Name: 3-d cell culture system for studying invasion and evaluating therapeutics in bladder cancer
Uploaded: 2018-09-13T14:45:00
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Los autores desean agradecer el laboratorio del Dr. Howard Crawford (Universidad de Michigan) para el soporte técnico y proporcionando materiales y equipos para este estudio y Alan Kelleher para soporte técnico.
Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Michigan Rogel cáncer centro Core Grant CA046592-26S3, CA201335 de NIH K08-01A1 (PLP), BCAN YIA (PLP), NIH R01 CA17483601A1 (DMS).

1. creciente cáncer esferoides
<ol><li>
Crecimiento de líneas celulares
	<ol>
<li>Células de cáncer de vejiga humana cultura bajo adherente convencional condiciones de cultivo de células y mantienen en un incubador de 37 º C suministrado con 5% CO2. Mantener las células en < 90% de confluencia. Nota: medios de cultivo utilizados es de Dulbecco modificado medio esencial mínimo (DMEM) que contiene 4,5 g/L D-glucosa, L-glutamina, piruvato de sodio 110 mg/L y con 10% suero bovino feta...

<ol>
	<li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Society. , (2018).</li><li>Knowles, M. A., Hurst, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+bladder+cancer:+new+insights+into+pathogenesis+and+clinical+diversity.">Molecular biology of bladder cancer: new insights into pathogenesis and clinical diversity.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (1), 25-41 (2015).</li><li>DeGeorge, K. C., Holt, H. R., Hodges, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bladder+Cancer:+Diagnosis+and+Treatment.+American+Family+Physician.">Bladder Cancer: Diagnosis and Treatment. 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Aquí describimos un modelo esferoide de tumor 3-d que permite la observación en tiempo real de invasión del cáncer de vejiga que es crítica para la metástasis y la progresión del cáncer. Este sistema es favorable a la incorporación de distintos componentes stromal y celulares para permitir a los investigadores mejor Recapitulemos el microambiente del tejido donde ocurre la invasión del cáncer de vejiga. Esferoides de cáncer de vejiga puede ser generadas de diversas fuentes como líneas celulares (incluyendo l...

La invasión es un paso crítico en la progresión del cáncer, que se requiere para la metástasis y se asocia a menor supervivencia y pronóstico en los pacientes. En el cáncer de vejiga humano, la neoplasia más frecuente del tracto urinario, que causa unos 165.000 muertes por año en todo el mundo, pronóstico, tratamiento y etapa del cáncer se relacionan directamente con la presencia o ausencia de invasión1. Alrededor del 75% de los casos de cáncer de vejiga se no músculo invasivo y se manejan con resección local. Por el contrario, los cánceres de vejiga músculo invasivo (aproximadamente 25% de los casos) son tumores agresivos con altas tasas de metástasis y son tratados con terapia de multimodality agresivo2,3. Por lo tanto, entender las vías moleculares que desencadenan la invasión es esencial para caracterizar mejor el riesgo de progresión invasiva y para desarrollar intervenciones terapéuticas que pueden prevenir la progresión invasiva.
La progresión invasiva del tumor se produce en un entorno de (3D) tridimensional complejo e implica la interacción de tumor de la célula con otras células del tumor, estroma, membrana basal y otros tipos de células incluyendo las células inmunes, fibroblastos, células musculares y vasculares células endoteliales. Permeable al soporte (por ejemplo, Transwell) sistemas de ensayo se emplean comúnmente para cuantificar cáncer células invasión4, pero estos sistemas son limitados porque no permiten el seguimiento microscópico del proceso de invasión en tiempo real y la recuperación de muestras para coloración adicional y el análisis molecular es un reto. Desarrollo de un sistema de esferoide de tumor de vejiga 3-d para estudiar invasión es deseable porque permite la incorporación de componentes microambiental definidos con la conveniencia de sistemas in vitro .
En este protocolo, se describe un sistema para interrogar a los procesos de invasión de las células cancerosas de la vejiga humana mediante un ensayo de invasión esferoide 3D incorporación de matrices de gel de colágeno y la microscopia confocal para permitir a los investigadores controlar la motilidad celular y invasión en tiempo real (figura 1A). Este sistema es versátil y puede ser modificado para interrogar a varios ajustes del estroma tumoral. Pueden incorporar más líneas de células de cáncer de vejiga o tumores vesicales primarias y células estromales adicionales como cáncer había asociado a fibroblastos y células inmunes5,6,7. Este protocolo describe una matriz compuesta de colágeno tipo 1, pero puede ser modificado para incorporar otras moléculas como la fibronectina, laminina y otras proteínas de colágeno. Procesos invasivos pueden ser seguidos durante 72 h o más dependiendo de la capacidad del microscopio y del sistema utilizado. Fijación y tinción de inmunofluorescencia de tumor embebido en la matriz 3D antes, durante y después de la invasión permite el interrogatorio de proteínas upregulated en las células invasoras, proporcionando información vital que generalmente ausente o difícil reunir usando otros modelos 3-d cultura. Este sistema también se puede utilizar compuestos de pantalla que bloquean invasión y delimitar vías de señalización afectadas por estos compuestos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1511px;" width="1511">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Human bladder cancer cell lines UM-UC9, UM-UC13, UM-UC14, UM-UC18, 253J</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:612px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">DMEM cell culture medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">11995065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right">26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:169px;">A3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Costar Ultral-low attachment 6-well cluster&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:169px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Conventional inverted microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;">491206-0001-000</td>
			<td>General use for cell culture and checking spheroids</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagen type 1 from rat tail, high concentration&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right" style="width:169px;">354249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">155382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;">LSM800</td>
			<td>A confocal miscoscope with climate chamber, multi-location imaging, and Z-stack scanning function&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryostat micromtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td style="width:169px;">CM3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zen 2 Image processing software&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:169px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
			<td>Vector Laboratories&#160;</td>
			<td style="width:169px;">H4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">O.C.T compound&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">23730571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342 solution&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td align="right" style="width:169px;">62249</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-ATDC (Trim29) antibody</td>
			<td style="width:203px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:169px;">HPA020053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-Cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:169px;">ab7800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:527px;">Anti-Vimentin antibody</td>
			<td style="width:203px;">Abcam</td>
			<td style="width:169px;">ab24525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond&#160;</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3-d cell culture system for studying invasion and evaluating therapeutics in bladder cancer

