Name: cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu
Uploaded: 2018-10-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU at JoVE.com

Estamos gratos ao centro de estoque de Escherichia coli para MG1693; Wormbase; o centro de genética Caenorhabditis que é financiado pelos institutos de saúde escritório de pesquisa infra-estrutura programas nacionais (P40OD010440) para cepas; Zach Pincus para consultoria estatística; Aiping Feng para reagentes; Luke Schneider, Andrea Scharf, Sandeep Kumar e John Brenner para treinamento, aconselhamento, apoio e discussão útil; e os laboratórios Kornfeld e Schedl para feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi financiado em parte pelo National Institutes of Health [R01 AG02656106A1 à KK, R01 GM100756 TS] e uma bolsa predoctoral National Science Foundation [DGE-1143954 e DGE-1745038 de ZK]. O National Institutes of Health, nem a National Science Foundation tinha qualquer papel no desenho do estudo, coleção, análise e interpretação dos dados, nem por escrito o manuscrito.

1. preparação de bactérias EdU-etiquetado
<ol><li>
Cultivar uma cultura de acionador de partida de MG1693. Escherichia coli MG1693 (Escherichia coli) carrega uma mutação em thyA.
	<ol>
<li>Raia para fora de e. coli MG1693 de um estoque de glicerol congelado em um ágar de caldo (LB) lisogenia 120 mm placa de Petri. Cultura a 37 ° C durante a noite.</li>
		<li>Inocular de duas individuais Escherichia coli MG1693 colônias em dois tubos de 4 mL de líquido cultur...

