Name: culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

نيكول ستانسل، دكتوراه، ELS، المنشورات العلمية في معهد القلب تكساس، تقدم الدعم التحريري. ونشكر أيضا مصادر التمويل التالية: "منحة تطوير عالم مركز جمعية القلب الأمريكية الوطنية" (14SDG19840000 إلى وانغ ياء)، "جائزة البحوث لورانس" 2014 من رولانت وبيردون لورانس العظام المرض البرنامج من تكساس (إلى وانغ جيه )، والمعاهد الوطنية للصحة (DE026561 و DE025873 إلى وانغ جي، DE016320، و DE019650 إلى ماكسسون ر.).

1-إعداد قبل زراعة الخلايا O9-1
ملاحظة: القاعدية الوسائط المستخدمة لزراعة الخلايا O9-1 يجب أن يكون قد تكيف ب Sandos فطري الفئران ثيوجوانيني/واباين-مقاومة (ستو) الماوس تنتجها الخلايا الليفية الخلايا؛ ولذلك، تحتاج خلايا ستو الحصول عليها وإعدادها كما هو موضح أدناه قبل البدء في زراعة ال...

<ol>
	<li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells:+discovery,+properties+and+potential+for+therapy.">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li><li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotentiality+of+the+neural+crest.">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li><li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head.">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li><li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cells+on+the+move:+their+roles+in+craniofacial+development.">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li><li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century.">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li><li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quo+vadis:+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells.">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+neural+crest:+a+multigene+process.">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li><li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+network+during+neural+crest+induction:+from+cell+specification+to+cell+survival.">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li><li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+neural+crest:+achieving+specificity+in+regulatory+pathways.">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li><li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage.">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li><li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding.">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li><li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages.">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li><li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+early+human+neural+crest+development.">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li><li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers.">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li><li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-activated+kinase+1+(Tak1)+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells.">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development.">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li><li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway:+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development.">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li><li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer.">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li><li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo/Yap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration.">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).</li><li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues.">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li><li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+organ+development,+homeostasis,+and+regeneration.">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li><li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs.">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li><li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+YAP/TAZ:+hippo+signaling+and+beyond.">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest.">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li><li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration.">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208 (2016).</li><li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development.">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li><li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel,+but+not+collagen+I,+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro.">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li><li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells.">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li></ol>

لجنة التنسيق الوطنية أحد مساهمين الرئيسيين وتنوعاً لمختلف الأنسجة والأعضاء خلال morphogenesis الجنينية. خط الخلية O9-1 يحافظ على قدرته على التفريق في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ويحاكي في فيفو خصائص البلدان المتبرعة الصافية، يجعلها أداة مفيدة في المختبر لدراسة وظيفة الجينات والت...

