Name: cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU at JoVE.com

Wir sind dankbar für die E. Coli Lager Zentrum für MG1693; Wormbase; die Caenorhabditis Genetik Center das von der nationalen Institute der Gesundheit der Forschung Infrastruktur Büroprogramme (P40OD010440) für Stämme gefördert wird; Zach Pincus für statistische Beratung; Aiping Feng für Reagenzien; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar und John Brenner für Schulung, Beratung, Unterstützung und hilfreiche Diskussion; und das Kornfeld und Schedl Labs für Feedback zu dieser Handschrift. Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health unterstützt [R01 AG02656106A1, KK, R01 GM100756 TS] und National Science Foundation predoctoral Fellow [DGE-1143954 und DGE-1745038, ZK]. Weder die National Institutes of Health als auch der National Science Foundation hatte keine Rolle bei der Gestaltung der Studie, Erhebung, Analyse und Interpretation der Daten, noch schriftlich das Manuskript.

1. Vorbereitung der EdU-Label Bakterien
<ol><li>
Wachsen Sie eine Starterkultur von MG1693. Escherichia coli (E. Coli) MG1693 trägt eine Mutation im ThyA.
	<ol>
<li>Streifen aus E. Coli MG1693 aus einem gefrorenen Glycerin bestand auf einem 120 mm Lysogeny Brühe (LB) Agar Petrischale. Kultur bei 37 ° C über Nacht.</li>
		<li>Impfen aus zwei einzelnen E. Coli MG1693 Kolonien in zwei doppelte 4 mL-Tuben der Flüssigkultur lb bei 37 ° C für ~ 16 h. Hinweis: MG1...

<ol>
	<li>Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+and+CDK-2+regulate+proliferative+cell+fate+and+cell+cycle+progression+in+the+C.+elegans+germline.">Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline.</a> Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).</li><li>Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analyses+of+the+mitotic+region+in+the+Caenorhabditis+elegans+adult+germ+line.">Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line.</a> Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).</li><li>Seidel, H. S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+quiescence+maintains+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cells+independent+of+GLP-1/Notch.">Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li><li>Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+accumulation+of+the+proliferating+cell+nuclear+antigen+PCN-1+transitions+from+continuous+in+the+adult+germline+to+intermittent+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Cell+Cycle+Analysis.">elegans Cell Cycle Analysis.</a> Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).</li><li>ThermoFisher. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).</li><li>Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+reproductive+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hansen, D., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferation+versus+meiotic+fate+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+of+S+phases,+X+chromosome+replication,+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line.">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li><li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans.">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li><li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline.">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).</li><li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li><li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., M&#252; Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3,+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation.">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes &amp; development. 13 (17), 2258-2270 (1999).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crawley, O., Barroso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin-interacting+protein+WAPL-1+regulates+meiotic+chromosome+structure+and+cohesion+by+antagonizing+specific+cohesin+complexes.">Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes.</a> eLife. 5 (2), 1-26 (2016).</li><li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling,+impairment+of+cell+cycle+progression,+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+incorporated+into+DNA.">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK.</a> in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).</li><li>Vos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De Cell Counter Plugin. , (2015).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (2016).</li><li>Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+promotes+germline+proliferation+in+C.+elegans.">Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans.</a> Development. 137 (4), 671-680 (2010).</li><li>Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-autonomous+DAF-16/FOXO+activity+antagonizes+age-related+loss+of+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).</li><li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFB+and+Insulin+Signaling+Regulate+Reproductive+Aging+via+Oocyte+and+Germline+Quality+Maintenance.">TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance.</a> Cell. 143 (2), 299-312 (2010).</li><li>Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-18/PTEN+locally+antagonizes+insulin+signalling+to+couple+germline+stem+cell+proliferation+to+oocyte+needs+in+C.+elegans.">daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans.</a> Development. , 4230-4241 (2015).</li><li>Cinquin, A., Chiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+Stem+Cell+Cycling+Balances+Self-Renewal+and.">Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and.</a> Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).</li><li>Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+Detection+of+Two+Thymidine+Analogues+(CldU+and+IdU)+in+Primary+Tissue.">Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).</li></ol>

Vorbereitung der EdU-Label Bakterien (Schritt 1) ist für dieses Protokoll und den ersten Punkt für die Problembehandlung von entscheidender Bedeutung. Wildtyp junge Erwachsene Hermaphroditen Label in einer 4 h EdU-Puls, so dass dies ein nützliches Steuerelement für jede neue Charge mit der Bezeichnung der EdU Bakterien sehr zuverlässig. Darüber hinaus werden intakte EdU-Label Bakterien, die den Darm (in älteren Tieren oder bestimmte Rachen/Mahlwerk defekt Mutanten) geben Sie beschriften mit Click Chemie und ersche...

