Name: in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00
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Les auteurs remercient T. Sato, M. Kanbayashi et S. Kouyama pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par JSPS KAKENHI Grant numéros JP15K14322 et JP16H06143, le FNS de Takeda, le Uehara Memorial Foundation et le projet de recherche Collaborative de Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M.) et par KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 et JP15H04263 et Grant-dans la recherche scientifique sur les domaines de l’Innovation « Règlement de dynamique de la fonction cérébrale de Scrap & système de génération » (JP16H06459) du MEXT (T.I.).

Des expériences doivent être effectués conformément aux directives prescrites par l’institution de l’expérimentateur bien-être des animaux.
1. préparation des chiots pour l’imagerie
NOTE : Chiots avec des neurones corticaux faiblement marquées peuvent être obtenues par in utero électroporation (IUE) de vecteurs de Supernova5,6. Le système de la Supernova est constitué des deux vecte...

<ol>
	<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li><li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination.">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li><li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272 (2005).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-regulated+dynamics+of+layer+4+neuronal+dendrites+during+thalamocortical+reorganization+in+neonates.">NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 35747 (2016).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring:+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity.">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex.">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections.">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice.">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age.">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li><li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion.">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839 (2017).</li><li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates.">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).</li></ol>

Des étapes cruciales dans le protocole et le dépannage :
L’étape la plus critique du protocole est l’ablation du crâne (étape 3.2 du protocole). Lors de l’insertion, la lame de rasoir adhère souvent à la dure-mère, provoquant des saignements dural et des dommages au cerveau. Cela peut être évité en ajoutant une goutte de tampon de cortex sur le crâne et en supprimant le crâne dans un tampon de cortex.
Hémorragie de la dure-mère et la peau après q...

Le câblage précis des circuits de neurones dans le cortex cérébral est essentiel pour les fonctions cérébrales supérieures y compris la perception, cognition et apprentissage et la mémoire. Des circuits corticaux sont dynamiquement raffinés au développement postnatal. Des études ont étudié le processus d’utilisation de la formation des circuits corticaux histologique et analyses de la culture in vitro . Toutefois, la dynamique de la formation des circuits chez les mammifères vivants est restée pratiquement inexplorée.
Microscopie biphotonique a été largement utilisée pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau de souris adulte1,2. Toutefois, en raison de difficultés techniques, seulement un nombre limité d’études ont abordé la formation des circuits neuronaux chez des souris nouveau-nées. Par exemple, Carrillo et coll. effectuée l’imagerie Time-lapse de l’escalade des fibres du cervelet dans la deuxième semaine après la naissance3. Portera-Cailliau et coll. ont signalé l’imagerie des axones dans la couche corticale 1 dans la première semaine après la naissance4. Dans la présente étude, nous résumons un protocole pour l’observation des neurones corticaux de couche 4 et leurs dendrites chez des souris nouveau-nées. Obtenu par l’application de ce protocole, qui comprend deux méthodes, les résultats sont présentés dans notre récente publication5. Tout d’abord, nous utilisons la Supernova vector système5,6 pour l’étiquetage différents neurones dans le cerveau néonatal. Dans le système de la Supernova, les protéines fluorescentes utilisées pour l’étiquetage neuronale sont échangeables et étiquetées de gène spécifique des cellules et édition/knockout analyses sont également possibles. En second lieu, nous décrivons une procédure chirurgicale pour la préparation de la fenêtre crânienne en souris néonatales fragiles. Ensemble, ces méthodologies permettent l’observation in vivo des différents neurones dans le cerveau néonatal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pK031. TRE-Cre</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)</td>
			<td>Univentor</td>
			<td>8323101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#181;ltiFlex Round (loading tip)</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>13810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (gelatin sponge)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>Low melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-shaped coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unifast 2 (dental cement)</td>
			<td>GC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium bar</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>-</td>
			<td>Injectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spertra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai eHPDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium plate</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 2A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td>
			<td>BITPLANE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice

L’imagerie biphotonique est un outil puissant pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau des mammifères. Cependant, un nombre limité de méthodes d’imagerie in vivo existe pour examiner le tissu cérébral des mammifères nouveau-nés vivants. Dans les présentes, nous résumons un protocole pour l’imagerie des neurones corticaux individuels dans la vie de souris néonatales. Ce protocole comprend les deux méthodes suivantes : (1) le système de Supernova pour l’étiquetage des rares et lumineux des neurones corticaux dans le développement du cerveau et (2) une intervention chirurgicale pour le crâne fragile néonatale. Ce protocole permet l’observation des changements temporels des neurites corticaux différents stades néonatale avec un rapport signal sur bruit élevé. Silençage génique de cellules spécifiques marqué et élimination directe est possible aussi en combinant la Supernova à l’interférence d’ARN et gène CRISPR/Cas9, systèmes de montage. Ce protocole peut, ainsi, être utilisé pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, mécanismes moléculaires qui régissent la dynamique neuronale et des changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.

Personnages 2D - 2F afficher les résultats représentatifs de l’imagerie Time-lapse deux photons de neurones corticaux de couche 4 à l’aide du présent protocole. Aux fins d’analyse, sélectionnez les neurones avec une morphologie dendritique clair pendant les périodes d’imagerie. Nous avons analysé la morphologie dendritique des neurones imagés à l’aide de logiciels d’analyse morphologique. Reconstruction de morphologie dendritique repr...

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In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Nous présentons une en vivo biphotonique imagerie protocole d’imagerie du cortex cérébral de souris néonatales. Cette méthode convient pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique neuronale et les changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.