الخلايا العصبية كريست (الصافية) هي الخلايا الجذعية مثل multipotent مع قدرة المهاجرة رائعة ووجود عابر أثناء التطور الجنيني. البلدان المتبرعة الصافية تنشأ بين الأديم الظاهر السطحي والانبوب العصبي وتهاجر إلى مناطق أخرى للجنين أثناء التطور الجنيني1. استناداً إلى تلك المجالات الوظيفية، ويمكن تصنيف البلدان المتبرعة الصافية إلى عدة أنواع مختلفة، بما في ذلك الجمجمة والجذع، تحفيزه، وعجزي، والقلب البلدان المتبرعة الصافية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن البلدان المتبرعة الصافية تفرق في الأنساب خلية متعددة، مثل خلايا العضلات الملساء، وخلايا العظام، والخلايا العصبية، وتؤدي إلى مختلف الأنسجة2،3. تنمية البلدان المتبرعة الصافية يتسم بسلسلة معقدة من الأحداث مورفوجينيتيك التي يتم ضبطها بالإشارات الجزيئية المختلفة. نظراً لتنظيم معقد من البلدان المتبرعة الصافية ومساهماتها الهامة لهياكل عديدة، يمكن أن تؤدي التقلبات التنمية NCC عادة إلى العيوب الخلقية عند الولادة، التي تمثل ما يقرب من 30 في المائة من جميع العيوب الخلقية الخلقية البشرية. تشوهات أثناء تطوير crest العصبي يمكن أن يؤدي إلى شق الشفة/الحنك، معيبة بعيوب تشكيل الآنف، المتلازمات، مثل تدفق القلب المعيبة المسالك أو وفيات الرضع حتى1،،من45، 6 , 7-فهم الآليات الجزيئية للتنمية NCC مهم لتطوير علاجات للأمراض الناجمة عن عيوب في تنمية البلدان المتبرعة الصافية. مع استخدام مختلف في المختبر و في فيفو النهج8،،من910،11،،من1213،14 15من ،، وقد تم إحراز تقدم كبير في لجنة التنسيق الوطنية للبحث. في فيفو، نماذج حيوانية، بما في ذلك الدواجن والبرمائيات، الزرد، والفئران، قد استخدمت للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية1. وعلاوة على ذلك، استخدمت الأجنة البشرية لدراسة عملية الهجرة الصافية في التنمية الجنين البشري المبكر16. في المختبر، نماذج الخلية للبلدان المتبرعة الصافية، مثل البلدان المتبرعة الصافية البشرية التي نشأت من الدهون تحت الجلد المريض، قد استخدمت للتحقيق في مرض باركنسون17. الخط NCC O9--1، والتي استمدت أصلاً من الثقافات الجماعية من البلدان المتبرعة الصافية الذاتية معزولة عن E8.5 الماوس الأجنة18، نموذج خلية قوية لدراسة البلدان المتبرعة الصافية. الأهم من ذلك، تحت ظروف ثقافة عدم التمييز، وخلايا O9-1 مولتيبوتينت الشبيهة الجذعية البلدان المتبرعة الصافية. ومع ذلك، تحت ظروف الثقافة المختلفة، الخلايا O9-1 يمكن أن تكون متباينة في أنواع الخلايا المتميزة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس، تشوندروسيتيس، والخلايا الدبقية18. ونظرا لهذه الخصائص، خلايا O9-1 على نطاق واسع استخدمت الدراسات المتصلة بالبلدان المتبرعة الصافية، مثل التحقيق في الآلية الجزيئية لعيوب الجمجمة الوجه19،20.
وترد هنا، بروتوكولات مفصلة للحفاظ على الخلايا O9-1 والتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع مختلفة من الخلايا، والتلاعب الخلايا O9-1 عن طريق إجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات مع تحرير الجينوم كريسبر-Cas9 والحمض النووي الريبي التدخل الصغيرة (siRNA)- بوساطة تقنيات ضربة قاضية. وكمثال ممثل، هو وصف استخدام الخلايا O9-1 دراسة ياب و طاز الخسارة-من-وظيفة. ياب وطاز هي المصب المستجيبة لفرس النهر مما يشير إلى المسار، الذي يلعب دوراً حاسما في انتشار الخلايا، والتمايز، والمبرمج. كما تبين في مسار فرس النهر لتكون هامة في التنمية والتوازن عدة من مختلف الأنسجة والأعضاء، وكذلك في الآلية المرضية لأمراض مختلفة20،،من2122،23 ،،من2425،26،،من2728. تتضمن العناصر الأساسية لفرس النهر مما يشير إلى مؤنزم 20-مثل العقيمة ورم القامع Mst1/2 وبروتين سقالة السلفادور التي تحتوي على المجال WW مؤنزم homolog (Lats1/2) القامع الورم كبير. فرس النهر مما يشير إلى يحول دون نشاط ياب وطاز، وتروج عن التدهور في السيتوبلازم. دون القمع من فرس النهر، يمكن أن ترانسلوكاتي إلى نويات ياب وطاز وتعمل كوسائل تفعيل المشارك النسخي. ونحن مؤخرا أظهرت أن يخمد تحديداً فرس النهر إشارات المستجيبة ياب وطاز في الماوس البلدان المتبرعة الصافية باستخدام Wnt1لجنة المساواة العرقية والسائقين Wnt1Cre2SOR أسفرت عن الفتك الجنينية في E10.5 مع شديد 20من عيوب الجمجمة. ونحن أيضا بإجراء دراسات باستخدام خلايا O9-1 للتحقيق في دور ياب وطاز في البلدان المتبرعة الصافية. دراسة دالة ياب وطاز في انتشار NCC والتمايز و ياب وضربه قاضية طاز خلايا تم إنشاؤها في الخلايا O9-1 باستخدام siRNA، وخلايا خروج المغلوب ياب تم إنشاؤها بواسطة استخدام تحرير الجينوم كريسبر-Cas9. يمكن تطبيق نفس الاستراتيجيات فقدان لوظيفة الجينات على الجينات المستهدفة المختلفة في مسارات أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا تطبيق مكسب للدالة دراسات وفحوصات تعداء الخلايا O9-1 لدراسة وظيفة الجينات والتنظيم. البروتوكولات المذكورة هنا تهدف إلى استخدام المحققين كأدلة لاستزراع خلايا O9-1 المحافظة على ستيمنيس مولتيبوتينت، لتمييز الخلايا O9-1 إلى أنواع أخرى من الخلايا تحت ظروف مختلفة من الثقافة، ودراسة وظيفة الجينات و الآليات الجزيئية للبلدان المتبرعة الصافية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1503</td>
			<td>Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 mouse cranial neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline) without calcium or magnesium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethylsulfoxide)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium, alpha 1X with Earle&#39;s salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, &#38; L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-041057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-046247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (fetal calf serum)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin-transferrin-selenium )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP2 (bone morphogenetic protein 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells

وتهاجر الخلايا العصبية كريست (الصافية) الخلايا الجذعية البالغة multipotent التي يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وتؤدي إلى العديد من الأنسجة والأعضاء. خط الخلية O9-1 مشتق من الذاتية الفأر الجنينية البلدان المتبرعة الصافية ويحافظ على مولتيبوتينسي. بيد أن ظروف ثقافة معينة، خلايا O9-1 يمكن أن تفرق في أنواع مختلفة من الخلايا وأن تستخدم في طائفة واسعة من التطبيقات البحثية. في الآونة الأخيرة، مع الجمع بين الدراسات الماوس وخلية O9--1، أننا أظهرنا أن فرس النهر مما يشير إلى مسار المستجيبة ياب وطاز تلعب أدواراً هامة في التنمية الجمجمة المستمدة من قمة العصبية. على الرغم من أن عملية تثقيف للخلايا O9-1 أكثر تعقيداً من التي تستخدم لخطوط الخلايا الأخرى، خط الخلية O9-1 نموذج قوية للتحقيق في البلدان المتبرعة الصافية في المختبر. نقدم هنا، على بروتوكول لاستزراع خط الخلية O9-1 المحافظة على ستيمنيس، فضلا عن البروتوكولات للتفريق بين الخلايا O9-1 إلى أنواع الخلايا المختلفة، مثل خلايا العضلات الملساء وخلايا الاوستيوبلاستس. وبالإضافة إلى ذلك، يرد وصف بروتوكولات لإجراء دراسات فقدان لوظيفة الجينات في الخلايا O9-1 باستخدام الحذف كريسبر-Cas9 وضربه قاضية بوساطة الرنا التدخل الصغيرة.

وكان هدف تجاربنا ضربة قاضية والضربة القاضية دراسة آثار ياب طاز الخسارة-من-وظيفة وفي الخلايا O9--1. قبل التجارب ضربة قاضية والضربة القاضية، لدينا للتأكد من أن التحضير لوسائط الإعلام القاعدية، وخلايا الثقافة O9-1 كما هو موضح أعلاه (على سبيل المثال، الغشاء مصفوفة الا?...

Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

O9--1 خط خلية crest العصبي ماوس مولتيبوتينت. هنا يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة لاستزراع خلايا O9--1، والتفريق بين الخلايا O9-1 في أنواع محددة من الخلايا والتلاعب وراثيا O9-1 الخلايا باستخدام siRNA بوساطة ضربة قاضية أو تحرير الجينوم كريسبر-Cas9.

