Name: culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells
Uploaded: 2018-10-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells at JoVE.com

Nicole Stancel, pH.d., ELS, de publicações científicas do Instituto do coração do Texas, prestou apoio editorial. Agradecemos também as seguintes fontes de financiamento: nacional Center cientista desenvolvimento Grant a associação americana do coração (14SDG19840000 de J. Wang), o prêmio de pesquisa Lawrence 2014 do Rolanette e osso Lawrence Berdon doença programa do Texas (para J. Wang ) e os institutos nacionais de saúde (DE026561 e DE025873 para J. Wang, DE016320 e DE019650 de R. Maxson).

1. preparação antes da cultura de pilha O9-1
Nota: Mídia Basal usada para cultura de células O9-1 deve fomos condicionadas por Sandos pura ratos tioguanina/Ouabaína-resistente (STO) pilhas do rato dos fibroblastos; Portanto, as células STO precisam ser obtidos e preparados conforme descrito abaixo, antes de iniciar a cultura de pilha O9-1.
<ol><li>
Cultura de célula activa STO
	<ol>
<li>Preparar a mídia para cultivo de células ativas de STO, fazendo de Dulbecco comp...

<ol>
	<li>Achilleos, A., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+stem+cells:+discovery,+properties+and+potential+for+therapy.">Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy.</a> Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).</li><li>Le Douarin, N. M., Dupin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotentiality+of+the+neural+crest.">Multipotentiality of the neural crest.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).</li><li>Santagati, F., Rijli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+and+the+building+of+the+vertebrate+head.">Cranial neural crest and the building of the vertebrate head.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).</li><li>Cordero, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cranial+neural+crest+cells+on+the+move:+their+roles+in+craniofacial+development.">Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).</li><li>Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Craniofacial+birth+defects:+The+role+of+neural+crest+cells+in+the+etiology+and+pathogenesis+of+Treacher+Collins+syndrome+and+the+potential+for+prevention.">Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention.</a> American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).</li><li>Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+crest+migrating+into+the+twenty-first+century.">The neural crest migrating into the twenty-first century.</a> Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).</li><li>Zurkirchen, L., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quo+vadis:+tracing+the+fate+of+neural+crest+cells.">Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells.</a> Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).</li><li>Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+regulatory+network+orchestrates+neural+crest+formation.">A gene regulatory network orchestrates neural crest formation.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).</li><li>Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+the+neural+crest:+a+multigene+process.">Induction of the neural crest: a multigene process.</a> Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).</li><li>Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+network+during+neural+crest+induction:+from+cell+specification+to+cell+survival.">Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).</li><li>Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+neural+crest:+achieving+specificity+in+regulatory+pathways.">Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways.</a> Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).</li><li>Dupin, E., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+crest+progenitors+and+stem+cells:+from+early+development+to+adulthood.">Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood.</a> Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).</li><li>Henion, P. D., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timing+and+pattern+of+cell+fate+restrictions+in+the+neural+crest+lineage.">Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage.</a> Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).</li><li>Harris, M. L., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+specification+in+neural+crest+cell+pathfinding.">Lineage specification in neural crest cell pathfinding.</a> Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).</li><li>Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+distinct+neurogenic+and+melanogenic+neural+crest+sublineages.">Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages.</a> Development. 130 (2), 321-330 (2003).</li><li>Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+early+human+neural+crest+development.">Analysis of early human neural crest development.</a> Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).</li><li>Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+neural+crest+stem+cell-derived+dopaminergic+neuronal+model+recapitulates+biochemical+abnormalities+in+GBA1+mutation+carriers.">A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers.</a> Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).</li><li>Ishii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse.">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li><li>Yumoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TGF-beta-activated+kinase+1+(Tak1)+mediates+agonist-induced+Smad+activation+and+linker+region+phosphorylation+in+embryonic+craniofacial+neural+crest-derived+cells.">TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+and+Taz+play+a+crucial+role+in+neural+crest-derived+craniofacial+development.">Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development.</a> Development. 143 (3), 504-515 (2016).</li><li>Heallen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+inhibits+Wnt+signaling+to+restrain+cardiomyocyte+proliferation+and+heart+size.">Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size.</a> Science. 332 (6028), 458-461 (2011).</li><li>Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway:+An+emerging+regulator+of+craniofacial+and+dental+development.">Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development.</a> Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).</li><li>Pan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hippo+signaling+pathway+in+development+and+cancer.">The hippo signaling pathway in development and cancer.</a> Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).</li><li>Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo/Yap+signaling+in+cardiac+development+and+regeneration.">Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration.</a> Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38 (2016).</li><li>Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+regulation+of+gastrointestinal+tissues.">Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues.</a> Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).</li><li>Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+organ+development,+homeostasis,+and+regeneration.">The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).</li><li>Moya, I. M., Halder, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+in+cellular+reprogramming+and+regeneration+of+different+organs.">The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs.</a> Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).</li><li>Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+YAP/TAZ:+hippo+signaling+and+beyond.">The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).</li><li>Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genomic+deletions+in+mammalian+cell+lines+via+CRISPR/Cas9.">Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9.</a> Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118 (2015).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Manderfield, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+is+required+for+Notch-dependent+smooth+muscle+differentiation+of+neural+crest.">Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest.</a> Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).</li><li>Hindley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hippo+pathway+member+YAP+enhances+human+neural+crest+cell+fate+and+migration.">The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration.</a> Scientific Reports. 6, 23208 (2016).</li><li>Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcriptional+coactivators+Yap+and+TAZ+are+expressed+during+early+Xenopus+development.">The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).</li><li>Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel,+but+not+collagen+I,+maintains+the+differentiation+capacity+of+muscle+derived+cells+in+vitro.">Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro.</a> Biomedical Materials. 7 (5), 055004 (2012).</li><li>Kang, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+matrigel+on+the+osteogenic+potential+of+canine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells.">Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).</li><li>Uemura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel+supports+survival+and+neuronal+differentiation+of+grafted+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells.">Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).</li></ol>

