Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

وأيد هذا العمل بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (المعاهد الوطنية للصحة) GM103554 و GM110767 إلى (T.W.G.) والمركز الوطني "بحوث الموارد" 5P20RR018751 و GM103513 8 ف 20 المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (إلى G.W.H.).

وتربية الحيوانات والتجارب أجريت وفقا "المعاهد الوطنية للصحة دليل" للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وإياكوك في جامعة نيفادا.
1. إعداد أغشية والأعصاب فرنك من الفئران المحورة وراثيا
<ol><li>شراء الفئران المحورة وراثيا والإشعال اليغنوكليوتيد للنمط الوراثي هذه الفئران. مل?...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

هنا نقدم بعض الأمثلة لقياس Ca2 + الردود في خلايا معينة في الأنسجة العضلية سليمة معربا عن جيتشي الفئران باستخدام. بغية تنفيذ هذه التجارب بنجاح، من الضروري لا تصيب العصب فرينيك أثناء التشريح. الصورة Ca2 + الردود في خلايا شوان في السلطة أما منخفضة أو عالية (أي20 X أو 60 X)، من الضروري ...

NMJ، مثل جميع نقاط الاشتباك العصبي، ويتألف من ثلاثة عناصر هي: محطة presynaptic المستمدة من خلية، خلية بوستسينابتيك العصبية/المستجيب، وخلية بيريسينابتيك الدبقية1،2. في حين أظهرت الجوانب الأساسية لانتقال متشابك أولاً في هذا المشبك3، العديد من جوانب هذه العملية تظل مجهولة، جزئيا بسبب التعبير عن جزيئات نفس عناصر خلوية متميزة من هذا المشبك. على سبيل المثال، يتم التعبير عن مستقبلات لكل من البيورين نوكليوتيد الأدنين ATP واستيل (ACh)، الذي شارك تم إصدارها من قبل الخلايا العصبية الحركية في NMJ الفقارية، بالعضلات وخلايا شوان والخلايا العصبية الحركية، مما يعقد تفسير أي تأثير الوظيفية التي تمارس بها هذه المواد (مثلاً، الإفراج عن الإرسال أو الرد، توليد قوة العضلات)4. وعلاوة على ذلك، على الرغم من أن مكونات الثلاثية NMJ بسيطة مقارنة إلى، على سبيل المثال، الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي الذي غالباً ما يحمل مدخلات متعددة متشابك، عما إذا كانت الخلايا العصبية الحركية، والخلايا العضلية أو خلايا شوان تختلف في الاستجابة للمحفزات على أساس على ما مضمن عدم التجانس (مثلاً، اشتقاق الجنينية، النوع الفرعي للألياف، ومورفولوجيا) غير واضح. بغية معالجة كل مسألة من هذه المسائل، أنه سيكون من المفيد لتعقب الاستجابة للعديد من الخلايا داخل أحد العناصر متشابك، فضلا عن المسار، في الوقت نفسه، هذه استجابة في أي من عناصر منفصلة أخرى في نفس الوقت. الاستراتيجيات التقليدية باستخدام الأصباغ الكيميائية لقياس إشارات الكالسيوم لا يمكن تحقيق هذين الهدفين، لأنه هو تناول تطبيق حمام صبغة بأنواع متعددة من الخلايا بعد التطبيق للأنسجة، ويمكن استخدام صبغة إينتراسيلولارلي تحميل فقط تصور الأفواج الفردية أو الصغيرة من الخلايا. هنا، استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن جيسيس مصممة لقياس إشارات الكالسيوم خلية على حدة، جنبا إلى جنب مع تصوير محددة و أدوات البرمجيات5، يمكننا إثبات الأول من هذين الهدفين عموما، ومناقشة كيفية الإضافة جديد أدوات معدلة وراثيا سوف يساعد على تحقيق الثاني. سوف تكون هذه التقنية مفيدة لأي شخص مهتم في تتبع ديناميات الكالسيوم أو الخلوية الأخرى مما يشير إلى أحداث يمكن ملاحظتها من خلال أجهزة الاستشعار البصرية ترميز الجينات في السكان خلية متعددة في نفس الوقت.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