استزراع والتلاعب بالخلايا Crest العصبي O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

خط الخلية O9-1 هو أداة مفيدة جدا لدراسة الخلايا قمة العصبية في المختبر. لديها إمكانات كبيرة للاستخدام في مجموعة واسعة من التطبيقات في استخدام مختلف البحوث. O9-1 الخلايا لها مزايا واضحة، مثل سهولة الوصول، والحصول بسرعة على أعداد كافية من الخلايا للتجارب، مما يجعلها طريقة قوية مجانية للدراسات في المختبر من الخلايا قمة العصبية.للبدء، إعداد الوسائط القاعدية لثقافة الخلية O9-1، وفقاً لبروتوكول النص. ثم، تصفية الوسائط القاعدية، والتفاف عليه في احباط لحمايته من الضوء. بعد ذلك، قم بجمع الوسائط القاعدية المشروطة من خلايا STO المنشطة وفقًا لبروتوكول النص.أولاً، إذابة aliquot من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد لمدة ساعتين. ثم، وتمييع مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع DMEM معقم مصفاة مع 10٪ FBS إلى تركيز النهائي من 0.5mg /مل. معطف لوحة مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.ثم، pirate مصفوفة غشاء الطابق السفلي في حين إمالة لوحة. جففي الأطباق عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عند إضافة مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى اللوحة ، تأكد من أن الحل غطى البئر بالتساوي للحفاظ على خصائص الخلية وتجنب الاختلاف غير الضروري بين التجارب.استرداد الخلايا O9-1 عن طريق وضع قارورة كرية في 37 درجة مئوية حمام الماء. دوامة ببطء القارورة حتى يتحول المحلول تماما إلى سائل. بعد ذلك، نقل حل الخلية من قارورة التبريد إلى أنبوب الطرد المركزي 15ml.إضافة خمسة وحدات تخزين DMEM مع 10٪ FBS إلى أنبوب لإعادة تعليق الخلايا. الطرد المركزي الخلايا لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Then، يتبخر supernatent، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. المقبل, إعادة تعليق بيليه في وسائل الإعلام القاعدية مكيفة تكمل مع LIF وBFGF.بذور الخلايا في لوحة ستة بئر، وتهيج لوحة لبذات الخلايا بالتساوي. عند تهيج لوحة، القيام بذلك أفقيا وعموديا، كما دوامة لوحة سوف يسبب الخلايا للتركيز نحو المركز. وتسمح لتلك الخلايا أن نعلق وتنمو في حاضنة ثقافة الخلية القياسية بين عشية وضحاها.تأكد من إرفاق الخلايا قبل تغيير الوسائط. عندما تصل الخلايا O9-1 إلى 80٪التقاء، ذوبان مصفوفة غشاء الطابق السفلي وإعداد لوحة مصفوفة غشاء الطابق السفلي المغلفة كما هو موضح سابقا. ثم إضافة وسائل الإعلام القاعدية تكملها LIF وBFGF إلى مصفوفة الغشاء.شطف بلطف الآبار مع 2ml من DPBS مرتين. ثم، افصل الخلايا مع 1ml من 0.05٪تريبسين EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. تحييد التربسين مع كمية مساوية من DMEM مع 10٪ FBS عن طريق الأنابيب مرارا وتكرارا السائل على سطح كامل من البئر.ثم، نقل حل الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي. وطاردة مركزية لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Aspirate supernatent دون إزعاج بيليه من الخلايا. المقبل, resuspend بيليه الخلية عن طريق pippetting بلطف مشروط وسائل الإعلام القاعدية تكملها LIF و BFGF.بذور الخلايا إلى لوحة المغلفة كما هو موضح سابقا. ثم، السماح للخلايا إرفاق وتنمو في حاضنة ثقافة الخلية القياسية. أولاً، إعداد الوسائط تجميد 2X وفقاً للبروتوكول النص.ثم، تصفية تعقيم وسائل الإعلام. شطف جدران لوحة مع DPBS مرتين، pipetting بلطف لتجنب فقدان الخلايا. بعد ذلك فصل الخلايا مع 0.05٪ تريبسين EDTA في 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق.تحييد التربسين مع كمية متساوية من 10٪ FBS و DMEM. نقل محتويات لوحة إلى أنبوب الطرد المركزي، والطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق في 180 Gs.Then، وpirate supernatent وإضافة 2ml من برنامج تلفزيوني لإعادة تعليق بيليه. الطرد المركزي حل الخلية مرة أخرى وpiratessnt.