O NCC é um contribuinte versátil e chave para diferentes tecidos e órgãos durante a morfogênese embrionária. A linha de celular O9-1 mantém seu potencial para se diferenciar em muitos tipos de células diferentes e imita as características na vivo do CNCC, tornando-o uma ferramenta útil em vitro para estudar a função dos genes e Regulamento molecular em CNCC. O status diferente de células O9-1 pode corresponder a diferentes crista neural progênie na vivo, dependendo das condições...

Crista neural (CNCC) são células estaminais, como com uma notável capacidade migratória e transitória existência durante o desenvolvimento embrionário. CNCC originam entre o ectoderma superficial e o tubo neural e migra para outras partes do embrião durante o desenvolvimento embrionário1. Com base em seus domínios funcionais, CNCC pode ser classificados em vários tipos diferentes, incluindo crânio, tronco, vagal, sacral e cardíaca CNCC. Além disso, a CNCC pode se diferenciar em várias linhagens de células, como células musculares lisas, células ósseas e neurônios e dar origem a vários tecidos2,3. O desenvolvimento da CNCC caracteriza-se por uma série complexa de eventos morfogenéticas que são ajustados por vários sinais moleculares. Tendo em conta o Regulamento complexo do CNCC e suas importantes contribuições para numerosas estruturas, o dysregulation do desenvolvimento do NCC comumente pode originar defeitos congênitos do nascimento, que respondem por cerca de 30% de todos os defeitos congênitos humanos do nascimento. Anomalias durante o desenvolvimento da crista neural podem levar a fissura lábio/palato, defeito defeitos de formação do nariz, síndromes, tais como um tracto de saída cardíaca defeituosa do, ou até mesmo mortalidade1,4,5, 6 , 7. compreender os mecanismos moleculares do desenvolvimento do NCC é importante para o desenvolvimento de tratamentos para doenças causadas por defeitos no desenvolvimento do NCC. Com o uso de vários in vitro e in vivo se aproxima de8,9,10,11,12,13,14 ,15, consideráveis progressos na investigação do NCC. In vivo, modelos animais, incluindo galinhas, anfíbios, peixe-zebra e ratos, têm sido utilizados para investigar a CNCC1. Além disso, os embriões humanos têm sido utilizados para estudar o processo de migração do NCC em início de desenvolvimento de embrião humano16. In vitro, modelos de celular para CNCC, tais como CNCC humana que originou-se paciente da gordura subcutânea, têm sido utilizados para investigar a doença de Parkinson17. Linha O9-1 NCC, que foi originalmente derivada de culturas em massa da CNCC endógenas isoladas de 8.5 de embriões de rato18, é um modelo de célula poderoso para estudar CNCC. importante, em condições não-diferenciação de cultura, são células O9-1 multipotentes haste-como CNCC. No entanto, sob condições variáveis de cultura, células O9-1 podem ser diferenciadas em tipos celulares distintos, tais como células musculares lisas, osteoblastos, condrócitos e células gliais18. Devido a essas propriedades, O9-1 células têm sido amplamente utilizadas para estudos relacionados ao NCC, como investigar o mecanismo molecular de defeitos crânio-facial19,20.
Aqui, protocolos detalhados são fornecidos para manter células O9-1, diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células e manipulando células O9-1 através da realização de estudos de perda--função do gene com edição de genoma CRISPR-Cas9 e RNA de interferência pequeno (siRNA)- mediada por tecnologias "knockdown". Como um exemplo representativo, é descrito o uso de células-O9-1 para estudar Yap e Taz perda de função. Yap e Taz são os efetores a jusante do hipopótamo sinalizando a via, que desempenha um papel crítico na proliferação celular, diferenciação e apoptose. O caminho de Hippo também foi mostrado para ser importante no desenvolvimento e na homeostase de diversos diferentes tecidos e órgãos, bem como na