In der tierischen Entwicklung müssen Hunderte, Tausende, Millionen, Milliarden oder gar Billionen von Zellteilungen erwachsenen Organismus bilden. Zellzyklus, die Menge der zelluläre Ereignisse bestehend aus G1 (Gap), S (Synthese), G2 (Gap), und M (Mitose) definieren die Reihe von Veranstaltungen, die Ausführung jeder Zellteilung. Der Zellzyklus ist dynamisch und in Echtzeit, was technisch schwierig sein kann, am besten geschätzt. In diesem Protokoll vorgestellten Techniken erlauben es, die Messungen der Phasen und Timing des Zellzyklus von Standbildern zu machen.
Etikettierung mit Nukleosid-Analoga z. B. 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine (EdU) oder 5-Bromo-2'-Deoxyuridine (BrdU) ist der Goldstandard, S-Phase in den Studien des Zellzyklus Dynamik in den Caenorhabditis Elegans (C. Elegans) Erwachsenen zu identifizieren zwittrige Keimbahn1,2,3,4,5. EdU und BrdU kann in nahezu jedem genetischen Hintergrund verwendet werden, da sie nicht auf irgendwelche genetischen Konstrukt angewiesen sind. Visualisierung von BrdU erfordert harte chemische Behandlung aussetzen Antigen für Anti-BrdU Antikörper Färbung, oft mit der Beurteilung der anderen zellulären Marker visualisiert, indem gemeinsam mit zusätzlichen Antikörper Färbung nicht kompatibel ist. Im Gegensatz dazu visualisieren EdU erfolgt durch Click-Chemie unter milden Bedingungen und ist somit kompatibel mit Antikörper Co Färbung6,7.
Die Besonderheit des Labels ist klar, da Kerne nur die Thymidin (5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine) Entsprechungen in DNA während der S-Phase zu integrieren. Visualisierung erfolgt im festen Gewebe. Das EdU Etikett unsichtbar selbst bis eine azid-haltigen Farbstoff oder Fluorophor reagiert kovalent mit Alkinen in EdU durch Kupfer-katalysierte Klick-Chemie-8. EdU Kennzeichnung kann sofortige Auskunft auf die Kerne in S-Phase, einen kurzen Impuls sind der Beschriftung verwenden. EdU kann auch dynamische Informationen bereitstellen, mit Puls-Jagd oder fortlaufende Kennzeichnung; zum Beispiel in einem Puls-Chase-Experiment, das Label wird bei jeder Zellteilung verdünnt oder als nondividing Zellen Fortschritt durch Entwicklung weitergegeben.
C. Elegans Hermaphrodite Keimbahn ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus. Die Erwachsenen Keimbahn ist eine polarisierte Montagelinie mit Stammzellen gefunden am distalen Ende gefolgt von ein- und Progression durch meiotische Prophase, koordiniert mit den Phasen der Gametogenese mehr proximal (Abbildung 1). Am proximalen Ende Eizellen Reifen, sind Eisprung befruchtet und beginnen Embryogenese in der Gebärmutter9,10,11. Die Zelle ~ 20 Durchmesser lange Region nahe der distalen Spitze-Zelle, die mitotically Radsport Germline Stem, Vorläuferzellen und meiotischen Zellen der S-Phase aber nicht auf die Zellen in meiotischen Prophase enthält, nennt man den Stammvater Zone2,4 , 9 , 12. die Zellmembranen bieten unvollständige Trennung zwischen den Kernen in den distalen Keimbahn, aber Zone Vorläuferzellen unterziehen mitotische Zelle Radfahren weitgehend selbstständig. Die mediane mitotische Zelle Zyklusdauer der Keimbahn Zone Vorläuferzellen in jungen Erwachsenen Hermaphroditen ist ~6.5 h; G1-Phase ist kurz oder abwesend, und Ruhe ist nicht eingehalten,1,2,13. Keimbahn Stammzell-Differenzierung erfolgt durch im wesentlichen direkten Differenzierung und somit fehlt Transit-Verstärkung Divisionen4. Während der Differenzierung in der Pachytene Phase etwa 4 von 5 Kerne werden keine Eizellen bilden aber stattdessen Apoptose, als Krankenschwester Zellen durch eine Spende den zytoplasmatischen Inhalt in den Entwicklungsländern Eizelle12,14 , 15.
Neben der Kennzeichnung Zellen in der S-Phase mit Nukleosid-Analoga kann man die Zellen in Mitose und Meiose mit Antikörper Färbung identifizieren. Kerne in Mitose sind immunreaktiven zu Anti-Phospho-Histon H3 (Ser10) Antikörper (so genannte pH3)7,16. Kerne in Meiose sind immunreaktiven Anti-ihn-3 Antikörper (ein meiotische Chromosomen Achse Protein)17. Kerne in der Stammvater Zone können durch das Fehlen von HIM-3, das Vorhandensein von nucleoplasmic REC-818oder das Vorhandensein von WAPL-119identifiziert werden. WAPL-1 Intensität ist in der somatischen Gonade, hoch in der Stammvater Zone am höchsten und niedrigen während frühen meiotischen Prophases19. Mehreren Zellzyklus Messung ist möglich mit ein paar Variationen im Protokoll: ich) Kerne in S-Phase zu identifizieren und Messen S-Phase Index; (II) ermitteln Sie Kerne M-Phase und Messen Sie den M-Phase-Index zu; (III) bestimmen Sie, ob Kerne in mitotischen oder meiotische S-Phase wurden; (IV) messen Sie die Dauer der G2; (V) messen Sie die Duartion G2 + M + G1 Phasen; (VI) messen Sie die Geschwindigkeit der meiotischen Eintrag; (VII) die Rate der meiotic Progression zu schätzen.
Man kann mehrere Zellzyklus-Messungen von nur ein paar Arten von nass-Labor Experimente machen. Das Protokoll unten beschreibt eine 30 min Puls Kennzeichnung durch die Fütterung von C. Elegans adulter Hermaphrodites mit EdU Bakterien und Co Kennzeichnung M-Phase Zellen nach Färbung mit Antikörper Anti-pH3 und Vorläuferzellen Zone Zellen durch Färbung mit Anti-WAPL-1 Antikörper beschriftet. Nur Änderungen in der Dauer der EdU feed (Schritt 2.5), Art der Antikörper eingesetzt (Schritt 5) und Analysen (Schritt 8.3) sind für die weiteren Messungen erforderlich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1019px;" width="1020">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td >E. coli MG1693</td>
			<td style="width:255px;">Coli Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:255px;">6411</td>
			<td style="width:255px;">grows fine in standard unsupplemented LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:255px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:255px;">OP50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C10337</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">900584-50MG</td>