<ol>
	<li>Fox, P. M., Vought, V. E., Hanazawa, M., Lee, M. -. H., Maine, E. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclin+E+and+CDK-2+regulate+proliferative+cell+fate+and+cell+cycle+progression+in+the+C.+elegans+germline.">Cyclin E and CDK-2 regulate proliferative cell fate and cell cycle progression in the C. elegans germline.</a> Development. 138 (11), 2223-2234 (2011).</li><li>Crittenden, S. L., Leonhard, K. A., Byrd, D. T., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+analyses+of+the+mitotic+region+in+the+Caenorhabditis+elegans+adult+germ+line.">Cellular analyses of the mitotic region in the Caenorhabditis elegans adult germ line.</a> Molecular biology of the cell. 17 (7), 3051-3061 (2006).</li><li>Seidel, H. S., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle+quiescence+maintains+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cells+independent+of+GLP-1/Notch.">Cell-cycle quiescence maintains Caenorhabditis elegans germline stem cells independent of GLP-1/Notch.</a> eLife. 4, (2015).</li><li>Fox, P. M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Germline+Stem+Cell+Differentiation+Following+Loss+of+GLP-1+Notch+Activity+in+Caenorhabditis+elegans.">Analysis of Germline Stem Cell Differentiation Following Loss of GLP-1 Notch Activity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201 (9), 167-184 (2015).</li><li>Kocsisova, Z., Kornfeld, K., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+accumulation+of+the+proliferating+cell+nuclear+antigen+PCN-1+transitions+from+continuous+in+the+adult+germline+to+intermittent+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Cell cycle accumulation of the proliferating cell nuclear antigen PCN-1 transitions from continuous in the adult germline to intermittent in the early embryo of C. elegans.</a> BMC Developmental Biology. 18 (1), (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>vanden Heuvel, S., Kipreos, E. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=elegans+Cell+Cycle+Analysis.">elegans Cell Cycle Analysis.</a> Methods in Cell Biology. , 265-294 (2012).</li><li>ThermoFisher. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Click-iT EdU Imaging Kits. , (2011).</li><li>Pazdernik, N., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Germ Cell Development in C. elegans. , 1-16 (2013).</li><li>Hirsh, D., Oppenheim, D., Klass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+reproductive+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Development of the reproductive system of Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 49 (1), 200-219 (1976).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li><li>Hansen, D., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+proliferation+versus+meiotic+fate+decision+in+Caenorhabditis+elegans.">Stem cell proliferation versus meiotic fate decision in Caenorhabditis elegans.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 71-99 (2013).</li><li>Jaramillo-Lambert, A., Ellefson, M., Villeneuve, A. M., Engebrecht, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+timing+of+S+phases,+X+chromosome+replication,+and+meiotic+prophase+in+the+C.+elegans+germ+line.">Differential timing of S phases, X chromosome replication, and meiotic prophase in the C. elegans germ line.</a> Developmental Biology. 308 (1), 206-221 (2007).</li><li>Agarwal, I., Farnow, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOP-1+presenilin+deficiency+causes+a+late-onset+notch+signaling+phenotype+that+affects+adult+germline+function+in+Caenorhabditis+elegans.">HOP-1 presenilin deficiency causes a late-onset notch signaling phenotype that affects adult germline function in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 208 (2), 745-762 (2018).</li><li>Gumienny, T. L., Lambie, E., Hartwieg, E., Horvitz, H. R., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+programmed+cell+death+in+the+Caenorhabditis+elegans+hermaphrodite+germline.">Genetic control of programmed cell death in the Caenorhabditis elegans hermaphrodite germline.</a> Development. 126 (5), 1011-1022 (1999).</li><li>Hendzel, M. J., Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis-specific+phosphorylation+of+histone+H3+initiates+primarily+within+pericentromeric+heterochromatin+during+G2+and+spreads+in+an+ordered+fashion+coincident+with+mitotic+chromosome+condensation.">Mitosis-specific phosphorylation of histone H3 initiates primarily within pericentromeric heterochromatin during G2 and spreads in an ordered fashion coincident with mitotic chromosome condensation.