patogênese de doenças diferentes20,21,22,23 ,24,25,26,,27,28. Os principais componentes de hipopótamo sinalização incluem os tumor supressor estéril 20-como quinases Mst1/2, proteína que contém o domínio WW do andaime Salvador e as quinases de homólogo (Lats1/2) de supressor de tumor grande. Sinalização de hipopótamo inibe a atividade de Yap e Taz e promove sua degradação no citoplasma. Sem repressão do hipopótamo, Yap e Taz podem translocar em núcleos e funcionar como co-ativadores transcricionais. Recentemente mostramos que especificamente inactivar o hipopótamo sinalização efetores Yap e Taz no mouse CNCC usando o Wnt1cre e Wnt1Cre2SOR motoristas resultaram na letalidade embrionária em E10.5 com graves defeitos craniofaciais20. Também Efetuamos estudos utilizando células O9-1 para investigar o papel de Yap e Taz em CNCC. Para estudar a função Yap e Taz no NCC proliferação e diferenciação, Yap e o Taz knockdown células foram geradas nas células O9-1 usando siRNA, e células de nocaute de Yap foram geradas usando CRISPR-Cas9 edição do genoma. As mesmas estratégias de perda de função do gene podem ser aplicadas a genes-alvo diferente em outras vias. Além disso, ganho-de-função estudos e ensaios de transfeccao também podem ser aplicados às células de O9-1 para estudar a regulação e a função dos genes. Os protocolos descritos aqui destinam-se a ser utilizado por investigadores como guias para cultivo de células O9-1 para manter stemness multipotentes, para diferenciar O9-1 células em outros tipos de células sob condições de cultura diferente e para estudar a função dos genes e os mecanismos moleculares da CNCC.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Active STO feeder cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL-1503</td>
			<td>Also available in mitomycin C-inactivated form, catalog # ATCC 56-X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O9-1 mouse cranial neural crest cell line</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SCC049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, no glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30243.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ES-009-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin - streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% in HBSS</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline) without calcium or magnesium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO leukemia inhibitory factor (LIF) 106 unit/ml</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitomycin C</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10107409001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel matrix</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO (dimethylsulfoxide)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MX1458-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine RNAiMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>13778-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium, alpha 1X with Earle&#39;s salts, ribonucleosides, deoxyribonucleosides, &#38; L-glutamine</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Wwtr1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-041057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Non-targeting Pool</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ON-TARGETplus Yap1 siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>L-046247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS (fetal calf serum)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS (insulin-transferrin-selenium )</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TGF-b3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP2 (bone morphogenetic protein 2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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culturing and manipulation of o9-1 neural crest cells

