Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet med midler fra de nationale kontorer i Health (NIH) GM103554 og GM110767 til (T.W.G.) og det nationale Center for forskningsressourcer 5P20RR018751 og National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (til G.W.H.).

Husdyrhold og eksperimenter blev udført i overensstemmelse med de nationale institutter sundhed Guide for pasning og anvendelse af forsøgsdyr og IACUC ved University of Nevada.
1. forberedelse af membraner og Phrenic nerver fra Transgene mus
<ol><li>Køb Transgene mus og oligonukleotid primere til genotype disse mus. Bemærk: Primere er angivet på siden "Information" for hver af disse mus.<ol>
<li>Yngle en 3 til 6 måneder gammel mus udtrykker én kopi af relevante transgene/knock-i Cr...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Her giver vi nogle eksempler på måling Ca2 + svar i bestemte celler i intakt neuromuskulære væv ved hjælp af GECI-udtrykker mus. For at kunne udføre disse eksperimenter, er det absolut nødvendigt ikke at såre den phrenic nerve under dissektion. For at billede Ca2 + svar i Schwann celler ved enten lav eller høj effekt (dvs., 20 X eller 60 X), er det nødvendigt at bruge enten BHC eller µ-conotoxin til blok bevægelse. For energibesparende billeddannelse af Ca2 + svar i m...

NMJ, ligesom alle synapser, er sammensat af tre elementer: et præsynaptiske terminal afledt af en neuron, en postsynaptiske neuron/effektor celler, og en perisynaptic glial celler1,2. Mens de grundlæggende aspekter af synaptisk transmission blev først demonstreret på denne synapse3, forbliver mange aspekter af denne proces ukendt, delvis på grund af udtryk for de samme molekyler af de forskellige cellulære elementer i denne synapse. For eksempel, udtrykkes receptorer for både purin adenin nukleotid ATP og acetylkolin (ACh), som er co udgivet af motor neuroner på de hvirveldyr NMJ, ved muskel, Schwann celler og motoriske neuroner, dermed komplicerer fortolkningen af nogen funktionelle virkninger af disse stoffer (fx, senderen frigivelse eller svar, muskel kraft generation)4. Desuden, selvom de tredelte komponenter af NMJ er enkel sammenlignet med eksempelvis neuroner i det centrale nervesystem, som ofte udviser flere synaptic indgange, om motoriske neuroner, muskelceller eller Schwann celler varierer i respons på stimuli baseret på deres iboende heterogenitet (f.eks.embryonale afledning, fiber subtype, morfologi) er uklart. For at løse alle disse spørgsmål, ville det være en fordel at samtidig spore svar af mange celler i én synaptic element, samt spor, på samme tid, sådan et svar i en af de andre separate elementer. Konventionelle strategier ved hjælp af kemiske farvestoffer til at måle calcium signalerer ikke kan nå disse to mål, fordi bad-anvendt farvestof er taget af flere celletyper efter ansøgning til væv og intracellulært indlæst farvestof kan kun bruges til at visualisere individuelle eller små grupper af celler. Her udnytter Transgene mus at udtrykke GECIs designet til at måle celle-specifikke calcium signalering, sammen med specifikke billedbehandling og software værktøjer5, vi viser først af disse to overordnede mål og diskutere hvordan tilføjelsen af nye transgene værktøjer vil bidrage til at nå andet. Denne teknik vil være nyttig for alle interesserede i at spore calcium dynamics eller andre cellulær signalering begivenheder observerbare gennem gen-kodet optiske sensorer i flere cellepopulationer på samme tid.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

Den elektriske aktivitet i cellerne i væv kan overvåges af elektrofysiologiske teknikker, men disse er normalt begrænset til analyse af individuelle celler. Da en forøgelse af intracellulære calcium (Ca2 +) i cytosol ofte opstår på grund af den elektriske aktivitet, eller som svar på et utal af andre stimuli, denne proces kan blive overvåget af fyldt billeddannelse af celler med fluorescerende calcium-følsomme farvestoffer.  Det er imidlertid vanskeligt at billede dette svar i en enkelt celletype inden for hele væv, fordi disse farvestoffer er taget af alle celletyper i vævet. I modsætning hertil er genetisk kodet calcium indikatorer (GECIs) kan udtrykkes ved en enkelt celletype og fluorescerer reaktion på en stigning af intracellulære Ca2 +, dermed tillade billeddannelse af Ca2 + signalering i hele populationer af enkelte celletyper. Her, vi anvender brug af GECIs GCaMP3/6 til musen neuromuskulære junction, en treparts synapse mellem motoriske neuroner, skeletmuskulatur og terminal/perisynaptic Schwann celler. Vi påvise nytten af denne teknik i klassiske ex vivo væv præparater. Ved hjælp af en optisk splitter, udføre vi dual-bølgelængde billeddannelse af dynamiske Ca2 + signaler og en statisk label af den neuromuskulære junction (NMJ) i en tilgang, der nemt kunne tilpasses til at overvåge to celle-specifikke GECI eller genetisk kodet spænding indikatorer (GEVI) samtidigt. Endelig vil diskutere vi rutiner bruges til at indfange rumlige maps af fluorescens intensitet. Sammen, kan disse optiske, transgene og analytiske teknikker anvendes til at studere den biologiske aktivitet i særskilte celle delpopulationer på NMJ i en lang række sammenhænge.