</a> Chromosoma. 106 (6), 348-360 (1997).</li><li>Zetka, M. C., Kawasaki, I., Strome, S., M&#252; Ller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synapsis+and+chiasma+formation+in+Caenorhabditis+elegans+require+HIM-3,+a+meiotic+chromosome+core+component+that+functions+in+chromosome+segregation.">Synapsis and chiasma formation in Caenorhabditis elegans require HIM-3, a meiotic chromosome core component that functions in chromosome segregation.</a> Genes &amp; development. 13 (17), 2258-2270 (1999).</li><li>Hansen, D., Hubbard, E. J. A., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-pathway+control+of+the+proliferation+versus+meiotic+development+decision+in+the+Caenorhabditis+elegans+germline.">Multi-pathway control of the proliferation versus meiotic development decision in the Caenorhabditis elegans germline.</a> Developmental Biology. 268 (2), 342-357 (2004).</li><li>Crawley, O., Barroso, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cohesin-interacting+protein+WAPL-1+regulates+meiotic+chromosome+structure+and+cohesion+by+antagonizing+specific+cohesin+complexes.">Cohesin-interacting protein WAPL-1 regulates meiotic chromosome structure and cohesion by antagonizing specific cohesin complexes.</a> eLife. 5 (2), 1-26 (2016).</li><li>Zhao, H., Halicka, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+signaling,+impairment+of+cell+cycle+progression,+and+apoptosis+triggered+by+5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine+incorporated+into+DNA.">DNA damage signaling, impairment of cell cycle progression, and apoptosis triggered by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine incorporated into DNA.</a> Cytometry Part A. 83 (11), 979-988 (2013).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK.">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK.</a> in the C. elegans Germline. Journal of Visualized Experiments. 117 (117), e54901-e54901 (2016).</li><li>Vos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> De Cell Counter Plugin. , (2015).</li><li>Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rasband, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ImageJ. , (2016).</li><li>Michaelson, D., Korta, D. Z., Capua, Y., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+signaling+promotes+germline+proliferation+in+C.+elegans.">Insulin signaling promotes germline proliferation in C. elegans.</a> Development. 137 (4), 671-680 (2010).</li><li>Qin, Z., Jane, E., Hubbard, A., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-autonomous+DAF-16/FOXO+activity+antagonizes+age-related+loss+of+C.+elegans+germline+stem/progenitor+cells.">Non-autonomous DAF-16/FOXO activity antagonizes age-related loss of C. elegans germline stem/progenitor cells.</a> Nature communications. 6 (5), 7107 (2015).</li><li>Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGFB+and+Insulin+Signaling+Regulate+Reproductive+Aging+via+Oocyte+and+Germline+Quality+Maintenance.">TGFB and Insulin Signaling Regulate Reproductive Aging via Oocyte and Germline Quality Maintenance.</a> Cell. 143 (2), 299-312 (2010).</li><li>Narbonne, P., Maddox, P. S., Labbe, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=daf-18/PTEN+locally+antagonizes+insulin+signalling+to+couple+germline+stem+cell+proliferation+to+oocyte+needs+in+C.+elegans.">daf-18/PTEN locally antagonizes insulin signalling to couple germline stem cell proliferation to oocyte needs in C. elegans.</a> Development. , 4230-4241 (2015).</li><li>Cinquin, A., Chiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+Stem+Cell+Cycling+Balances+Self-Renewal+and.">Intermittent Stem Cell Cycling Balances Self-Renewal and.</a> Senescence of the C. elegans Germ Line. PLoS Genetics. 12 (4), 1005985 (2016).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Invitrogen EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine). , 1-7 (2010).</li><li>Tuttle, A. H., Rankin, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+Detection+of+Two+Thymidine+Analogues+(CldU+and+IdU)+in+Primary+Tissue.">Immunofluorescent Detection of Two Thymidine Analogues (CldU and IdU) in Primary Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. 46 (46), e2166-e2166 (2010).</li></ol>

