Name: in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice
Uploaded: 2018-10-18T14:00:00
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Gli autori ringraziano T. Sato, M. Kanbayashi e S. Kouyama per la loro assistenza tecnica. Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numeri JP15K14322 e JP16H06143, la Takeda Science Foundation, la Fondazione Memorial Uehara e il Collaborative Research Project di Niigata University Brain Research Institute 2017-2923 (H.M) e da KAKENHI JP16K14559, JP15H01454 e JP15H04263 e Grant-in ricerca scientifica sulle aree dell'innovazione "Regolazione dinamica della funzione del cervello di Scrap & Build System" (JP16H06459) dal MEXT (T.I.).

Gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità delle direttive sul benessere degli animali prescritte dall'istituzione dello sperimentatore.
1. preparazione dei cuccioli per l'Imaging
Nota: Cuccioli con scarsamente etichettati neuroni corticali ottenibili mediante elettroporazione in utero (IUE) di Supernova vettori5,6. Il sistema di Supernova consiste di seguenti due vettori: TRE-Cre e CAG-lox...

<ol>
	<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo.">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li><li>Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+dendritic+spine+stability+in+the+adult+cortex.">Long-term dendritic spine stability in the adult cortex.</a> Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).</li><li>Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+translocation+establishes+the+winner+in+cerebellar+climbing+fiber+synapse+elimination.">Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).</li><li>Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+modes+of+axon+elaboration+in+the+developing+neocortex.">Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex.</a> PLoS Biology. , e272 (2005).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDAR-regulated+dynamics+of+layer+4+neuronal+dendrites+during+thalamocortical+reorganization+in+neonates.">NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates.</a> Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).</li><li>Luo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supernova:+A+Versatile+Vector+System+for+Single-Cell+Labeling+and+Gene+Function+Studies+in+vivo.">Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo.</a> Scientific Reports. 6, 35747 (2016).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+activity-dependent+cortical+wiring:+formation+of+interhemispheric+connections+in+neonatal+mouse+visual+cortex+requires+projection+neuron+activity.">Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+neuronal+activity+supports+the+axon+development+of+callosal+projection+neurons+during+different+post-natal+periods+in+the+mouse+cerebral+cortex.">Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex.</a> European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).</li><li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window.">Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li><li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca(2+)+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Mizuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patchwork-Type+Spontaneous+Activity+in+Neonatal+Barrel+Cortex+Layer+4+Transmitted+via+Thalamocortical+Projections.">Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections.</a> Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).</li><li>Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+double+markers+in+mice.">Mosaic analysis with double markers in mice.</a> Cell. 121 (3), 479-492 (2005).</li><li>Young, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-neuron+labeling+with+inducible+Cre-mediated+knockout+in+transgenic+mice.">Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+Repeated+Exposure+to+Isoflurane+not+Sevoflurane+in+Mice+Reversibly+Impaired+Spatial+Cognition+at+Juvenile-Age.">Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age.</a> Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).</li><li>Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+calcium+imaging+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+hippocampus+without+cortical+invasion.">Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion.</a> eLIFE. 6, e26839 (2017).</li><li>Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+dynamics+of+cortical+neuron+dendritic+trees+revealed+by+long-term+in+vivo+imaging+in+neonates.">Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates.</a> Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).</li></ol>

Fasi critiche nel protocollo e risoluzione dei problemi:
La fase più critica del protocollo è la rimozione del cranio (passo 3.2 del protocollo). Al momento dell'inserimento, la lama di rasoio spesso aderisce al dura, provocando sanguinamenti dural e danni al cervello. Questo può essere evitato aggiungendo una goccia di tampone di corteccia sul cranio e rimuovendo il cranio nel buffer di corteccia.
Sanguinamento da dura e la pelle dopo preparazione cranica finestra ...