Flere eksempler af fluorescens intensitet ændringer, medieret af stigninger af intracellulære Ca2 + inden for definerede celletyper af NMJ, Vis nytten af denne fremgangsmåde. Disse resultater præsenteres som rumlige fluorescens intensitet kort, som giver placeringen af besvarende celler samt intensiteten af deres svar, således at til vurdering af hvor mange celler reagerer og hvor meget hver celle reagerer på en bestemt stimulus. For eksempel som vist i <strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Her præsenterer vi en protokol til billede calcium signalering i populationer af enkelte celletyper på murine neuromuskulære junction.

Ex Vivo Billeddannelse af celle-specifikke Calcium signalerer på den tredelte Synapse mus membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i neuromuskulær felt, såsom den rolle, calcium signalering i muskel eller Schwann celler som reaktion på nerve stimulation. Den største fordel ved denne teknik er, at man kan billede aktivering af specifikke celletyper som reaktion på nerve stimulation. Til at begynde med skal du anskaffe transgene mus og genotype dem som beskrevet i tekstprotokollen.Efter dødshjælp, tværgående sektion på tværs af hele dyret lige under leveren og lige over hjertet og lungerne med iridectomy saks. Dissekere leveren, hjertet og lungerne væk. Vær omhyggelig med at opretholde en længde af phrenic nerve, der er tilstrækkelig lang nok til at blive trukket ind i en sugeelektrode.Fjern brystkassen og rygsøjlen yderligere, bortset fra den tynde højderyg omkring mellemgulvet. Mellemgulvet og phrenic nerveprøven anbringes i et mikrofugerør med Krebs-Ringer-opløsning, der indeholder et mikrogram pr. milliliter fluorescerende mærket alfa bungarotoxin. Lad prøven inkuberes i opløsningen i 10 minutter i mørke.Brug minutien stifter immobilisere mellemgulvet ved pinning det på en seks centimeter fad belagt med silikone dielektrisk gel og fyldt med cirka otte milliliter iltet Krebs-Ringer løsning. Anstæn skal du placere skålen på mikroskopscenen. Derefter gennemgå mellemgulvet med mere Krebs-Ringer opløsning på otte milliliter i minuttet i 30 minutter.Ved fire gange forstørrelse, ved hjælp af en mikromanipulator, flytte suge elektroden over venstre phrenic nerve. Påfør sugeevnen ved at trække tønden ud af en fem milliliter sprøjte forbundet til slangen, der er fastgjort til sugeelektroden. Sørg for, at mellemgulvet kontrakter som reaktion på den ene hertz stimulation ved visuelt at undersøge det med Brightfield belysning.Hvis ikke, skal du justere spændingen ved at dreje spændingsknappen trinvist for at opnå en supramaksimale puls, som kan verificeres ved visuel undersøgelse af muskelsammentrækning. Hvis det stadig ikke er synligt, skal du blæse nerven ud med sprøjten og forsøge at trække den ind igen ved at påføre sug. Nu, slukke perfusion at tilføje muskel-specifikke myosin hæmmer BHC eller spændingen gated natrium kanal antagonist mu-conotoxin.Bhc fortyndingen klargør den ved at pipettere fire mikroliter med 200 millimolarstrøm BHC i DMSO i en milliliter Krebs-Ringer-opløsning. Fjern en milliliter Krebs-Ringer opløsning fra skålen. Tilsæt derefter den fortyndede BHC til skålen.Efter 30 minutter tændes perfusionen af frisk Krebs-Ringer-opløsning i yderligere 20 til 30 minutter. Iført handsker, forberede optagelsen elektrode ved at placere en borosilikat filamenteret glas med en ydre diameter på en millimeter og en indre diameter på 0,4 millimeter i en mikropipette puller. Stram urskivene for at klemme den på plads og luk pullerdøren.Programmer derefter pulleren som beskrevet i tekstprotokollen. For embryonale membraner måles modstanden ved hjælp af softwarekontroller af forstærkeren. Sørg for, at modstanden er nær 60 megaohms og for ældre membraner, 10 til 20 megaohms.Læg nu optageelektroden med tre molære kaliumchlorid. Ved 10 gange forstørrelse sænkes elektroden til musklen ved hjælp af en anden mikromanipulator på den modsatte side af scenen som en stimulerende elektrode. Brug af elektrofysiologisk dataerhvervelsessoftware vente, indtil hvilemembranen potentielle ændringer fra nul til minus 65 millivolts eller derunder.Stimulere på en hertz og kontrollere tilstedeværelsen af en muskel handling potentiale ved at