Preparação de bactérias EdU-rotulado (etapa 1) é fundamental para este protocolo e o primeiro ponto para solução de problemas. Rótulo de tipo selvagem jovens adultos hermafroditas muito confiável em um EdU-pulso, inventando um controle útil para cada novo lote de bactérias EdU-rotulado de 4h. Além disso, intactas EdU-rotulado de bactérias que entram no intestino (em animais mais velhos ou certos mutantes defeituosos faringe/moedor) irão rotular com química clique e aparecem como partitura oblonga brilhante ...

No desenvolvimento do animal, centenas, milhares, milhões, bilhões ou mesmo trilhões de divisões celulares são necessários para formar o organismo adulto. O ciclo celular, o conjunto de eventos celulares compostas de G1 (gap), S (síntese), G2 (gap), e M (mitose) definir a série de eventos que são executados a cada divisão celular. O ciclo celular é dinâmico e melhor apreciada em tempo real, que pode ser tecnicamente difícil. As técnicas apresentadas neste protocolo permitem que se faça as medições das fases e o ciclo celular de imagens fixas.
Rotulagem com análogos de nucleosídeos como 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) ou 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) é o padrão-ouro para identificar a fase S nos estudos de dinâmica do ciclo celular no adulto Caenorhabditis elegans (c. elegans) germline hermafrodita1,2,3,4,5. EdU e BrdU tanto podem ser usado em quase qualquer fundo genético, como eles não dependem de qualquer construção genética. Visualizar BrdU requer tratamento químico áspero para expor o antígeno para o anticorpo anti-BrdU coloração, que muitas vezes é incompatível com a avaliação de outros marcadores celulares visualizados por coloração com anticorpos adicionais de co. Em contrapartida, Visualizar o EdU ocorre pela química clique em condições suaves e, portanto, é compatível com o anticorpo que mancha co6,7.
A especificidade do rótulo é clara, desde que os núcleos só incorporam os análogos (5-ethynyl-2'-desoxiuridina) de timidina DNA durante a fase S. Visualização ocorre no tecido fixo. O rótulo de EdU é invisível por si só até um corante contendo azida sódica ou fluoróforo covalentemente reage com o alkyne em EdU por clique cobre-catalisada química8. EdU rotulagem pode fornecer informação imediata, na qual os núcleos estão em fase S, usando um curto pulso de rotulagem. EdU também pode fornecer informações dinâmicas, usando o pulso-chase ou rotulagem contínua; por exemplo, em um experimento de pulso-perseguição, o rótulo é diluído em cada divisão celular ou propagadas como nondividing de células de progresso através de desenvolvimento.
O germline hermafrodita de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose. O adulto germline é uma linha de montagem polarizada com células-tronco encontradas na extremidade distal, seguida por entrada e progressão através da prófase meiótica, coordenado com as fases da gametogênese mais proximal (Figura 1). Na extremidade proximal, oócitos maduros, são ovularam e fertilizados e começam a embriogênese na útero9,10,11. A região de ~ 20 célula-diâmetro longo perto da célula de ponta distal, que inclui o tronco germline mitotically ciclismo, células progenitoras e meiose células em fase S, mas não as células na prófase meiótica, chama-se o progenitor zona2,4 , 9 , 12. as membranas celulares fornecem separação incompleta entre os núcleos no germline distal, mas células progenitoras zona passam por célula mitótica ciclismo em grande parte independente. A duração do ciclo de celular mitótica mediana do germline progenitoras de zona em jovens adultas hermafroditas é ~6.5 h; Fase G1 é curto ou ausente, e quiescência não é observada1,2,13. Diferenciação de células-tronco do germline ocorre através da modulação essencialmente direta e, portanto, carece de trânsito-amplificando divisões4. Durante a diferenciação na fase de paquíteno, aproximadamente 4 em 5 núcleos não formará oócitos, mas em vez disso, passam por apoptose, atuando como enfermeira células doando seu conteúdo citoplasmático para o desenvolvimento oócito12,14 , 15.
Além de rotulagem células em fase S com análogos de nucleosídeos, pode-se identificar as células em mitose e meiose usando anticorpos. Núcleos em mitose são imunorreativas para antifosfo-histona H3 (Ser10) Anticorpo (chamado pH3)7,16. Núcleos na meiose são imunorreativas para anticorpo antiele-3 (uma proteína de eixo de cromossomas)17. Núcleos na zona de progenitor podem ser identificados pela ausência de HIM-3, a presença de auxílio REC-8,18ou a presença de WAPL-119. WAPL-1 intensidade é maior na gônada somática, alta na zona de progenitor e baixa durante cedo meiótica prophases19. Várias medições de ciclo celular são possíveis, com algumas variações no protocolo: eu) identificar os núcleos na fase S e medir o índice de fase S; II) identificar núcleos em M-fase e medir o índice de M-fase; III) determinar se núcleos em S-fase mitótica ou meiótica; IV) medir a duração do G2; V) medir o duartion das fases G1 + G2 + M; VI) medir a taxa de entrada meiótica; VII) estimativa da taxa de progressão meiótica.
Pode-se fazer várias medições de ciclo celular de apenas alguns tipos de experimentos de laboratório-molhado. O protocolo abaixo descreve uma rotulagem de pulso de 30 min por alimentação c. elegans adultas hermafroditas com EdU rotulado de bactérias e células em fase M co rotulagem pela coloração com o progenitor e anticorpo anti-pH3 células zona por coloração com anticorpos anti-WAPL-1. Somente as alterações na duração do EdU alimentar (etapa 2.5), tipo de anticorpos empregados (etapa 5), e análises (passo 8.3) são necessárias para as medições adicionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1019px;" width="1020">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td >E. coli MG1693</td>
			<td style="width:255px;">Coli Genetic Stock Center</td>
			<td style="width:255px;">6411</td>
			<td style="width:255px;">grows fine in standard unsupplemented LB</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">E. coli OP50</td>
			<td style="width:255px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:255px;">OP50</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">C10337</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5-Ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">900584-50MG</td>
			<td style="width:255px;">or use EdU provided in kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Glucose</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">D9434-500G</td>
			<td style="width:255px;">D-(+)-Dextrose</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thiamine (Vitamin B1)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T4625-5G</td>
			<td style="width:255px;">Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Thymidine</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">T1895-1G</td>
			<td style="width:255px;">BioReagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">M1880-1KG</td>