			<td style="width:255px;">or use EdU provided in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glucose</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">D9434-500G</td>
			<td style="width:255px;">D-(+)-Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thiamine (Vitamin B1)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T4625-5G</td>
			<td style="width:255px;">Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thymidine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T1895-1G</td>
			<td style="width:255px;">BioReagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1880-1KG</td>
			<td style="width:255px;">MgSO4, Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:255px;">BP332-500G</td>
			<td style="width:255px;">Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P5379-500G</td>
			<td style="width:255px;">KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">A4514-500G</td>
			<td style="width:255px;">NH4Cl, Reagent Plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:255px;">US Biological</td>
			<td style="width:255px;">C13071058</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C3881-500G</td>
			<td style="width:255px;">CaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LB Broth (Miller)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L3522-1KG</td>
			<td style="width:255px;">Used at 25g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Levamisole</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L9756-5G</td>
			<td style="width:255px;">0.241g/10ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:255px;">Calbiochem Omnipur</td>
			<td style="width:255px;">6506</td>
			<td style="width:255px;">homemade PBS works just as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P1379-500ML</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules</td>
			<td style="width:255px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:255px;">15710</td>
			<td style="width:255px;">10ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">100% methanol</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">A454-1L</td>
			<td style="width:255px;">Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:255px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">16210-072</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1671330</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">rabbit-anti-WAPL-1</td>
			<td style="width:255px;">Novus biologicals</td>
			<td style="width:255px;">49300002</td>
			<td style="width:255px;">Lot G3048-179A02, used at 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">mouse-anti-pH3 clone 3H10</td>
			<td style="width:255px;">Millipore</td>
			<td style="width:255px;">05-806</td>
			<td style="width:255px;">Lot#2680533, used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A11012</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1256147, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A21236</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1511347, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">Vectashield antifade mounting medium containing 4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:255px;">H-1200</td>
			<td style="width:255px;">mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">nail polish</td>
			<td style="width:255px;">Wet n Wild</td>
			<td style="width:255px;">DTC450B</td>
			<td style="width:255px;">any clear nail polish should work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">S-medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">M9 agar</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nematode Growth Medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">dissecting watch glass</td>
			<td style="width:255px;">Carolina Biological</td>
			<td style="width:255px;">42300</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm laboratory film</td>
			<td style="width:255px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:255px;">PM-996</td>
			<td style="width:255px;">4 inch wide laboratory film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">petri dishes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Long glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:255px;">MidSci Avant</td>
			<td style="width:255px;">2926</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tips</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">500 mL Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">25G 5/8&#8221; needles</td>
			<td style="width:255px;">BD PrecisionGlide&#160;</td>
			<td style="width:255px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5ml glass centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Pyrex&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Borosilicate glass tubes 1ml</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">glass slides</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">no 1 coverslips 22 x 40 mm</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">no 1.5 may work, also</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">37 &#176;C Shaker incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clinical Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;">IEC</td>
			<td style="width:255px;">428</td>
			<td style="width:255px;">with 6 swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">20 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:255px;">4 &#176;C refrigerator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">-20 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Observer Z1 microscope</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Ultraview Vox spinning disc confocal system</td>
			<td style="width:255px;">PerkinElmer&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu

Zellzyklus-Analyse in den Eukaryotes nutzt häufig Chromosom Morphologie, Ausdruck und/oder Lokalisierung von Gen-Produkte für die verschiedenen Phasen des Zellzyklus oder die Einbeziehung von Nukleosid-Analoga. S-Phase enthalten DNA-Polymerasen Thymidin-Analoga wie EdU oder BrdU in chromosomaler DNA, markieren die Zellen für die Analyse. Für C. Elegansder Nukleosid analoge EdU an die Würmer verfüttert wird, während der regulären Kultur und ist kompatibel mit immunofluorescent Techniken. Die Keimbahn von C. Elegans ist ein leistungsfähiges Modell-System für das Studium der Signalisierung Bahnen, Stammzellen, Meiose und Zellzyklus, denn es transparent, genetisch facile ist und meiotischen Prophase und zelluläre Differenzierung/Gametogenese in auftreten einem lineare Montage-wie Mode. Diese Eigenschaften machen EdU ein großartiges Werkzeug, um dynamische Aspekte der mitotically Radsport Zellen und Keimbahn Entwicklung zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie erfolgreich vorbereiten EdU Bakterien, füttern zu Wildtyp C. Elegans Hermaphroditen, Zwitter Gonade sezieren, für EdU Gesellschaftsgründung in DNA, Fleck Fleck mit Antikörpern gegen verschiedene Zellzyklus zu erkennen und Entwicklungs-Marker image die Gonade und analysieren Sie die Ergebnisse. Das Protokoll beschreibt die Unterschiede in der Methode und Analyse für die Messung der S-Phase Index, M-Phase Index G2 Dauer, Dauer des Zellzyklus, Rate der meiotischen Eintrag und meiotischen Prophase Fortschreiten. Diese Methode kann angepasst werden, um den Zellzyklus oder Zelle Geschichte in anderen Geweben, Stadien, genetische Hintergründe und physiologischen Bedingungen zu studieren.

