Name: 3-d cell culture system for studying invasion and evaluating therapeutics in bladder cancer
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00
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Die Autoren möchten das Labor von Dr. Howard Crawford (University of Michigan) für technische Unterstützung und Bereitstellung von Materialien und Ausrüstung für diese Studie und Alan Kelleher für den technischen Support zu danken.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der University of Michigan Rogel Cancer Center Core Grant CA046592-26S3, NIH K08 CA201335-01A1 (PLP), BCAN Jia (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS) finanziert.

(1) wachsenden Krebs Sphäroide
<ol><li>
Anbau von Zelllinien
	<ol>
<li>Kultur menschlichen Blase Krebszellen unter herkömmlichen Anhänger Zelle Kulturbedingungen und pflegen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2geliefert. Halten Zellen an < 90 % Konfluenz. Hinweis: Kulturmedien verwendet ist Dulbeccos minimalen wesentlichen Medien (DMEM) mit 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin, 110 mg/L Natrium Pyruvat, modifiziert und mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) in dieses Protokoll geliefert.</li>
...

<ol>
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Hier beschreiben wir eine 3-d-Tumor-Sphäroid-Modell, die Echtzeit-Beobachtung der Blase Krebs Invasion ermöglicht die für Krebs Progression und Metastasierung von entscheidender Bedeutung ist. Dieses System ist offen für die Einbeziehung der verschiedenen Stromazellen und zellulären Komponenten erlauben Ermittler besser zusammenfassend Gewebe Mikroumgebung wo Blase Krebs Invasion stattfindet. Blase Krebs Sphäroide können aus verschiedenen Quellen wie Zell-Linien (einschließlich genetisch veränderter Zelllinien f...

Invasion ist ein wichtiger Schritt bei Tumorprogression, die Metastasen gefordert, und ist verbunden mit niedrigeren überleben und schlechter Prognose bei Patienten. In der menschlichen Blasenkrebs, am häufigsten Malignome der Harnwege verursacht etwa 165.000 Todesfälle pro Jahr weltweit, krebsstadium, Behandlung und Prognose direkt das Vorhandensein oder Fehlen von Invasion1beziehen sich auf. Rund 75 % der Fälle von Blasenkrebs werden nicht-Muskel invasive und sind mit lokalen Resektion verwaltet. Im Gegensatz dazu Muskel-invasive Blase Krebs (ca. 25 % aller Fälle) sind aggressive Tumoren mit hoher metastasierendem und werden mit aggressiven Multimodalität Therapie2,3behandelt. Daher ist es wichtig, um das Risiko der invasiven Progression besser charakterisieren und therapeutische Interventionen zu entwickeln, die invasive Fortschreiten verhindern können, Verständnis der molekularen Signalwege, die Invasion auslösen.
Invasive Tumorprogression tritt in einem komplexen Umfeld für dreidimensionale (3D) und beinhaltet Tumor Zelle Interaktion mit anderen Tumorzellen, Stroma, Basalmembran und andere Arten von Zellen wie Immunzellen, Fibroblasten, Muskelzellen und vaskuläre Endothelzellen. Durchlässige Unterstützung (z.B.Transwell) Assay-Systeme werden häufig eingesetzt, um Krebs Zelle Invasion4, aber diese Systeme quantitate sind begrenzt, weil sie nicht erlauben, mikroskopische Überwachung des Invasion in Echtzeit und die Entnahme von Proben für weitere Färbung und molekulare Analyse ist eine Herausforderung. Entwicklung eines 3-d-Blase Tumor Sphäroid Invasion zu studieren ist wünschenswert, weil dadurch die Aufnahme von definierten microenvironmental Komponenten mit dem Komfort einer in-vitro- Systeme.
In diesem Protokoll beschreiben wir ein System, um die invasiven Prozesse der menschlichen Blase Krebszellen mit einem 3-d-Sphäroid Invasion Assay mit Kollagen-basierten Gel Matrizen und konfokalen Mikroskopie damit Ermittler Zelle Motilität überwachen zu verhören und Invasion in Echtzeit (Abb. 1A). Dieses System ist vielseitig und kann geändert werden, um verschiedene Stromatumoren Tumor/Einstellungen zu befragen. Es kann die meisten Blase Krebs-Zell-Linien oder primäre Blase Tumoren und zusätzliche Stromazellen Zellen enthalten, wie z. B. Krebs Fibroblasten und Immunzellen5,6,7verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine Matrix, bestehend aus Kollagen Typ 1, aber kann geändert werden, um andere Moleküle wie FIBRONEKTIN, Laminin oder andere Proteine Kollagen zu integrieren. Invasive Verfahren können für 72 h oder länger je nach der Fähigkeit, das Mikroskop und das verwendete verfolgt werden. Fixierung und Immunfluoreszenz-Färbung des Tumors in der 3-d-Matrix eingebettet, vor, während und nach dem Einmarsch ermöglicht das Verhör von Proteinen hochreguliert in invasive Zellen, wodurch wichtige Informationen, die normalerweise nicht vorhanden oder schwierig zu sammeln Verwendung von anderen 3-d-Kultur-Modellen. Dieses System kann auch genutzt werden, zu Bildschirm-Verbindungen, die Invasion zu blockieren und Signalwege, die solche Verbindungen betroffen abzugrenzen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1511px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:612px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">DMEM cell culture medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:169px;">A3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar Ultral-low attachment 6-well cluster&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:169px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;">491206-0001-000</td>
			<td>General use for cell culture and checking spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type 1 from rat tail, high concentration&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:169px;">354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">155382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;">LSM800</td>
			<td>A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat micromtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:169px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zen 2 Image processing software&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:169px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:169px;">H4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">O.C.T compound&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">23730571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342 solution&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-ATDC (Trim29) antibody</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:169px;">HPA020053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:169px;">ab7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-Vimentin antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:169px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d cell culture system for studying invasion and evaluating therapeutics in bladder cancer