			<td style="width:255px;">MgSO4, Reagent Grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Sodium Phosphate, dibasic, anhydrous</td>
			<td style="width:255px;">Fisher</td>
			<td style="width:255px;">BP332-500G</td>
			<td style="width:255px;">Na2HPO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P5379-500G</td>
			<td style="width:255px;">KH2PO4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">A4514-500G</td>
			<td style="width:255px;">NH4Cl, Reagent Plus</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Bacteriological Agar</td>
			<td style="width:255px;">US Biological</td>
			<td style="width:255px;">C13071058</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">C3881-500G</td>
			<td style="width:255px;">CaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">LB Broth (Miller)</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L3522-1KG</td>
			<td style="width:255px;">Used at 25g/L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Levamisole</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">L9756-5G</td>
			<td style="width:255px;">0.241g/10ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:255px;">Calbiochem Omnipur</td>
			<td style="width:255px;">6506</td>
			<td style="width:255px;">homemade PBS works just as well</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:255px;">Sigma</td>
			<td style="width:255px;">P1379-500ML</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">16% Paraformaldehyde, EM-grade ampules</td>
			<td style="width:255px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:255px;">15710</td>
			<td style="width:255px;">10ml ampules</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">100% methanol</td>
			<td style="width:255px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:255px;">A454-1L</td>
			<td style="width:255px;">Gold-label methanol is critical for proper morphology with certain antibodies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Goat Serum</td>
			<td style="width:255px;">Gibco</td>
			<td style="width:255px;">16210-072</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1671330</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">rabbit-anti-WAPL-1</td>
			<td style="width:255px;">Novus biologicals</td>
			<td style="width:255px;">49300002</td>
			<td style="width:255px;">Lot G3048-179A02, used at 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">mouse-anti-pH3 clone 3H10</td>
			<td style="width:255px;">Millipore</td>
			<td style="width:255px;">05-806</td>
			<td style="width:255px;">Lot#2680533, used at 1:500</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-rabbit IgG-conjugated Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A11012</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1256147, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">goat-anti-mouse IgG-conjugated Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:255px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:255px;">A21236</td>
			<td style="width:255px;">Lot 1511347, used at 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:255px;">Vectashield antifade mounting medium containing 4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:255px;">H-1200</td>
			<td style="width:255px;">mounting medium without DAPI can be used instead, following a separate DAPI incubation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">nail polish</td>
			<td style="width:255px;">Wet n Wild</td>
			<td style="width:255px;">DTC450B</td>
			<td style="width:255px;">any clear nail polish should work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">S-medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">M9 agar</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">same recipe as M9 buffer, but add 1.7% agar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Nematode Growth Medium</td>
			<td style="width:255px;">various</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">see wormbook.org for protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">dissecting watch glass</td>
			<td style="width:255px;">Carolina Biological</td>
			<td style="width:255px;">42300</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Parafilm laboratory film</td>
			<td style="width:255px;">Pechiney Plastic Packaging</td>
			<td style="width:255px;">PM-996</td>
			<td style="width:255px;">4 inch wide laboratory film</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">petri dishes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">60 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Long glass Pasteur pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">1ml centrifuge tubes</td>
			<td style="width:255px;">MidSci Avant</td>
			<td style="width:255px;">2926</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tips</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Serological pipettes</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">500 mL Erlenmyer flask</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Aluminum foil</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">25G 5/8&#8221; needles</td>
			<td style="width:255px;">BD PrecisionGlide&#160;</td>
			<td style="width:255px;">305122</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">5ml glass centrifuge tube</td>
			<td style="width:255px;">Pyrex&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Borosilicate glass tubes 1ml</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">glass slides</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">no 1 coverslips 22 x 40 mm</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">no 1.5 may work, also</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">37 &#176;C Shaker incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tabletop Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Clinical Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;">IEC</td>
			<td style="width:255px;">428</td>
			<td style="width:255px;">with 6 swinging bucket rotor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Mini Centrifuge</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:255px;">20 &#176;C incubator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:255px;">4 &#176;C refrigerator</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">-20 &#176;C freezer</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:255px;">Observer Z1 microscope</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Plan Apo 63X 1.4 oil-immersion objective lens</td>
			<td style="width:255px;">Zeiss</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:255px;">Ultraview Vox spinning disc confocal system</td>
			<td style="width:255px;">PerkinElmer&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:255px;">Nikon spinning disc confocal system works very well, also, as described here: http://wucci.wustl.edu/Facilities/Light-Microscopy&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell cycle analysis in the c. elegans germline with the thymidine analog edu

