Name: in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00
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Die Autoren danken T. Sato, M. Kanbayashi und S. Kouyama für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von JSPS KAKENHI Zuschuss Zahlen JP15K14322 und JP16H06143, der Takeda Science Foundation, Uehara Memorial Foundation und das kollaborative Forschung Projekt von Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) und unterstützt. KAKENHI JP16K14559, JP15H01454, und JP15H04263 und Grant-in wissenschaftliche Forschung auf Innovationsfelder "Dynamische Regelung der Funktion des Gehirns von Schrott & Build-System" (JP16H06459) von MEXT (TI).

Experimente sollten gemäß den Tierschutz-Richtlinien vorgeschrieben durch den Experimentator Institution durchgeführt werden.
1. Vorbereitung der Welpen für die Bildgebung
Anmerkung: Welpen mit spärlich beschrifteten kortikale Neuronen in Utero Elektroporation (IUE) Supernova Vektoren5,6erhalten Sie durch. Das Supernova-System besteht aus den folgenden beiden Vektoren: TRE-Cre und CAG-LoxP-STOP-L...

<ol>
	<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li><li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination.">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li><li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272 (2005).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-regulated+dynamics+of+layer+4+neuronal+dendrites+during+thalamocortical+reorganization+in+neonates.">NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 35747 (2016).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring:+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity.">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex.">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections.">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice.">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age.">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li><li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion.">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839 (2017).</li><li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates.">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).</li></ol>

Wichtige Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung:
Der wichtigste Schritt des Protokolls ist die Entfernung des Schädels (Protokoll Schritt 3.2). Beim einsetzen hält sich die Rasierklinge häufig an der Dura, durale Blutungen und Schädigung des Gehirns verursacht. Dies kann vermieden werden, durch Hinzufügen von einen Tropfen des Kortex Puffer auf den Schädel und Entfernen des Schädels im Kortex Puffer.
Blutungen aus der Dura und der Haut nach der kranialen Fenst...

Die genaue Verdrahtung von neuronalen Schaltkreisen in der Großhirnrinde ist unerlässlich für die höheren Hirnfunktionen wie Wahrnehmung, Kognition, und lernen und Gedächtnis. Kortikale Schaltungen werden während der postnatalen Entwicklung dynamisch verfeinert. Studien haben den Prozess der kortikalen Schaltung Bildung mit histologischen und in-vitro- Kultur-Analysen untersucht. Allerdings hat die Dynamik der Schaltung Bildung in lebenden Säugetieren meist unerforscht.
Zwei-Photonen-Mikroskopie hat für die in Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn Erwachsener Mäuse1,2verbreitet worden. Aufgrund technischen Herausforderungen, haben jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Studien neuronale Schaltkreis Bildung bei Neugeborenen Mäusen angesprochen. Carrillo Et Al. durchgeführt zum Beispiel die Zeitraffer-Bildgebung des Kletterns Fasern im Kleinhirn im zweiten postnatalen Woche3. Tür-Cailliau Et Al. berichteten die Bildgebung der Axone in kortikalen Schicht 1 in der ersten postnatalen Woche4. In der vorliegenden Studie fassen wir ein Protokoll für die Beobachtung der Schicht 4 kortikalen Neuronen und ihre Dendriten bei Neugeborenen Mäusen. Ergebnisse, die durch die Anwendung dieses Protokolls, die zwei Methoden umfasst, werden in unseren jüngsten Veröffentlichung5gemeldet. Erstens verwenden wir die Supernova Vektor System5,6 zur Kennzeichnung einzelner Neuronen im neonatalen Gehirn. Im Supernova System fluoreszierende Proteine verwendet für die neuronale Kennzeichnung sind austauschbar und beschriftete Zelle-spezifischen gen-Knockdown und Bearbeitung/ko Analysen sind ebenfalls möglich. Zweitens, beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff für die Vorbereitung der kranialen Fenster in fragilen Neugeborenen Mäusen. Zusammen ermöglichen diese Methoden die in Vivo -Beobachtung von einzelnen Neuronen im neonatalen Gehirn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pK031. TRE-Cre</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)</td>
			<td>Univentor</td>
			<td>8323101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#181;ltiFlex Round (loading tip)</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>13810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (gelatin sponge)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>Low melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-shaped coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unifast 2 (dental cement)</td>
			<td>GC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium bar</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>-</td>
			<td>Injectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spertra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai eHPDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium plate</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 2A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td>
			<td>BITPLANE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice

Zwei-Photon Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die in-Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn von Säugetieren. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von in Vivo bildgebende Verfahren für die Prüfung des Hirngewebes live Neugeborenen Säugetiere. Hier fassen wir ein Protokoll zur Aufnahme einzelner kortikaler Neuronen in lebenden Neugeborenen Mäusen. Dieses Protokoll enthält die folgenden beiden Methoden: (1) der Supernova-System zur spärlich und helle Beschriftung der kortikalen Neuronen in das sich entwickelnde Gehirn und (2) ein chirurgischer Eingriff für die fragile neonatale Schädel. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung des zeitlichen Veränderungen der einzelnen kortikalen Neuriten in neonatale Phase mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Beschriftete Zelle-spezifischen gen-silencing und Knockout können auch erreicht werden, indem die Supernova mit RNA-Interferenz und CRISPR/Cas9 gen Schnittsysteme. Dieses Protokoll kann so verwendet werden, für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen zu kontrollieren.

Figuren-2D - 2F zeigen repräsentative Ergebnisse der zwei-Photonen Zeitraffer Bildgebung der Schicht 4 kortikale Neuronen unter Verwendung dieses Protokolls. Wählen Sie zum Zwecke der Analyse Neuronen mit klaren dendritischen Morphologie in der bildgebenden Epochen. Wir analysieren die dendritische Morphologie des abgebildeten Neuronen mit morphologischen Analysesoftware. Repräsentative dendritischen Morphologie Rekonstruktion zeigt <strong class="xfig...

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In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.