يمكن رصد النشاط الكهربائي للخلايا في الأنسجة بالتقنيات الكهربية، ولكن هذه عادة ما يقتصر على تحليل الخلايا الفردية. نظراً لزيادة الكالسيوم داخل الخلايا (Ca2 +) في سيتوسول غالباً ما تحدث بسبب النشاط الكهربائي، أو استجابة لعدد ضخم محفزات الأخرى، يمكن رصد هذه العملية بتصوير الخلايا محملة الفلورسنت المراعية للكالسيوم الأصباغ.  ومع ذلك، من الصعب صورة هذه الاستجابة في نوع خلايا فردية داخل الأنسجة كاملة لأن يتم تناول هذه الأصباغ بجميع أنواع الخلايا داخل الأنسجة. على النقيض من ذلك، مؤشرات الكالسيوم المشفرة جينياً (جيسيس) يمكن التعبير عنها حسب نوع خلية فردية وفلوريس في استجابة لزيادة من داخل الخلية Ca2 +، مما سمح التصوير من Ca2 + إشارات في مجموعات سكانية بأكملها من أنواع الخلايا الفردية. هنا، علينا تطبيق الاستخدام من جيسيس GCaMP3/6 على الوصلات العصبية العضلية الماوس، وخلايا شوان المشبك ثلاثية بين الخلايا العصبية الحركية، والهيكل العظمى والعضلات، والمحطة الطرفية/بيريسينابتيك. علينا أن نبدي بفائدة هذا الأسلوب في الكلاسيكية السابقين فيفو الاستعدادات الأنسجة. استخدام تقسيم بصري، نقوم بالتصوير المزدوج-الطول الموجي لدينامية Ca2 + إشارات وتسمية ثابتة من الوصلات العصبية العضلية (NMJ) في نهج التي يمكن تكييفها بسهولة لرصد اثنين جيتشي الخلية المحددة أو الجهد وراثيا المرمزة المؤشرات (جيفي) في نفس الوقت. وأخيراً، نحن نناقش الإجراءات المستخدمة لالتقاط خرائط مكانية لشدة الأسفار. معا، يمكن أن تستخدم هذه التقنيات البصرية والمعدلة وراثيا والتحليلية لدراسة النشاط البيولوجي للفئات السكانية الفرعية خلية متميزة في NMJ في مجموعة متنوعة من السياقات.

عدة أمثلة للتغييرات كثافة الأسفار، توسط الزيادات من داخل الخلية Ca2 + ضمن أنواع الخلايا المحددة NMJ، تظهر فائدة هذا النهج. وترد هذه النتائج كخرائط كثافة fluorescence المكاني، الذي يقدم موقع الخلايا المستجيبة، وكذلك الكثافة من ردودها، مما يسمح لتقييم الاستجابة كم عدد الخلا?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

نقدم هنا بروتوكولا للكالسيوم في صورة إشارات في سكان أنواع الخلايا الفردية في الوصلات العصبية العضلية مورين.

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم الخاصة بالخلية إشارات في المشبك الثلاثية للحجاب الحاجز الماوس