Cáncer de vejiga es un importante problema de salud. Se estima que más de 16.000 personas morirán este año en los Estados Unidos de cáncer de vejiga. Mientras que el 75% de los cánceres de vejiga son no invasivas y poco probable metástasis, alrededor del 25% progresar a un patrón de crecimiento invasivo. Hasta mitad de los pacientes con cánceres invasivos desarrollan letal recaída metastásica. Por lo tanto, comprender el mecanismo de progresión invasiva en el cáncer de vejiga es crucial para predecir los resultados del paciente y prevenir metástasis letal. En este artículo, presentamos un modelo de invasión del cáncer tridimensional que permite la incorporación de las células tumorales y los componentes stromal a imitar en vivo condiciones que ocurren en el microambiente del tumor de vejiga. Este modelo ofrece la oportunidad de observar el proceso invasivo en tiempo real usando proyección de imagen de Time-lapse, interrogar las vías moleculares implicadas confocales compuestos inmunofluorescentes de la proyección de imagen y pantalla con el potencial de invasión bloque. Aunque este protocolo se centra en el cáncer de vejiga, es probable que métodos similares podrían utilizarse para examinar la invasión y motilidad así como otros tipos de tumor.

Creación exitosa de esferoide de tumor de cáncer de vejiga invasivo requiere la formación de esferoides tumorales tamaño adecuado de líneas de células o tumores primarios. Figura 2 A muestra de tamaños adecuado esferoides desarrollados a partir de líneas de células de cáncer de cuatro vejiga humana (UM-UC9 UC13 UM, UM UC14, 253J y UM UC18). Figura 2 B muestra un tumor esferoidal de un t...

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3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Sistema del cultivo celular 3-d para invasión de estudiar y evaluar la terapéutica en el cáncer de vejiga

Los procesos de invasión del cáncer de vejiga representan oportunidades para el desarrollo terapéutica y biomarcadores. Aquí presentamos un modelo de invasión de cáncer de vejiga que incorpora 3D cultura de esferoides tumorales, proyección de imagen de Time-lapse y microscopía confocal. Esta técnica es útil para definir las características del proceso invasivo y para la detección de agentes terapéuticos.

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion

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Investigación

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