Name: in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice at JoVE.com

يشكر المؤلفون ساتو ت. وم. كانباياشي كوياما س. للمساعدة التقنية. JSPS كاكينهي منحة أرقام JP15K14322 و JP16H06143، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، مؤسسة النصب التذكاري أوهارا، والتعاونية البحوث المشروع من جامعة نيغاتا الدماغ بحوث المعهد عام 2017-2923 (صاحب الجلالة) وتم تأييد هذا العمل JP16K14559 كاكينهي، JP15H01454، و JP15H04263، ومنحة في البحث العلمي في مجالات الابتكار "التنظيم الديناميكي وظيفة المخ بالخردة وبناء نظام" (JP16H06459) من يأمرون (منظمة الشفافية الدولية).

وينبغي إجراء تجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في مؤسسة المجرب الرفق بالحيوان.
1. إعداد الجراء للتصوير
ملاحظة: الجراء مع الخلايا العصبية القشرية المسماة قليلة ويمكن الحصول في الرحم انهانسر (IUE) الفائق ناقلات5،6. يت?...

<ol>
	<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li><li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination.">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li><li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272 (2005).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-regulated+dynamics+of+layer+4+neuronal+dendrites+during+thalamocortical+reorganization+in+neonates.">NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 35747 (2016).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring:+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity.">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex.">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections.">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice.">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age.">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li><li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion.">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839 (2017).</li><li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates.">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).</li></ol>

خطوات حاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:
أن الخطوة الأكثر أهمية للبروتوكول هو إزالة الجمجمة (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). عند الإدراج، تلتزم شفرة حلاقة غالباً دوراً، مما تسبب في نزيف دورال وتلف الدماغ. ويمكن تجنب هذا بإضافة قطره من المخزن المؤقت اللحاء في الجمجمة و?...

الأسلاك الدقيقة من الدوائر العصبية في قشرة الدماغ ضروري لوظائف الدماغ العليا بما في ذلك التصور، والإدراك، والتعلم والذاكرة. الدوائر القشرية المكررة بشكل حيوي أثناء التطوير بعد الولادة. الدراسات وحققت عملية استخدام تشكيل الدائرة القشرية غذائها و في المختبر تحليلات الثقافة. ومع ذلك، ظلت ديناميات تشكيل الدائرة في الثدييات الحية غير مستكشفة في معظمها.
اثنين-فوتون الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للتحليلات في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس الكبار1،2. ومع ذلك، نظراً للتحديات التقنية، سوى عدد محدود من الدراسات تناولت تشكيل الدوائر العصبية في الفئران حديثي الولادة. على سبيل المثال، يقوم كاريو et al. تصوير مرور الزمن تسلق الألياف في المخيخ في الأسبوع بعد الولادة الثانية3. كيليو بورترا et al. عن تصوير محاور عصبية في الطبقة القشرية 1 في أول أسبوع بعد الولادة4. في الدراسة الحالية، ويمكننا تلخيص بروتوكول لمراقبة طبقة 4 القشرية الخلايا العصبية وعلى dendrites في الفئران حديثي الولادة. وترد النتائج التي تم الحصول عليها بتطبيق هذا البروتوكول، التي تتضمن منهجيات اثنين، في لدينا منشور الأخيرة5. أولاً، نحن نستخدم5،نظام ناقل سوبر نوفا6 لوضع العلامات الفردية من الخلايا العصبية في الدماغ الولدان. في نظام سوبر نوفا، البروتينات الفلورية تستخدم لتسمية الخلايا العصبية الجينات الخاصة بخلية قابلة للصرف والمسمى ضربة قاضية وتحليلات التحرير/خروج المغلوب أيضا ممكنة. ثانيا، نحن تصف إجراء العمليات جراحية لإعداد إطار الجمجمة في الفئران حديثي الولادة الهشة. معا، تسمح هذه المنهجيات في فيفو الملاحظة الفردية الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pK031. TRE-Cre</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)</td>
			<td>Univentor</td>
			<td>8323101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#181;ltiFlex Round (loading tip)</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>13810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (gelatin sponge)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>Low melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-shaped coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unifast 2 (dental cement)</td>
			<td>GC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium bar</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>-</td>
			<td>Injectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spertra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai eHPDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium plate</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 2A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td>
			<td>BITPLANE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice

تصوير اثنين-فوتون أداة قوية للتحليل في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الثدييات. ومع ذلك، توجد عدد محدود من أساليب التصوير في فيفو لفحص أنسجة المخ من الثدييات حديثي الولادة الحية. وهنا يمكننا تلخيص بروتوكول لتصوير الخلايا العصبية القشرية فردية في الفئران حديثي الولادة الحية. يتضمن هذا البروتوكول المنهجيتين التالية: (1) نظام سوبر نوفا لوسم متفرق ومشرق للخلايا العصبية القشرية في الدماغ، و (2) إجراء العمليات جراحية للجمجمة الولدان الهشة. ويسمح هذا البروتوكول مراقبة التغيرات الزمنية لفرادى نيوريتيس القشرية خلال مراحل الأطفال حديثي الولادة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. كما يمكن عن طريق الجمع بين الفائق مع تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينات كريسبر/Cas9 تحرير نظم إسكات الجينات الخاصة بخلية مسماة وخروج المغلوب. هذا البروتوكول، وبالتالي، يمكن لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.

الأرقام في 2D - 2F إظهار نتائج الممثل من تصوير يومين-فوتون الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية القشرية طبقة 4 باستخدام هذا البروتوكول. غرض التحليل، حدد الخلايا العصبية مع مورفولوجيا الجذعية واضحة طوال فترات التصوير. قمنا بتحليل مورفولوجية الجذعية من الخلاي?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice at JoVE.com

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.