In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés en neurosciences, en particulier celles liées à la formation de prises de neurones. Le principal avantage de cette technique est que les chercheurs peuvent analyser les changements morphologiques des neurones individuels chez les souris néonatales vivantes. Commencez par un chiot anesthésié après le cinquième jour natal et procédez seulement en l’absence d’une réaction au test de pincement de la queue.Tout d’abord, stériliser le cuir chevelu en l’essuyant avec 70% d’éthanol. Ensuite, utilisez des ciseaux stérilisés avec 70% d’éthanol pour enlever environ 20 millimètres carrés de la peau couvrant le crâne. Ensuite, utilisez des forceps stériles et un coton-tige propre trempé dans le tampon cortex, pour enlever le fascia du crâne.Utilisez une pointe de chargement pour appliquer l’adhésif tissulaire sur la surface incisée de la peau pour arrêter le saignement tout en évitant la zone à image. Placez le chiot sur un autre coussin chauffant, fixé à 37 degrés Celsius, et laissez-le récupérer de l’anesthésie. Attendez environ 30 minutes jusqu’à ce que l’adhésif tissulaire ait séché et solidifié.Une fois que l’adhésif tissulaire a séché, commencer la préparation de la fenêtre crânienne sur la souris ré-anesthésiée. Appliquez une goutte de tampon de cortex sur le crâne, puis utilisez une lame stérile de rasoir pour ouvrir soigneusement une zone d’un millimètre de diamètre du crâne, laissant la dura intacte. Appliquer le tampon du cortex pour garder la surface du cerveau humide.Utilisez un petit morceau d’éponge gélatineux trempé dans le tampon du cortex pour arrêter tout saignement. Utilisez un morceau frais pour compresser un côté de la craniotomie et drainer tout tampon et le sang de la surface durale sans toucher le dura. Il s’agit de l’étape la plus critique pour préparer une fenêtre claire.Le dura doit être intact et la brosse doit être retirée du dura exposé. Ensuite, utilisez une pointe de pipette pour appliquer une fine couche d’agarose fondante d’un pour cent faible, dissoute dans le tampon du cortex. Appliquer un couvercle en verre rond de trois millimètres sur la couche de gel agarose.Enlevez toutes les bulles entre le glissement de couverture et la couche de gel d’agarose en versant au-delà du gel d’agarose entre eux. Utilisez des pinces à épiler pour enlever l’excès de gel, en saillie sous le bordereau de couverture. Mélanger la poudre de ciment et le liquide cimenté.Utilisez une pointe de pipette pour appliquer le mélange sur le crâne avant qu’il ne se solidifie. Ensuite, fixez une barre de titane sur mesure à l’os crânien à l’aide de ciment dentaire. Alignez la barre de titane, et le glissement de couverture en parallèle pour capturer facilement des images.Couvrir le crâne exposé de ciment dentaire. Ensuite, injectez subcutanément un analgésique. Placez le chiot dans une cage de récupération sur un coussin chauffant de 37 degrés Celsius pendant une heure jusqu’à ce que le ciment dentaire se soit solidifié.Pour commencer l’imagerie, réglez d’abord la longueur d’onde laser à deux photons. Pour l’excitation de la DP, utilisez une longueur d’onde de 1000 nanomètres. Essuyer la surface du bordereau de couverture avec 70% d’éthanol.Fixez le chiot anesthésié à la plaque de titane au stade d’imagerie, à l’aide de la barre de titane. Utilisez le stade goniomètre, pour ajuster la tête, de sorte que le glissement de couverture est parallèle à la lentille objective. Maintenir la température corporelle du chiot pendant l’imagerie à l’aide d’un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius et réduire la concentration d’isoflurane à 0,7 % à 1 %Placez l’étape d’imagerie sous la lentille objective 20x des deux microscopes photons.Appliquer une goutte d’eau sur le bordereau de couverture. Réglez le logiciel pour acquérir des images Z-stack à intervalles de 1,4 micron. Pour l’imagerie neuronale de la couche quatre, réglez la largeur Z entre 150 et 300 microns pour l’image de toute la morphologie dendritique.Utilisez la numérisation lente et la moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale. Il faut généralement plus de 20 minutes pour acquérir toute la morphologie dendritique. Cette image montre une image représentative Z-stack de la couche quatre neurones corticals de chiot P5.La flèche indique le neurone à analyser. Les neurones avec des dendrites flous doivent être retirés de l’analyse. Cette image montre une image de grossissement plus élevée du neurone indiqué dans l’image précédente.Les pointes de flèche bleues indiquent des pointes dendritiques qui seront rétractées au point suivant, et les petites pointes de flèche blanches indiquent l’axon d’une cellule voisine. Après 4,5 heures, les pointes dendritiques avec des pointes de flèche bleues sont rétractées, et les pointes dendritiques avec des pointes de flèche jaunes sont allongées. Une reconstruction de morphologie dendritique représentative est montrée ici, les neurones montrant des dendrites déconnectés comme on le voit ici, devraient être exclus des analyses.Tout en essayant cette procédure, il est important de garder le dura intact, pendant le processus. En utilisant cette procédure, d’autres méthodes comme dans l’imagerie de propulsion peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires liées au modèle d’activité neuronale dans le cerveau néonatal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

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Une technique de la fenêtre mince crâne pour chronique à deux photons In vivo</emImagerie> de Murine microglies dans les modèles de la neuro-inflammation

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