Il cablaggio preciso di circuiti neuronali nella corteccia cerebrale è essenziale per le funzioni cerebrali superiori tra cui percezione, cognizione e apprendimento e memoria. Circuiti corticali sono dinamicamente raffinati durante lo sviluppo postnatale. Studi hanno studiato il processo di utilizzo di circuito corticale formazione istologica e analisi di coltura in vitro . Tuttavia, le dinamiche di formazione del circuito in mammiferi viventi sono rimasta per lo più inesplorata.
Microscopia del due-fotone è stato ampiamente utilizzata per le analisi in vivo di circuiti neuronali al cervello di topo adulto1,2. Tuttavia, a causa di problemi tecnici, solo un limitato numero di studi hanno affrontato la formazione di circuiti neuronali in topi neonati. Ad esempio, Carrillo et al. eseguita l'imaging time-lapse di arrampicata fibre nel cervelletto in seconda settimana postnatale3. Portera-Cailliau et al ha segnalato l'imaging degli assoni in strato corticale 1 nel primo postnatale settimana4. Nello studio presente, riassumiamo un protocollo per l'osservazione dei neuroni corticali di livello 4 e loro dendriti in topi neonati. Risultati ottenuti dall'applicazione del presente protocollo, che comprende due metodologie, sono riportati nella nostra recente pubblicazione5. In primo luogo, utilizziamo la Supernova vettore sistema5,6 per le etichette dei singoli neuroni nel cervello neonatale. Nel sistema Supernova, le proteine fluorescenti utilizzate per l'etichettatura di un neurone sono atterramento intercambiabili e con etichetta gene cellula-specifico e analisi di modifica/eliminazione diretta sono anche possibili. In secondo luogo, descriviamo una procedura chirurgica per la preparazione di finestra cranica in topi neonatali fragili. Insieme, queste metodologie consentono l'osservazione in vivo di singoli neuroni nel cervello neonatale.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>pK031. TRE-Cre</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from RIKEN BRC and Addgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Available from authors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Wako</td>
			<td>099-06571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)</td>
			<td>Univentor</td>
			<td>8323101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond (tissue adhesive)</td>
			<td>3M</td>
			<td>084-1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M&#181;ltiFlex Round (loading tip)</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>13810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (gelatin sponge)</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>09-0353-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9793</td>
			<td>Low melting point</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-shaped coverslip</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unifast 2 (dental cement)</td>
			<td>GC</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium bar</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 1G)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl (carprofen)</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td>-</td>
			<td>Injectable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-photon microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM7MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium-sapphire laser</td>
			<td>Spertra-Physics</td>
			<td>Mai-Tai eHPDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titanium plate</td>
			<td>Authors</td>
			<td>-</td>
			<td>Custom made (see Figure 2A)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro</td>
			<td>BITPLANE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goniometer stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>GN2/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice

Imaging del due-fotone è un potente strumento per l'analisi in vivo di circuiti neuronali nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, un numero limitato di metodi di imaging in vivo esiste per l'esame del tessuto di cervello di mammiferi neonati dal vivo. Qui riassumiamo un protocollo per l'imaging di singoli neuroni corticali in topi neonatali vivente. Questo protocollo comprende le seguenti due metodologie: (1) il sistema di Supernova per radi e luminosi etichettatura dei neuroni corticali nel cervello in via di sviluppo e (2) una procedura chirurgica per il fragile cranio neonatale. Questo protocollo permette l'osservazione dei cambiamenti temporali dei singoli neurites corticali durante fasi neonatale con un elevato rapporto segnale-rumore. Con etichetta cellula-specifico del silenziamento genico e knockout può essere ottenute anche combinando la Supernova con gene CRISPR/Cas9 sistemi di editing e di interferenza del RNA. Questo protocollo può, quindi, essere utilizzato per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, meccanismi molecolari che controllano la dinamica neuronale e cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

Figure 2D - 2F Visualizza risultati rappresentativi di due fotoni time-lapse imaging dei neuroni corticali strato 4 utilizzando il presente protocollo. Ai fini dell'analisi, selezionare i neuroni con morfologia chiaro dendritica durante i periodi di formazione immagini. Abbiamo analizzato la morfologia dendritica dei neuroni imaged utilizzando software di analisi morfologica. Ricostruzione di morfologia dentritica rappresentativo è mostrato nella <strong...