Células da crista neural (CNCC) estão migrando de células tronco que podem se diferenciar em diferentes tipos de células e dar origem a vários tecidos e órgãos. A linha de celular O9-1 é derivada o endógeno CNCC embrionárias de rato e mantém a sua multipotency. No entanto, em condições de cultura específica, O9-1 células podem se diferenciar em diferentes tipos de células e ser utilizadas em uma ampla gama de aplicações de pesquisa. Recentemente, com a combinação de estudos de rato e de células O9-1, mostramos que o hipopótamo efetores da via de sinalização Yap e Taz desempenham importantes funções no desenvolvimento craniofacial crista neural-derivado. Embora o processo de cultivo de células O9-1 é mais complicado do que o utilizado para outras linhas de célula, a linha de celular O9-1 é um poderoso modelo para investigar a CNCC em vitro. Aqui, apresentamos um protocolo para a linha de celular O9-1 para manter a sua stemness, bem como protocolos para diferenciar células O9-1 em diferentes tipos de células, como células de músculo liso e osteoblastos de cultivo. Além disso, os protocolos são descritos para a realização de estudos de perda-de-função do gene em células O9-1 usando CRISPR-Cas9 exclusão e pequena interferência mediada por RNA "knockdown".

O objetivo das nossas experiências knockdown e nocaute foi estudar os efeitos de Yap e Taz perda-de-função nas células O9-1. Antes os experimentos knockdown e nocaute, temos que certificar-se que preparam para mídia basal e células de cultura O9-1 como descrito acima (por exemplo, necessidades de matriz membrana basal para cobrir a placa inteira como mostrado na Figura 1e O9-1 células recuperadas de nitrogênio líquido como mostrado ...

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Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells

O9-1 é uma linhagem de células multipotentes rato crista neural. Aqui descrevemos protocolos passo a passo detalhados para cultivo de células O9-1, diferenciar células O9-1 em tipos de células específicas e manipulando geneticamente células O9-1 usando mediada por siRNA nocaute ou CRISPR-Cas9 edição do genoma.

Cultivo e manipulação das células da crista Neural de O9-1

Neural crest cells (NCCs) are migrating multipotent stem cells that can differentiate into different cell types and give rise to multiple tissues and ...