In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Diese Methode kann helfen, schlüsselwichtige Fragen in der Neurowissenschaft zu beantworten, vor allem diejenigen im Zusammenhang mit Neuron Encke-Bildung. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Forscher die morphologischen Veränderungen einzelner Neuronen bei lebenden neonatalen Mäusen analysieren können. Beginnen Sie mit einem anästhesierten postnatalen Tag fünf Welpen und gehen Sie nur in Ermangelung einer Reaktion auf den Schwanz Pinch Test.Zuerst sterilisieren Sie die Kopfhaut, indem Sie sie mit 70% Ethanol abwischen. Verwenden Sie dann eine mit 70% Ethanol sterilisierte Schere, um etwa 20 Quadratmillimeter der Schädeldecke zu entfernen. Als nächstes verwenden Sie sterile Zangen und einen sauberen Wattestäbchen in Kortexpuffer getränkt, um die Faszien des Schädels zu entfernen.Verwenden Sie eine Ladespitze, um Gewebekleber auf die eingeschnittene Hautoberfläche aufzutragen, um die Blutung zu stoppen und gleichzeitig den zu bebildernden Bereich zu vermeiden. Legen Sie den Welpen auf ein anderes Heizkissen, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn von der Anästhesie erholen. Warten Sie ca. 30 Minuten, bis der Gewebekleber getrocknet und verfestigt ist.Sobald der Gewebekleber getrocknet ist, beginnen Sie mit der Kranfenstervorbereitung an der neu anästhesierten Maus. Tragen Sie einen Tropfen Kortexpuffer auf den Schädel auf, und verwenden Sie dann eine sterile Rasierklinge, um vorsichtig einen Bereich mit einem Durchmesser von einem Millimeter des Schädels zu öffnen, so dass die Dura intakt bleibt. Tragen Sie den Kortexpuffer auf, um die Gehirnoberfläche feucht zu halten.Verwenden Sie ein kleines Stück Gelatineschwamm in Kortexpuffer getränkt, um jede Blutung zu stoppen. Verwenden Sie ein frisches Stück, um eine Seite der Kraniotomie zu komprimieren und entleeren Sie jeden Puffer und Blut von der Duraloberfläche, ohne die Dura zu berühren. Dies ist der wichtigste Schritt, um ein klares Fenster vorzubereiten.Die Dura muss unbeschädigt sein und die Bürste sollte von der freiliegenden Dura entfernt werden. Als Nächstes verwenden Sie eine Pipettenspitze, um eine dünne Schicht von einem Prozent niedriger Schmelzagarose aufzutragen, die im Kortexpuffer gelöst ist. Tragen Sie einen runden, drei Millimeter langen Glasdeckel auf die Agarose-Gelschicht auf.Entfernen Sie alle Blasen zwischen dem Deckelschlupf und der Agarose-Gelschicht, indem Sie mehr als Agarose-Gel zwischen sie gießen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das überschüssige Gel zu entfernen, das unter dem Deckschein hervorragt. Mischen Sie Zementpulver und die Zementflüssigkeit.Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Mischung auf den Schädel aufzutragen, bevor sie verfestigt wird. Dann befestigen Sie eine maßgeschneiderte Titanstange mit Zahnzement am Schädelknochen. Richten Sie den Titanbalken aus, und der Deckelschlupf parallel, um Bilder einfach zu erfassen.Bedecken Sie den freiliegenden Schädel mit Zahnzement. Dann, subkutan injizieren ein Schmerzmittel. Legen Sie den Welpen in einem Erholungskäfig auf einem 37 Grad Celsius Heizkissen für eine Stunde, bis der Zahnzement erstarrt ist.Um mit der Bildgebung zu beginnen, legen Sie zunächst die Wellenlänge des Zweiphotonenlasers fest. Verwenden Sie für die RFP-Erregung eine Wellenlänge von 1000 Nanometern. Wischen Sie die Oberfläche des Deckelschlupfes mit 70% Ethanol ab.Befestigen Sie den anästhesierten Welpen mit der Titanstange an der Titanplatte auf der Bildstufe. Verwenden Sie die Goniometer-Stufe, um den Kopf so einzustellen, dass der Deckschein parallel zur Objektivlinse ist. Halten Sie die Körpertemperatur des Welpen während der Bildgebung mit einem Auf 37 Grad Celsius eingestellten Heizpad aufrecht und reduzieren Sie die Isoflurankonzentration auf 0,7% bis 1%Stellen Sie die Bildstufe unter die 20-fache Objektivlinse der beiden Photonenmikroskop.Tragen Sie einen Tropfen Wasser auf den Deckelzettel auf. Stellen Sie die Software so ein, dass Z-Stack-Bilder in 1,4-Mikron-Intervallen erfasst werden. Für Die Neuronenbildgebung der Schicht 4 stellen Sie die Z-Breite auf 150 bis 300 Mikrometer fest, um die gesamte dendritische Morphologie abzubilden.Verwenden Sie langsames Scannen und Mittelung, um klare Bilder zu erhalten, die die neuronale Morphologie zeigen. Es dauert in der Regel mehr als 20 Minuten, um die gesamte dendritische Morphologie zu erwerben. Dieses Bild zeigt ein repräsentatives Z-Stack-Bild der Schicht vier kortikale Neuronen von P5 Welpen.Der Pfeil zeigt das zu analysierende Neuron an. Neuronen mit verschwommenen Dendriten sollten aus der Analyse entfernt werden. Dieses Bild zeigt ein höheres Vergrößerungsbild des angezeigten Neurons im vorherigen Bild.Blaue Pfeilspitzen zeigen dendritische Spitzen an, die beim nächsten Zeitpunkt zurückgezogen werden, und die kleinen weißen Pfeilspitzen zeigen das Axon einer benachbarten Zelle an. Nach 4,5 Stunden werden die dendritischen Spitzen mit blauen Pfeilspitzen zurückgezogen und die dendritischen Spitzen mit gelben Pfeilspitzen gestreckt. Hier wird eine repräsentative dendritische Morphologierekonstruktion gezeigt, Neuronen, die getrennte Dendriten zeigen, wie hier zu sehen, sollten von den Analysen ausgeschlossen werden.Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Dura während des Prozesses intakt zu halten. Mit diesem Verfahren können andere Methoden wie in der Antriebsbildgebung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit dem Neuronenaktivitätsmuster im neonatalen Gehirn zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

In-vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie einzelner Nervenenden in der Haut

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

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Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

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Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

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Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

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