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In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nelle neuroscienze, in particolare quelle relative alla formazione della presa neuronale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i ricercatori possono analizzare i cambiamenti morfologici dei singoli neuroni nei topi neonatali viventi. Inizia con un cucciolo anestetizzato del quinto giorno post-natale e procedi solo in assenza di una reazione al test di avvicinamento delle dita della coda.In primo luogo, sterilizzare il cuoio capelluto pulerlo con il 70% di etanolo. Quindi, utilizzare forbici sterilizzate con 70%etanolo per rimuovere circa 20 millimetri quadrati della pelle che copre il cranio. Successivamente, utilizzare forcep sterili e un batuffolo di cotone pulito imbevuto di tampone di corteccia, per rimuovere la fascia del cranio.Utilizzare una punta di carico per applicare l'adesivo tissutale sulla superficie della pelle incisa per fermare il sanguinamento evitando l'immagine dell'area. Posizionare il cucciolo su un altro pad riscaldante, impostato su 37 gradi Celsius, e consentirgli di riprendersi dall'anestesia. Attendere circa 30 minuti fino a quando l'adesivo tissutale non si è asciugato e solidificato.Una volta che l'adesivo tissutale si è asciugato, inizia la preparazione della finestra cranale sul topo riaestetizzato. Applicare una goccia di tampone di corteccia sul cranio, quindi utilizzare una lama di rasoio sterile per aprire con cura un'area di diametro di un millimetro del cranio, lasciando intatta la dura. Applicare il tampone della corteccia per mantenere la superficie cerebrale umida.Utilizzare un piccolo pezzo di spugna di gelatina imbevuta di tampone di corteccia per fermare qualsiasi sanguinamento. Utilizzare un pezzo fresco per comprimere un lato della craniotomia e drenare qualsiasi tampone e sangue dalla superficie dura senza toccare la dura. Questo è il passaggio più critico per preparare una finestra chiara.La dura deve essere intatta e il pennello deve essere rimosso dalla dura esposta. Quindi, utilizzare una punta di pipetta per applicare uno strato sottile di agarosio a bassa fusione dell'uno per cento, sciolto nel tampone della corteccia. Applicare una copertura rotonda in vetro di tre millimetri sullo strato di gel di agarosio.Rimuovere tutte le bolle tra lo scivolo di copertura e lo strato di gel di agarosio versando in eccesso il gel di agarosio tra di loro. Utilizzare le pinzette per rimuovere il gel in eccesso, sporgendo da sotto lo scivolo di copertura. Mescolare la polvere di cemento e il liquido cementicolo.Utilizzare una punta di pipetta per applicare la miscela sul cranio prima che si solidifica. Quindi, attaccare una barra di titanio su misura all'osso cranicio usando cemento dentale. Allineare la barra in titanio e il coperchio scivolare in parallelo per acquisire facilmente le immagini.Coprire il cranio esposto con cemento dentale. Quindi, iniettare per via sottocutanea un analgesico. Mettere il cucciolo in una gabbia di recupero su un dissipatore di calore di 37 gradi Celsius per un'ora fino a quando il cemento dentale non si è solidificato.Per iniziare l'imaging, impostare prima la lunghezza d'onda del laser a due fotoni. Per l'eccitazione RFP, utilizzare una lunghezza d'onda di 1000 nanometri. Pulire la superficie del coperchio scivolare con il 70% di etanolo.Attaccare il cucciolo anestetizzato alla piastra di titanio sullo stadio di imaging, utilizzando la barra di titanio. Utilizzare lo stadio del goniometro, per regolare la testa, in modo che lo slittamento del coperchio sia parallelo all'obiettivo. Mantenere la temperatura corporea del cucciolo durante l'imaging utilizzando una pastiglia di riscaldamento impostata su 37 gradi Celsius e ridurre la concentrazione di isoflurane allo 0,7%-1%Posizionare la fase di imaging sotto la lente obiettivo 20x del microscopio a due fotoni.Applicare una goccia d'acqua sullo scivolo di copertura. Impostare il software per acquisire immagini Z-stack a intervalli di 1,4 micron. Per l'imaging neuronale di quarto livello, impostare la larghezza Z tra 150 e 300 micron per l'immagine dell'intera morfologia dendritica.Usa la scansione lenta e la media per ottenere immagini chiare che mostrano la morfologia neuronale. Di solito ci vogliono più di 20 minuti per acquisire l'intera morfologia dendritica. Questa immagine mostra un'immagine rappresentativa z-stack dei quattro neuroni corticali di livello quattro del cucciolo P5.La freccia indica il neurone da analizzare. I neuroni con dendriti sfocati devono essere rimossi dall'analisi. Questa immagine mostra un'immagine di ingrandimento più elevata del neurone indicato nell'immagine precedente.Le punte delle frecce blu indicano punte dendritiche che verranno ritirate al momento successivo, e le piccole punte di freccia bianche indicano l'assone di una cella vicina. Dopo 4,5 ore, le punte dendritiche con punte di freccia blu vengono retratti e le punte dendritiche con punte di freccia gialle sono allungate. Qui viene mostrata una ricostruzione rappresentativa della morfologia dendritica, i neuroni che mostrano dendriti disconnessi come visto qui, dovrebbero essere esclusi dalle analisi.Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere intatta la dura, durante il processo. Utilizzando questa procedura, altri metodi come nell'imaging di propulsione possono essere eseguiti per rispondere ad altre domande relative al modello di attività neuronale nel cervello neonatale.

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