Análise de ciclo celular em eucariotos frequentemente utiliza a morfologia do cromossomo, expressão e/ou localização de produtos de genes necessários para várias fases do ciclo celular, ou a incorporação de análogos de nucleosídeos. Durante a fase S, polimerases de DNA incorporam os análogos da timidina como EdU ou BrdU no DNA cromossômico, marcando as células para análise. Para c. elegans, o nucleosídeo EdU analógico é alimentado para os vermes durante a cultura regular e é compatível com as técnicas de imunofluorescência. O germline de c. elegans é um sistema poderoso modelo para os estudos de sinalização de vias, células-tronco, ciclo celular e meiose porque é transparente, geneticamente facile e prófase meiótica e diferenciação celular/gametogênese ocorrem em um forma de montagem, como linear. Estas características fazem EdU, uma ótima ferramenta para estudar aspectos dinâmicos de células mitotically ciclismo e desenvolvimento da linha germinal. Este protocolo descreve como com êxito preparar EdU bactérias, alimentá-los para o selvagem-tipo c. elegans hermafroditas, dissecar a gônada hermafrodita, mancha para incorporação de EdU no DNA, mancha com anticorpos para detectar vários ciclo celular e marcadores do desenvolvimento, a gônada de imagem e analisar os resultados. O protocolo descreve as variações no método e análise para a medição de fase S índice M-fase índice, G2 duração, duração do ciclo celular, taxa de entrada meiótica e taxa de progressão da prófase meiótica. Esse método pode ser adaptado para estudar o ciclo celular ou história de celular em outros tecidos, estágios, origens genéticas e condições fisiológicas.