A linha celular O9-1 é uma ferramenta muito útil para estudar células de crista neural in vitro. Tem um grande potencial para uso em uma ampla gama de aplicações em vários usos de pesquisa. As células O9-1 têm vantagens óbvias, como fácil acesso, e rapidamente obtenção de números celulares suficientes para experimentos, tornando-se um método poderoso de cortesia a estudos in vitro de células de crista neural.Para começar, prepare a mídia basal para a cultura celular O9-1, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, filtre a mídia basal e enrole-a em papel alumínio para protegê-la da luz. Depois disso, colete mídia basal condicionada de células STO ativadas de acordo com o protocolo de texto.Primeiro, descongele uma alíquota da matriz de membrana do porão no gelo por duas horas. Em seguida, diluir a matriz de membrana do porão com DMEM esterilizado filtrado com 10% de FBS a uma concentração final de 0,5mg/ml. Cubra a placa com a matriz de membrana do porão em temperatura ambiente por uma hora.Em seguida, aspire a matriz de membrana do porão enquanto inclina a placa. Seque as placas a 30 graus Celsius por 30 minutos. Ao adicionar a matriz de membrana do porão à placa, certifique-se de que a solução cobriu o poço uniformemente para manter as características celulares e evitar variações desnecessárias entre os experimentos.Recupere as células O9-1 colocando um crio-frasco em um banho de água de 37 graus Celsius. Gire lentamente o frasco até que a solução se transforme completamente em líquido. Depois disso, transfira a solução celular do crio-frasco para um tubo de centrífuga de 15ml.Adicione cinco volumes de DMEM com 10% de FBS ao tubo para suspender as células. Centrifugar as células por três minutos a 180 Gs.Então, aspire o supernagente, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Em seguida, suspenda a pelota em mídia basal condicionada complementada com LIF e BFGF.Semear as células em uma placa de seis poços, e agitar a placa para semear as células uniformemente. Ao agitar a placa, faça-o horizontal e verticalmente, pois girar a placa fará com que as células se concentrem em direção ao centro. E permitir que essas células se conectem e cresçam em uma incubadora de cultura celular padrão durante a noite.Certifique-se de que as células estão anexadas antes de alterar a mídia. Quando as células O9-1 atingirem 80% de confluência, descongele a matriz de membrana do porão e prepare uma placa revestida de matriz de membrana do porão, como descrito anteriormente. Em seguida, adicione a mídia basal complementada com LIF e BFGF à matriz de membrana.Enxágue suavemente os poços com 2ml de DPBS duas vezes. Em seguida, dissociar as células com 1ml de 0,05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por três minutos. Neutralizar a trippsina com uma quantidade igual de DMEM com 10% de FBS, esbofetando repetidamente o líquido sobre toda a superfície do poço.Em seguida, transfira a solução celular para um tubo de centrífuga. E centrífuga por três minutos a 180 Gs.Aspire o supernatent sem perturbar a pelota das células. Em seguida, resuspenque a pelota celular fornecendo suavemente mídia basal condicionada complementada com LIF e BFGF.Semear as células para a placa revestida como descrito anteriormente. Então, permita que as células se conectem e cresçam em uma incubadora de cultura celular padrão. Primeiro, prepare a mídia de congelamento 2X de acordo com o protocolo de texto.Em seguida, esterilize a mídia. Enxágüe as paredes da placa com DPBS duas vezes, esbotoando suavemente para evitar a perda de células. Em seguida, dissociar as células com 0,05% de trippsina EDTA a 37 graus Celsius por três minutos.Neutralizar a trippsina com uma quantidade igual de 10% FBS e DMEM. Transfira o conteúdo da placa para um tubo de centrífuga e centrífuga por três minutos a 180 Gs.Em seguida, aspire o supernante e adicione 2ml de PBS para resuspensar a pelota. Centrifugar a solução celular mais uma vez e aspirar o supernatent.Ajuste a quantidade de mídia basal no tubo conforme necessário e adicione uma quantidade igual de mídia de congelamento de 2X. Em seguida, transfira as células para os frascos de criogenia rotulados. Coloque os frascos crionitos dentro de uma caixa de poliestireno com uma tampa para obter uma taxa de resfriamento lenta a 80 graus Celsius por pelo menos 24 horas.Para realizar o knockdown SIRNA em células O9-1, recupere e semee as células. Lipossomos diluídos em um volume apropriado de mídia sem soro. Em seguida, dilui o SIRNA em mídia livre de soro de acordo com o protocolo de texto.Depois disso, adicione o SIRNA diluído aos lipossomos diluídos, de acordo com as instruções do fabricante. Misture a solução por pipetação e incubar por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione um volume apropriado de complexo lipídedo SIRNA às células.Em seguida, incubar as células por 24 horas em uma incubadora de cultura celular padrão. As células O9-1 podem se diferenciar em diferentes tipos de células em condições específicas de cultura de diferenciação. Para diferenciar as células O9-1 em osteoplastos, prepare os meios de diferenciação osteogênica de acordo com o protocolo de texto.Por fim, detecte o osteocalcina marcador de osteoplastias em osteoplastos diferenciados por uma coloração imuno. Para diferenciar as células O9-1 em células musculares lisas, cultuá-las sob meios de diferenciação de acordo com o protocolo de texto e avaliar a diferenciação poroxidação imuno de actina muscular suave. Neste protocolo, ambos nocauteam e derrubam experimentos para estudar a perda de função yap em células O9-1 foram realizados.Sob condições de diferenciação de células musculares lisas, a maioria das células selvagens do tipo O9-1 deu origem a células musculares lisas. As células nulas yap, no entanto, geralmente não conseguiram se diferenciar em células musculares lisas positivas da SMA. Isso indica que Yap desempenha um papel crítico na diferenciação das células da crista neural em células musculares lisas.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manusear a linha celular O9-1 suavemente e cuidadosamente durante todo o processo. Certifique-se de diluir e usar a matriz de membrana basal corretamente, e use 0,05% de trippsina para dissociação celular. Não se esqueça que durante a preparação para a cultura celular O9-1, trabalhar com mitomicina c pode ser extremamente perigoso, e precauções como usar um jaleco e luvas devem ser sempre tomadas durante a realização deste procedimento.

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