kontrollere for et stort potentiale, der udviser en beskeden overskridelse. Må ikke forveksle stimulation artefakt med en handling potentiale. På 20 gange forstørrelse finde endepladen bånd i midten af musklen ved at lede efter fluorescerende mærket alpha bungarotoxin neuromuskulære kryds under grønt gult lys excitation.Skift til blåt lys excitation til billedet calcium reaktioner i muskel, motor neuron, eller Schwann celler. I dette eksempel udtrykkes GCaMP tre i muskelceller. Hvis det ønskes, skal du indstille billedsplitteren med båndpasfiltre og et dichroic enkeltkantfilter til den dobbelte bølgelængdebilleddannelse.Udfør eksperimenter med lysstyrkelinjen på opslagstabellinjen sat til 110% af det niveau, hvor den genetisk kodede calciumindikator, der udtrykker væv, udviser mætning ved 20 gange forstørrelse uden binning som reaktion på kaliumchlorid. Optag på 20 billeder i sekundet, så ikke at gå glip af nogen hurtige begivenheder. Stimulere med en til 45 sekunder af 20 til 40 hertz af nerve stimulation ved at levere et tog af impulser ved hjælp af en sugeelektrode og indsamle dynamiske fluorescerende calcium reaktioner i en celle sub-type sammen med den statiske fluorescerende mærket alpha bungarotoxin neuromuskulære krydset signal.Farmakologiske agonister kan også tilsættes ved bad ansøgning eller ved perfusion og den dynamiske fluorescerende calcium reaktioner kan indsamles på samme måde. Når billeddannelse eller elektrofysiologiske eksperimenter er færdige, fordi de ønskede resultater er opnået, perfuse vand gennem perfusion linjer og suge vand to til tre gange gennem suge elektroden for at sikre, at salte ikke opbygges. En rumlig kort over Schwann celle calcium reaktioner på phrenic nerve stimulation af en Wnt en GCaMP tre mus membran på post natal dag syv viser en begrænsning til terminal parasynaptic Schwann celler på neuromuskulære krydset.Den samme membran blev afbildet efter mærkning med fluorescerende mærket alpha bungarotoxin, som binder sig til at aktivere acetylcholin receptorer af neuromuskulære krydset. Den samme membran blev også afbildet under Brightfield belysning til at guide en optagelse elektrode til post-synaptic region af musklen ved neuromuskulær krydset. Vist her er rumlig afgrænsning af farvekodede celler eller områder af interesse taget til analyse af individuelle calciumtransienter.Den rumlige kort over muskel celle calcium svar af en mth 5 GCaMP tre mus membran på P fire til phrenic nerve stimulation i overværelse af myosin hæmmer BHC viser en reaktion i hele regionen af alle membran muskelceller. I modsætning hertil forårsager stimulering af den samme membran i nærvær af mu-conotoxin en rumlig begrænset calcium respons i den mediale region af alle membran muskelceller, der svarer til acetylcholin receptor klynge beriget ende plade bånd. Efter denne procedure andre metoder som immun-histochemistry eller immunoblotting kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål såsom, hvad er den molekylære profil af celler identificeret ved elektrofysiologi eller calcium imaging?Denne metode kan give indsigt i befolkningens reaktioner af Schwann celler og muskelceller til nervestimulation i normale neonatal mus. Det kan også anvendes til undersøgelse af ældre mus eller til undersøgelse af mus, der udtrykker neuromuskulær sygdom associeret proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging til at visualisere hjernen svar til hormonforstyrrende signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Calcium Imaging af Mus Geniculate Ganglion Neuron Svar på Smag Stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Bredfelts- og to-foton calciumbilleddannelse fra en mus ved hjælp af et stort kranievindue

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Calciumbilleddannelse i mus overlegen colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering af optisk kohærenstomografi i synligt lys med konfokale billeder af samme musenethinde

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Calciumbilleddannelse i elektrisk stimulerede fladmonterede nethinden

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex vivo Calcium Imaging for Drosophila Model af epilepsi

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...