Blasenkrebs ist eine erhebliche gesundheitliche Problem. Es wird geschätzt, dass mehr als 16.000 Menschen in diesem Jahr in den Vereinigten Staaten von Blasenkrebs sterben. Während 75 % der Krebserkrankungen der Blase sind nicht-invasiv und unwahrscheinlich zu metastasieren, Fortschritte machen etwa 25 % ein invasives Wachstum Muster. Bis zur Hälfte der Patienten mit invasiven Krebsarten entwickeln tödliche Metastasen Rückfall. Daher ist es entscheidend, Vorhersagen, Behandlungsergebnisse zu vermeiden tödliche Metastasen, Verständnis des Mechanismus der invasiven Progression bei Blasenkrebs. In diesem Artikel präsentieren wir ein dreidimensionales Krebs Invasion Modell, das ermöglicht die Einbindung von Tumorzellen und Stromazellen Komponenten, in Vivo Bedingungen, die in der Blase Tumor Mikroumgebung zu imitieren. Dieses Modell bietet die Möglichkeit, den invasiven Prozess mit Zeitraffer Bildgebung in Echtzeit beobachten, befragen die molekulare Bahnen beteiligt mit konfokale immunofluorescent Bildgebung und Bildschirm-Verbindungen mit dem Potenzial, Block-Invasion. Während dieses Protokoll auf Blasenkrebs konzentriert, ist es wahrscheinlich, dass ähnliche Methoden zur Untersuchung von Invasion und Motilität in sowie andere Tumorarten eingesetzt werden könnte.

Erfolgreiche Gestaltung von invasiven Blase Krebs Tumor Sphäroid erfordert die Bildung von geeigneter Größe Tumor Sphäroide aus Zell-Linien oder Primärtumoren. Abbildung 2 A zeigt entsprechend dimensionierte Sphäroide aus vier menschliche Blase Krebszelllinien (UM-UC9, UM UC13, UM UC14, 253J und UM UC18) entwickelt. Abbildung 2 B zeigt ein Tumor Sphäroid von einem BBN generiert Maus Blase ...

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3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

3-d-Zellkultursystem für die Invasion zu studieren und Bewertung Therapeutika bei Blasenkrebs

Die Prozesse für die Blase Krebs Invasion darstellen Biomarker und therapeutische Entwicklungsmöglichkeiten. Hier präsentieren wir eine Blase Krebs Invasion Modell mit 3-d-Kultur der Tumor Sphäroide, Time-Lapse Bildgebung und konfokalen Mikroskopie. Diese Technik ist nützlich für die Definition der Merkmale des invasiven Verfahrens und für das screening von Therapeutika.

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

Cokultur Assays zur Untersuchung Makrophagen und Mikroglia Stimulation von Glioblastom-Invasion

Glioblastoma multiforme (grade IV glioma) is a very aggressive human cancer with a median survival of 1 year post diagnosis. Despite the increased ...

Forschung

Krebsforschung

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

A Rapid Filter Insert-based 3D Culture System for Primary Prostate Cell Differentiation

Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung

Conditionally reprogrammed cells (CRCs) provide a sustainable method for primary cell culture and the ability to develop extensive &#34;living ...

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma DIPG

Ein Protokoll für schnelle Post-mortem-Zellkultur von Diffuse Intrinsic Ponsgliom (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Nach oben bewegen: Eine einfache und Flexible In-vitro- dreidimensionale Invasion Assay Protokoll

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Live Cell Imaging-Assays Studie Glioblastom Gehirn Tumor Stammzellen Migration und Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

Methods for Evaluating the Role of c-Fos and Dusp1 in Oncogene Dependence

Methoden zur Bewertung der Rolle von c-Fos und Dusp1 in Abhängigkeit der Onkogen

The demonstration of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) in treating chronic myeloid leukemia (CML) has heralded a new era in cancer therapeutics. However, ...

A Three-dimensional Thymic Culture System to Generate Murine Induced Pluripotent Stem Cell-derived Tumor Antigen-specific Thymic Emigrants

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

The inheritance of pre-rearranged T cell receptors (TCRs) and their epigenetic rejuvenation make induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived T cells a ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Ein 3D-Spheroid-Modell als physiologischeres System für krebsassoziierte Fibroblasten Differenzierung und Invasion In Vitro-Studien

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...