ضبط كمية الوسائط القاعدية في الأنبوب حسب الحاجة، وإضافة كمية مساوية للوسائط تجميد 2X. بعد ذلك، نقل الخلايا إلى قارورة التبريد المسماة. ضع قارورة التبريد داخل صندوق البوليسترين مع غطاء لتحقيق معدل تبريد بطيء عند 80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.لتنفيذ ضربة قاضية SIRNA في الخلايا O9-1، استرداد والبذور الخلايا. تخفيف الليبوزومات في حجم مناسب من وسائل الإعلام خالية من المصل. ثم، تمييع السيرنا في وسائل الإعلام خالية من المصل وفقا لبروتوكول النص.بعد ذلك، أضف السيرنا المخفف إلى الليبوزومات المخففة، وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. اخلطي المحلّل عن طريق التنمّر، وحضنّي لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. المقبل, إضافة حجم مناسب من مركب الدهون SIRNA إلى الخلايا.ثم، احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلية القياسية. يمكن لخلايا O9-1 أن تتمايز إلى أنواع خلايا مختلفة في ظل ظروف ثقافة التمايز الخاصة. لتمييز الخلايا O9-1 في عمليات تجميل العظام، قم بإعداد وسائل التمايز العظمية وفقًا لبروتوكول النص.وأخيرا، الكشف عن osteocalcin علامة العظام في عمليات تجميل العظام المتمايزة عن طريق التلطيخ المناعي. للتمييز الخلايا O9-1 في خلايا العضلات الملساء, ثقافة لهم في إطار وسائل الإعلام التمايز وفقا لبروتوكول النص, وتقييم التمايز بواسطة العضلات الملساء actin الملطخة المناعية. في هذا البروتوكول، تم تنفيذ كل من ضرب وضرب التجربة لدراسة فقدان ياب من وظيفة في الخلايا O9-1.في ظل ظروف تمايز الخلايا العضلية الملساء، أعطى معظم أنواع البرية O9-1 الخلايا التي أدت إلى العضلات على نحو سلس actin خلايا العضلات الملساء الإيجابية. ياب الخلايا الفارغة ولكن عموما فشلت في التفريق في خلايا العضلات الملساء الإيجابية SMA. وهذا يشير إلى أن ياب يلعب دورا حاسما في تمايز خلايا القمم العصبية في خلايا العضلات الملساء.أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر التعامل مع خط الخلية O9-1 بلطف وعناية خلال العملية بأكملها. تأكد من تخفيف واستخدام مصفوفة الغشاء القاعدي بشكل صحيح، واستخدام 0.05٪ التربسين لتفكك الخلايا. لا ننسى أنه أثناء التحضير لثقافة الخلية O9-1، يمكن أن يكون العمل مع الميتوميسين ج خطرة للغاية، وينبغي دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء معطف المختبر والقفازات أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

The Visual Colorimetric Detection of Multi-nucleotide Polymorphisms on a Pneumatic Droplet Manipulation Platform

كشف اللونية البصرية من متعدد النوكليوتيدات تعدد الأشكال على منصة التلاعب هوائي القطرة

A simple and visual method to detect multi-nucleotide polymorphism (MNP) was performed on a pneumatic droplet manipulation platform on an open surface. ...

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection الأجنة وتقنية زرع "التلاعب الجينوم" فيتريبينيس ناسونيا

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

تعطيل الجينات ذات كفاءة عالية من الخلايا السلف مورين والبشرية المكونة للدم قبل كريسبر/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

التلاعب في بلويدي في ايليجانس كاينورهابديتيس

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

عزل وتوصيف والمستندة إلى MicroRNA التحوير الوراثي للخلايا الجذعية البشرية جريب طب الأسنان

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

إعداد وتعديل الجينات الرئيسيات نونومان الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

التلاعب بالجينات الدالة في كافيفيش المكسيكي

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...