة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر استخدام نفس الدفعة من أطباق EdU لتقليل التباين بين التجارب.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التلطيخ بالأجسام المضادة الإضافية أو الإجابة على أسئلة إضافية حول دورة الخلية أو مصير الخلية أو مسارات الإشارة. لا ننسى أن العمل مع النظير مبيدات النوى و parafermeldahyde يمكن أن تكون خطرة، وأن الاحتياطات، مثل ارتداء قفازات النيترول، ينبغي دائما أن تتخذ أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

تقييم شامل من سلالة الجرثومية الكيماوية السمية باستخدام نيماتودا<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

التصور من خلية غضروفية بيوم إضافي والاتجاه انتشار عبر Zebrabow تحليل الخلية نسيلي في الغضروف والجنينية ميكل

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; الخط الجرثومي

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

الأمعاء C. ايليجانس "كنموذج" ل Morphogenesis التجويف بين الخلايا و في فيفو الاستقطاب نشوء غشاء حيوي على مستوى الخلايا المفردة: وضع العلامات تلطيخ جسم والخسارة [رني] من وظيفة تحليل وتصوير

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

خلية "التجميع فحوصات" لتقييم ربط الشق المورفولوجية مع ترانس-يغاندس وتثبيط عن طريق رابطة الدول المستقلة-يغاندس

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

التقديم ثلاثي الأبعاد وتحليل إيمونولابيليد، أوضح البشري شبكات الأوعية الدموية فيلوس المشيمية

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...