Da DNA-Synthese benötigt wird, EdU zu integrieren, kann man feststellen, dass mit der Bezeichnung der EdU Kerne S-Phase während des Zeitfensters EdU-Kennzeichnung unterzog. Man kann die Kerne dieser Bezeichnung in einer 30 min Fütterung mit EdU beschriftet Bakterien als Kerne in S-Phase bei der Präparation interpretieren. Kerne, die in einem mehr kontinuierliche EdU Fütterungsversuch beschriften können früh im Zeitfenster und seit Links S-Phase gekennzeichnet haben, oder können in...

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Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Eine Imaging-basierte Methode beschrieben, die kann verwendet werden, um S-Phase zu identifizieren und analysieren Zellzyklus Dynamik in C. Elegans Hermaphrodit Keimbahn mit dem Thymidin analoge EdU. Diese Methode erfordert keine transgene und ist kompatibel mit immunofluorescent Beflecken.

Cell Cycle Analysis in C. Elegans Keimbahn mit Thymidin-Analog-EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen über den Zellzyklus und Keimbahn Stammzellpopulationsdynamik in C.elegans zu beantworten. Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass sie keine Transgene benötigt, sie ist mit immunfluoreszierender Färbung kompatibel und kann modifiziert werden, um Zellen unter vielen verschiedenen Bedingungen zu untersuchen. Ich war sehr aufgeregt, als ich zum ersten Mal sah, dass diese Methode im Scheda-Labor angewendet wurde.Obwohl diese Methode Einblick in den C.elegans Zellzyklus bieten kann, Kann es auch auf breitere Fragen über Alterung, Ernährung, oder veränderte Genotypen angewendet werden. Im Allgemeinen Labore neu zu dieser Methode kann mit der anfänglichen Idiodisprepation oder C.elegans Hämatoxylin Färbung zu kämpfen. Beginnen Sie mit steriler Technik, um 200 Mikroliter von 10 Millimolar EdU in 100 Milliliter M9 Puffer und die entsprechenden Ergänzungen zu vier Milliliter frisch angebaut über Nacht MG 1693 E.coli-Kultur hinzuzufügen.Idiodiscious erfordert ein empfindliches Gleichgewicht zwischen EdU und Thymidin-Supplementierung. Da die Menge an Thymidin ausreichen muss, damit der E coli gut wächst, muss die Menge an EdU für den robusten Schutz gegen Nivellierung ausreichen. Nach nicht mehr als 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 200 U/min, verwenden Sie sterile Technik, um die Kultur zwischen zwei bis vier sterilen 50 Milliliter konischen Röhren für die Zentrifugation aufzuteilen.Setzen Sie die Pellatin vier Milliliter frischen M9 Puffer aus und verwenden Sie dieselbe Pipette, um etwa 8 Tropfen EdU mit edU-Beschriftung E Coli MG1693-Lösung in der Mitte der individuellen Raumtemperatur 60 Milliliter M9 A Wache Petrischalen aufzutragen. Um die EdU-gekennzeichneten Bakterien an die Nematoden zu füttern, verwenden Sie frische SPBS, um die C.Elegans von einer nematoden Wachstumsmediumschale in ein 1,5-Milliliter-Rohr zu waschen und die Tiere kurzzeitig durch Schwerkraft absetzen zu lassen. Waschen Sie die Tiere ein- bis zweimal mit einem Milliliter PBS und verwenden Sie eine Glaspasteurpipette, um die Nematoden in einem winzigen Tropfen PBS auf die Mitte des EdU-Rasens zu übertragen.Warten Sie einige Minuten, bis die Flüssigkeit absorbiert wird, und brüten Sie die Kultur gemäß dem experimentellen Protokoll mindestens 30 Minuten bei 20 Grad Celsius. Verwenden Sie am Ende der Inkubation zwei Milliliter PBS, um die Würmer von der EdU-Kulturplatte in eine Glassezierschale zu spülen. Nach der Zerlegung und Fixierung der Nematodengonaden, wie zuvor beschrieben, spülen Sie ein kleines Einmilliliter Borosilikatglasrohr und eine lange Glaspasteurpipette mit PBS ergänzt mit 0,1%tween 20 und verwenden Sie die Pipette, um die festen Gonaden in einer kleinen Menge von PBS-Tween in das Rohr zu übertragen.Sammeln Sie die Gonaden durch Zentrifugation und verwenden Sie eine lange, herausgezogene Glasweidepipette, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen, ohne das Gonadenpellet zu stören. Für die EdU-Erkennung fügen Sie 100 MikroLiter EdU-Cocktail zu den Gonaden hinzu und bedecken Sie das Rohr mit Laborfolie für eine 30 bis 60 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Gonaden einmal mit 100 MikroLiter Reaktionsspülpuffer und viermal mit einem Milliliter PBS-Tween waschen.Nach der letzten Wäsche 25 MikroLiter Anti-Fade-Montagemedium mit DAPI ergänzt in die Probe geben. Während sich das Medium über