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال العصبي العضلي، مثل دور إشارات الكالسيوم في العضلات أو خلايا شوان استجابة لتحفيز الأعصاب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المرء يمكن صورة تنشيط أنواع محددة من الخلايا استجابة لتحفيز الأعصاب. للبدء ، والحصول على الفئران المعدلة وراثيا ، وgenotype لهم كما هو مفصل في بروتوكول النص.بعد القتل الرحيم، مقطع عبر عرضية عبر الحيوان بأكمله فقط تحت الكبد وفوق القلب والرئتين مع مقص استئصال الرحم. تشريح بعيدا الكبد والقلب والرئتين. الحرص على الحفاظ على طول العصب فيرينيك الذي هو طويل بما فيه الكفاية بحيث يتم رسمها في قطب شفط.إزالة مزيد من القفص الصدري وعمود العمود الفقري، باستثناء التلال رقيقة حول الحجاب الحاجز. ضع الحجاب الحاجز وعينة العصب فيرينيك في أنبوب ميكروفوج مع محلول كريبس-رينغر الذي يحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من البونغاروكسيوم ألفا المسمى بالفلورسنت. السماح للعينة لاحتضان في المحل لمدة 10 دقائق في الظلام.باستخدام دبابيس minutien شل الحجاب الحاجز عن طريق تثبيته على طبق ستة سنتيمترات المغلفة مع هلام السيليكون عازلة ومليئة ما يقرب من ثمانية ملليلتر من محلول كريبس رينغر المؤكسج. ضع الطبق على مرحلة المجهر. ثم، perfuse الحجاب الحاجز مع أكثر كريبس-رينغر الحل في ثمانية ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.في التكبير أربع مرات، وذلك باستخدام ميكرومانبولاتور، تحريك القطب الشفط على العصب الظاهري الأيسر. تطبيق الشفط عن طريق سحب برميل من حقنة خمسة ملليلتر متصلة الأنابيب التي تعلق على القطب الشفط. تأكد من أن الحجاب الحاجز عقود استجابة لتحفيز هرتز واحد عن طريق فحص بصريا مع إضاءة برايتفيلد.إذا لم يكن كذلك، ضبط الجهد عن طريق تحويل مقبض الجهد تدريجيا لتحقيق نبض فوقماكسيمال الذي يمكن التحقق من خلال الفحص البصري لانكماش العضلات. إذا لم تكن مرئية حتى الآن، تفجير العصب مع حقنة ومحاولة لرسم مرة أخرى عن طريق تطبيق الشفط. الآن، إيقاف perfusion لإضافة مثبطات الميوسين الخاصة بالعضلات BHC أو الجهد بوابة قناة الصوديوم خصم مو كونotoxin.إعداد BHC قبل التخفيف عن طريق الأنابيب أربعة microliters من 200 ملليمولار الأسهم BHC في DMSO في ملليلتر واحد من حل كريبس رينجر. إزالة ملليلتر واحد من حل كريبس-رينجر من الطبق. ثم يضاف BHC المخففة مسبقا إلى الطبق.بعد 30 دقيقة، قم بتشغيل تسريب محلول كريبس-رينغر الطازج لمدة 20 إلى 30 دقيقة أخرى. ارتداء القفازات، وإعداد القطب تسجيل عن طريق وضع الزجاج خيوط البورسليكات مع القطر الخارجي من ملليمتر واحد وقطر داخلي من 0.4 ملليمتر في سحب ميكروبليت. تشديد بطلب لتضييق عليه في الموقف وإغلاق باب السحب.ثم قم ببرمجة الـ puller كما هو موضح في بروتوكول النص. بالنسبة للزنايات الجنينية، قم بقياس المقاومة باستخدام عناصر تحكم البرامج في مكبر الصوت. تأكد من أن المقاومة بالقرب من 60 ميغاهات، وللفراجات القديمة، 10 إلى 20 ميغاهات.الآن، قم بتحميل قطب التسجيل بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مُولّر. في 10 مرات التكبير، وانخفاض القطب في العضلات باستخدام ميكرومانيبولاتور الثاني على الجانب الآخر من المرحلة ككترود محفز. استخدام القدرة على الحصول على البيانات الكهربائية البرمجيات الانتظار حتى غشاء يستريح التغييرات المحتملة من صفر إلى ناقص 65 ملليفولت أو أقل.تحفيز في هرتز واحد والتحقق من وجود العضلات العمل المحتملة عن طريق التحقق من إمكانات كبيرة التي معارض تجاوز متواضعة. لا تخلط بين التحف التحفيز مع إمكانية العمل. في 20 مرات التكبير تحديد موقع الفرقة لوحة نهاية في وسط العضلات من خلال البحث عن الفلورسنت المسمى البونغاروكسيين تقاطعات العصبية العضلية تحت الإثارة الضوء الأصفر الأخضر.التحول إلى الإثارة الضوء الأزرق لاستجابات الكالسيوم صورة في العضلات, الخلايا العصبية الحركية, أو خلايا Schwann. في هذا المثال يتم التعبير عن 3 GCaMP في خلايا العضلات. إذا رغبت في ذلك، قم بإعداد مقسم الصورة مع مرشحات تمرير النطاق وتصفية حافة واحدة dichroic للتصوير الطول الموجي المزدوج.