في فيفو اثنين-فوتون تصوير الخلايا العصبية القشرية في الفئران حديثي الولادة

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم الأعصاب، وخاصة تلك المتعلقة بتكوين مآخذ الخلايا العصبية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الباحثين يمكنهم تحليل التغيرات المورفولوجية للخلايا العصبية الفردية في الفئران الوليدية الحية. تبدأ مع تخدير يوم ما بعد الولادة خمسة الجرو والمضي قدما فقط في غياب رد فعل على اختبار قرصة الذيل.أولاً، تعقيم فروة الرأس عن طريق مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم، استخدام مقص تعقيم مع 70٪ الإيثانول لإزالة ما يقرب من 20 ملليمتر مربع من الجلد التي تغطي الجمجمة. بعد ذلك ، استخدم ملقطًا معقمة ومسحة قطنية نظيفة غارقة في عازل القشرة ، لإزالة اللفافة للجمجمة.استخدم طرف التحميل لتطبيق لاصق الأنسجة على سطح الجلد المتقزّم لوقف النزيف مع تجنب المنطقة التي سيتم تصويرها. وضع الجرو على وسادة تدفئة أخرى، تعيين إلى 37 درجة مئوية، والسماح لها للتعافي من التخدير. انتظر حوالي 30 دقيقة حتى يجفف النسيج اللاصق ويتوطد.بمجرد أن يجف لاصق الأنسجة ، ابدأ إعداد نافذة الجمجمة على الماوس المُعاد تخديره. تطبيق قطرة واحدة من عازلة القشرة على الجمجمة، ثم استخدام شفرة حلاقة معقمة لفتح بعناية منطقة قطرها ملليمتر واحد من الجمجمة، وترك دورا سليمة. تطبيق عازلة القشرة للحفاظ على سطح الدماغ رطبة.استخدام قطعة صغيرة من الإسفنج الجيلاتين غارقة في عازلة القشرة لوقف أي نزيف. استخدام قطعة جديدة لضغط جانب واحد من استئصال القحف واستنزاف أي العازلة والدم من سطح الدجال دون لمس دورا. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية لإعداد إطار واضح.يجب أن تكون دورا غير التالفة ويجب إزالة الفرشاة من dura المكشوفة. بعد ذلك ، استخدم طرف ماصة لتطبيق طبقة رقيقة من واحد في المئة من agarose منخفض الذوبان ، مذابة في عازلة القشرة. تطبيق جولة، ثلاثة ملليمتر غطاء الزجاج زلة على طبقة هلام agarose.إزالة جميع الفقاعات بين زلة الغطاء وطبقة جل agarose عن طريق صب ما يزيد على هلام agarose بينهما. استخدم الملاقط لإزالة الجل الزائد، جاحظ من تحت زلة الغطاء. مزيج مسحوق الاسمنت وسائل الاسمنت.استخدمي طرف ماصة لتطبيق الخليط على الجمجمة قبل أن يصبح مُتَجَدَّدًا. ثم، إرفاق شريط التيتانيوم المخصصة إلى العظام القحفية باستخدام أسمنت الأسنان. محاذاة شريط التيتانيوم، وغطاء زلة بالتوازي لالتقاط الصور بسهولة.تغطية الجمجمة المكشوفة مع أسمنت الأسنان. ثم، حقن تحت الجلد مسكن. وضع الجرو في قفص الانتعاش على وسادة الحرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة حتى الاسمنت الأسنان قد توطدت.لبدء التصوير، قم أولاً بتعيين الطول الموجي بالليزر ذي الفوتين. لإثارة RFP، استخدم طول موجة من 1000 نانومتر. مسح سطح زلة الغطاء مع 70٪ الإيثانول.إرفاق الجرو تخدير إلى لوحة التيتانيوم على مرحلة التصوير، وذلك باستخدام شريط التيتانيوم. استخدام مرحلة goniometer، لضبط الرأس، بحيث زلة الغطاء موازية للعدسة الهدف. الحفاظ على درجة حرارة الجسم من الجرو أثناء التصوير باستخدام وسادة التدفئة تعيين إلى 37 درجة مئوية وخفض تركيز isoflurane إلى 0.7٪ إلى 1٪ ضع مرحلة التصوير تحت عدسة الهدف 20x من المجهر الفوتون اثنين.ضع قطرة ماء واحدة على زلة الغطاء. تعيين البرنامج للحصول على الصور Z المكدس في فواصل زمنية 1.4 ميكرون. لطبقة أربعة التصوير العصبي، تعيين عرض Z إلى ما بين 150 و 300 ميكرون لتصوير مورفولوجيا التشعب بأكملها.استخدام المسح الضوئي بطيئة ومتوسط للحصول على صور واضحة تظهر مورفولوجيا الخلايا العصبية. وعادة ما يستغرق أكثر من 20 دقيقة للحصول على مورفولوجيا التشعب بأكمله. تُظهر هذه الصورة صورة تمثيلية من Z-stack للطبقة الأربعة الخلايا العصبية القشرية للجرو P5.السهم يشير إلى الخلايا العصبية التي سيتم تحليلها. الخلايا العصبية مع dendrites غير واضحة ينبغي إزالتها من التحليل. تُظهر هذه الصورة صورة تكبير أعلى للخلايا العصبية المشار إليها في الصورة السابقة.تشير رؤوس الأسهم الزرقاء إلى تلميحات التشعب التي سيتم سحبها عند نقطة الوقت التالية، وتشير رؤوس الأسهم البيضاء الصغيرة إلى محور عصبي للخلية المجاورة. بعد 4.5 ساعة، يتم سحب النصائح التشعبية مع رؤوس الأسهم الزرقاء، ويتم ممدود نصائح التشعب مع رؤوس الأسهم الصفراء. يظهر إعادة بناء مورفولوجيا التشعب التمثيلية هنا ، والخلايا العصبية التي تظهر التشعبات المنفصلة كما رأينا هنا ، يجب استبعادها من التحليلات.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم الحفاظ على الجافية سليمة، أثناء العملية. باستخدام هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير الدفعي للإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بنمط نشاط الخلايا العصبية في الدماغ الوليدي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

في التصوير المجراة من الحبل الشوكي عن طريق الماوس ثنائي الفوتون المجهري

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

في الجسم الحي ثنائي الفوتون التصوير من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

في فيفو الميكروسكوب ثنائي الفوتون من النهايات العصبية في الجلد واحدة

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

في وقت واحد ثنائي الفوتون<em&gt; في فيفو</em&gt; تصوير متشابك المدخلات والأهداف بعد المشبكي في اللحاء ماوس خلف الطحال

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

الكمي لشعيري أكتين (F-الأكتين) نقاط وفي الجرذ العصبونات القشرية

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

تصوير الكالسيوم اثنين-فوتون في Dendrites العصبية في الدماغ شرائح

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Visualizing Protein Kinase A Activity In Head-fixed Behaving Mice Using In Vivo Two-photon Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

تصور البروتين كيناز نشاط في الفئران يتصرف الرأس ثابتة باستخدام في فيفو اثنين من الفوتون الفلورة التصوير مدى الحياة المجهرية

Neuromodulation exerts powerful control over brain function. Dysfunction of neuromodulatory systems results in neurological and psychiatric disorders. ...