die Gonaden setzt, legen Sie ein großes 2,5%Agarose-Pad auf ein Standard-Glasmikroskop-Dia. Dann mit einer zweiten Rutsche abflachen.Als nächstes verwenden Sie eine lange GlaspasteurPipette und halten Sie alle Flüssigkeiten und Gonaden in der schmalen Spitze der Pipette, um den Probenverlust zu minimieren, wenn sie die Gonaden auf das Pad übertragen. Mit einer auf einen Zahnstocher geklebten Wimper verteilen Sie die Gonaden über das Agarosepad und entfernen Sie Staubpartikel. Dann langsam senken Sie eine rechteckige Glasabdeckung rutschen auf die Gonaden, achten darauf, Luftblasen zu vermeiden, und entfernen Jede überschüssige Lösung mit einem Laborgewebe.Das Zählen von Zellen in drei Dimensionen erfordert zuverlässig einige Übung. Die Verwendung des Zellzähler-Plug-Ins von Fidschi und eines Skripts wie Markierungen der Zellen zum Entfernen von Duplikaten trägt dazu bei, dass die Zählungen reproduzierbar sind. Nachdem der Deckel über Nacht abgelassen wurde, verwenden Sie das Zellzähler-Plug-in und Fidschi, um jeden Kern manuell zu zählen, wobei jeder einzelne Kern nach dem Vorhandensein oder Fehlen von Phosphohiston drei EdU- oder Prägenetorzonen-Etikettierung gekennzeichnet wird.EdU-Signal kolokalisiert mit DAPI-Signal. In einigen Kernen deckt das EdU-Signal alle Chromosomen ab, während in anderen Kernen das EdU-Signal auf ein bis zwei helle Punkta lokalisiert, wahrscheinlich auf dem X-Chromosom, das sich spät in der S-Phase repliziert. EdU-Signal von einer erfolgreichen 30-Minuten-Etikettierung lokalisiert etwa die Hälfte der Kerne in der Pregenetor-Zone.Während die Technik bei jungen erwachsenen Tieren des wilden Typs konsequent funktioniert, kann ein signifikanter Bruchteil der 5 Tage alten Hermaphroditen nicht in einem 30-minütigen EdU-Puls gekennzeichnet werden. Die Dauer von G2 kann geschätzt werden, indem der Prozentsatz der Kerne in der M-Phase analysiert wird, die im Laufe des Zeitraums EdU-positiv sind, was die Berechnung des Medians und der maximalen Dauer von G2 ermöglicht. Die Dauer von G2 und G1 kann anhand des Prozentsatzes aller E-Kerne der Prägenetorzone geschätzt werden, die EdU-positiv sind, was die Berechnung der maximalen Dauer der kombinierten Phasen ermöglicht. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dieselbe Charge edU-Gerichte zu verwenden, um die interexperimentelle Variabilität zu minimieren.Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Färbung mit zusätzlichen Antikörpern durchgeführt werden oder zusätzliche Fragen über den Zellzyklus, das Zellschicksal oder Signalwege beantworten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Nucleicide Analoga und Parafermeldahyd gefährlich sein kann, und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Nitrolhandschuhen, immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden sollten.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Umfassende Beurteilung der Keimbahn Chemical Toxicity Mit der Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisierung von Chondrozyten-Einlagerung und Directional Verbreitung über Zebrabow klonalen Zellanalyse in der embryonalen Meckel-Knorpel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging

The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analy

C. Elegans Darm als ein Modell für die interzelluläre Lumen Morphogenese und In Vivo polarisiert Membrane Biogenesis Ebene der einzelligen: Kennzeichnung durch Antikörper Färbung, RNAi Verlustfunktion Analyse und Bildgebung

Multicellular tubes, fundamental units of all internal organs, are composed of polarized epithelial or endothelial cells, with apical membranes lining the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Anwendung von RNAi und Hitze-Schock-induzierte Transkription Faktor Ausdruck zu programmieren Keimzellen Neuronen in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Handy-Aggregation-Assays, die Bindung der Drosophila Kerbe mit Transzu bewerten-Liganden und ihre Hemmung von Cis-Liganden

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Dreidimensionale Darstellung und Analyse der Immunolabeled, geklärt menschlichen Plazenta Zotten vaskulärer Netzwerke

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computergestützte Analyse der Keimbahn Caenorhabditis Elegans , die Verteilung der Kerne, Proteine und das Zytoskelett zu studieren

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...