إجراء التجارب مع شريط السطوع على شريط الجدول بحث تعيين إلى 110٪ من المستوى الذي مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا التعبير عن الأنسجة معارض التشبع في 20 مرة التكبير دون binning استجابة لكلوريد البوتاسيوم. سجل في 20 لقطة في الثانية الواحدة حتى لا تفوت أي أحداث سريعة. تحفيز مع 1-45 ثانية من 20 إلى 40 هيرتز من تحفيز الأعصاب عن طريق تقديم قطار من النبضات باستخدام قطب شفط وجمع استجابات الكالسيوم الفلورسنت الديناميكية في خلية واحدة فرعية مع الفلورسنت المسمى الفلورسنت ألفا bungarin إشارة الوصل العصبية العضلية.ويمكن أيضا أن تضاف ناهضات الدوائية عن طريق تطبيق حمام أو عن طريق التسريب ويمكن جمع ردود الكالسيوم الفلورسنت دينامية في نفس الطريق. عندما يتم الانتهاء من التصوير أو التجارب الكهربائية الفيزيولوجية لأنه تم تحقيق النتائج المرجوة، ضخ المياه من خلال خطوط القذف وامتصاص الماء مرتين إلى ثلاث مرات من خلال قطب شفط لضمان أن الأملاح لا تتراكم. خريطة مكانية لاستجابات الكالسيوم خلية شوان لتحفيز العصب فينية WNT واحد GCaMP ثلاثة غشاء الماوس في ما بعد الولادة اليوم السابع تظهر قيدا على خلايا Schwann الطفيلية في تقاطع عصبي عضلي.تم تصوير نفس الحجاب الحاجز بعد وضع العلامات مع تسمية الفلورسنت ألفا بونغاروكسيتين، الذي يربط لتمكين مستقبلات أستيل من تقاطع عصبي عضلي. كما تم تصوير نفس الحجاب الحاجز تحت إضاءة برايتفيلد لتوجيه قطب تسجيل إلى منطقة ما بعد الاشتباك العصبي في العضلات عن طريق التقاطع العصبي العضلي. يظهر هنا هو الترسيم المكاني للخلايا الملونة المبرمجة أو المناطق ذات الاهتمام التي اتخذت لتحليل عابري الكالسيوم الفردية.خريطة مكانية من استجابات الكالسيوم الخلية العضلية من mth 5 GCaMP ثلاثة الحجاب الحاجز الماوس في P أربعة لتحفيز العصب في القرنية في وجود مثبطات myosin BHC يظهر استجابة في جميع أنحاء المنطقة بأكملها من جميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز. في المقابل, تحفيز الحجاب الحاجز نفسه في وجود mu-conotoxin يسبب استجابة الكالسيوم المقيدة مكانيا في منطقة الوسيط لجميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز الذي يتوافق مع مستقبلات الأستيل كولين مجموعة المخصب نهاية الفرقة. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو المناعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل، ما هو الملف الشخصي الجزيئي للخلايا التي تم تحديدها بواسطة الفيزيولوجيا الكهربائية أو تصوير الكالسيوم؟يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على استجابات سكانية من خلايا شوان والخلايا العضلية لتحفيز الأعصاب في الفئران الوليدية العادية. ويمكن أيضا أن تطبق على دراسة الفئران القديمة أو على دراسة الفئران التي تعبر عن الأمراض العصبية العضلية البروتينات المرتبطة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

السابقين فيفو تصوير الكالسيوم لتصور استجابات الدماغ للإشارات الغدد الصماء في المورفولوجية

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي من الماوس Geniculate استجابات الخلايا العصبية العقدية لتذوق المحفزات

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم في الزيتون السفلي الماوس

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

في الجسم الحي تصوير الكالسيوم واسع المجال وثنائي الفوتون من فأر باستخدام نافذة جمجمة كبيرة

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

تصوير الكالسيوم في القولون العلوي للفأر

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

محاذاة الألياف المقطعية للتماسك البصري للضوء المرئي مع الصور متحدة البؤر لشبكية العين للماوس نفسه

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

تصوير الكالسيوم في شبكية العين المسطحة المحفزة كهربائيا

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

إكس فيفو تصوير الكالسيوم لنموذج ذبابة الفاكهة للصرع

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...