Como a síntese de DNA é necessária para incorporar o EdU, pode-se concluir que EdU-rotulado núcleos passou por fase S durante a janela de tempo de criação de etiquetas de EdU. Um pode interpretar os núcleos esse rótulo em uma alimentação de 30 min com EdU rotulado bactérias como núcleos em fase S no momento da dissecação. Núcleos que rotular em uma mais EdU contínua alimentação experimento podem ter rotulado cedo na janela de tempo e desde a fase S esquerdo, ou podem ter...

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Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

É descrito um método baseado em imagens que pode ser usado para identificar a fase S e analisar a dinâmica do ciclo celular no germline hermafrodita de c. elegans , usando a timidina EdU analógico. Este método não requer nenhum transgenes e é compatível com coloração imunofluorescente.

Análise de ciclo celular no Germline de c. elegans com o EdU analógico de timidina

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o ciclo celular e a dinâmica da população de células-tronco da linha de germes em C.elegans. As principais vantagens dessa técnica são que ela não requer transgenes, é compatível com a coloração imunofluorescente, podendo ser modificada para estudar células em muitas condições diferentes. Fiquei muito entusiasmado quando vi este método sendo usado no laboratório de Scheda.Embora este método possa fornecer uma visão do ciclo celular de C.elegans, ele também pode ser aplicado a questões mais amplas sobre envelhecimento, nutrição ou genótipos alterados. Geralmente, laboratórios novos neste método podem lutar com a idiodisprepação inicial ou a coloração de hematoxilina C.elegans. Comece usando técnica estéril para adicionar 200 microliters de 10 mililitros EdU em 100 mililitros de tampão M9 e os suplementos apropriados para quatro mililitros de cultura MG 1693 E.coli recém-cultivada durante a noite.Fazer idiodiscious requer um delicado equilíbrio entre a suplementação de EdU e a timina. Como a quantidade de timmidina deve ser suficiente para que o E coli cresça bem, enquanto a quantidade de EdU deve ser suficiente para o escudo robusto contra o nivelamento. Depois de não mais do que 24 horas a 37 graus Celsius e 200 RPM, use técnica estéril para dividir a cultura entre dois a quatro tubos cônicos estéreis de 50 mililitros para centrifugação.Resuspenja a solução pellatina quatro mililitros de tampão M9 fresco e use a mesma pipeta para aplicar cerca de 8 gotas de solução EdU rotulada E Coli MG1693 para o centro de temperatura ambiente individual 60 mililitros M9 A guard petri dishes. Para alimentar as bactérias rotuladas pela EdU aos nematoides, use PBS fresco para lavar os C.Elegans de uma antena média de crescimento nematoide em um tubo de 1,5 mililitro e permitir que os animais se assentam brevemente pela gravidade. Lave os animais uma a duas vezes com um mililitro de PBS e use uma pipeta pasteur de vidro para transferir os nematoides para o centro do gramado da EdU em uma pequena gota de PBS.Espere alguns minutos para que o líquido seja absorvido e incubar a cultura por pelo menos 30 minutos a 20 graus Celsius de acordo com o protocolo experimental. No final da incubação, use dois mililitros de PBS para lavar os vermes da placa de cultura EdU em um prato de dissecação de vidro. Após a dissecção e fixação das gônadas de nematoides como descrito anteriormente, enxágue um pequeno tubo de vidro borossilicato de um mililitro e uma pipeta pasteur de vidro longo com PBS suplementada com 0,1%tween 20 e use a pipeta para transferir as gônadas fixas para o tubo em uma pequena quantidade de interpolação PBS.Colete as gônadas por centrifugação e use uma pipeta de pastagem de vidro longa e desenhada para remover o máximo de supernênite possível sem perturbar a pelota de cárdia. Para detecção da EdU, adicione 100 microLiters de coquetel EdU clique nas gônadas e cubra o tubo com filme de laboratório para uma incubação de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente. No final da incubação, lave as gôngas uma vez com 100 microLiters de tampão de lavagem de reação, e quatro vezes com um mililitro de interpolação PBS.Após a última lavagem, adicione 25 microLiters de meio de montagem anti-fade suplementado com DAPI à amostra. Enquanto o meio está se acomodando sobre as gôngas, coloque uma grande almofada de 2,5% de agarose em um slide de microscópio de vidro padrão. Em seguida, achate com um segundo slide.Em seguida, use uma pipeta pasteur de vidro longo e mantenha todos os líquidos e gôndas na ponta estreita da pipeta para minimizar a perda de amostra ao transferir as gôndas para a almofada. Usando um cílio colado em um palito, distribua as gônadas sobre a almofada de agarose e remova quaisquer partículas de poeira. Em seguida, abaixe lentamente uma tampa de vidro retangular sobre as gôngas, tomando cuidado para evitar bolhas de ar e removendo qualquer solução em excesso com um tecido de laboratório.Contar células em três dimensões requer alguma prática confiável. O uso do plug-in do contador de células de Fiji e um script como marca as células para remover quaisquer duplicatas ajuda a tornar as contagens reprodutíveis. Depois de permitir que o deslizamento de cobertura se instale durante a noite, use o contador de células plug-in e Fiji para contar manualmente cada núcleo, rotulando cada núcleo individual de acordo com a presença ou ausência de fosfohistone três EdU ou rotulagem celular de zona pré-geral.O sinal EdU co-localiza com o sinal DAPI. Em alguns núcleos, o sinal EdU cobre todos os cromossomos, enquanto em outros núcleos, o sinal EdU localiza-se de um a dois punkta brilhante, provavelmente no cromossomo X, que se replica no final da fase S. O sinal edu de uma rotulagem bem sucedida de 30 minutos se localiza para aproximadamente metade dos núcleos na zona pré-geral.Embora a técnica funcione consistentemente em animais adultos jovens do tipo selvagem, uma fração significativa de hermafroditas de 5 dias de idade não consegue rotular em um pulso EdU de 30 minutos. A duração do G2 pode ser estimada analisando o percentual de núcleos na fase M que são EdU positivos ao longo do curso temporal, permitindo o cálculo da mediana e duração máxima do G2. A duração do G2 e do G1 pode ser estimada a partir do percentual de todos os núcleos da zona pré-geral que são positivos da EdU, permitindo o cálculo da duração máxima das fases combinadas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar o mesmo lote de pratos EdU para minimizar a variabilidade inter-experimental.Após este procedimento, outros métodos como a coloração com anticorpos adicionais podem ser realizados ou responder a perguntas adicionais sobre o ciclo celular, destino celular ou caminhos de sinalização. Não se esqueça que trabalhar com análogos de nucleídeos e parafermeldahyde pode ser perigoso, e que precauções, como o uso de luvas nitrol, devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Avaliação Compreensiva de Germline Chemical Toxicity Usando o Nemátodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Biologia do Desenvolvimento

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

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Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

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O c. elegans intestino como um modelo para intercelular Lumen morfogênese e In Vivo biogênese de membrana polarizada no nível de célula única: rotulagem por anticorpos, RNAi perda--função de análise e de imagem

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Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

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Aplicação de RNAi e calor-choque-induzida expressão de fator de transcrição para reprogramar as células germinativas de neurônios em c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

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Celular agregação ensaios para avaliar a vinculação do entalhe drosófila com Trans-ligantes e sua inibição pelo Cis-ligantes

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

Isolação e mancha de keratinocytes da pele do rato para a análise específica do ciclo de pilha da expressão celular da proteína pela citometria maciça

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...