Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Dit werk werd gesteund met fondsen van de National Institutes of Health (NIH) GM103554 en GM110767 aan (T.W.G.) en van het National Center for onderzoeksmiddelen 5P20RR018751 en het National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (voor G.W.H.).

Veeteelt en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de IACUC bij de Universiteit van Nevada.
1. bereiding van het pessarium en de Phrenic van de zenuwen van transgene muizen
<ol><li>Aankoop transgene muizen en oligonucleotide inleidingen te genotype deze muizen. Opmerking: De inleidingen zijn vermeld op de pagina 'Informatie' voor elk van deze muizen.<ol>
<li>Fokken van een 3 - tot 6-maa...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Wij bieden hier enkele voorbeelden van het meten van Ca2 + reacties in specifieke cellen in intact neuromusculaire weefsel met behulp van GECI-uiten muizen. Om deze experimenten uitvoeren, is het absoluut noodzakelijk niet te verwonden de phrenic zenuw tijdens de dissectie. Naar image Ca2 + antwoorden in de cellen van Schwann op lage of hoge kracht (dat wil zeggen, 20 X of 60 X), moet het BHC of µ-conotoxin naar Blokverplaatsing gebruiken. Voor de beeldvorming van de spaarstand van Ca...

De NMJ, zoals alle synapsen, bestaat uit drie elementen: een presynaptische terminal afgeleid van een neuron, een postsynaptisch neuron/effector cel, en een perisynaptic gliale cel1,2. Terwijl de basisaspecten van synaptische transmissie werden eerst gedemonstreerd op deze synapse3, blijven vele aspecten van dit proces onbekend, gedeeltelijk als gevolg van de expressie van de dezelfde moleculen door de verschillende cellulaire elementen van deze synapsen. Bijvoorbeeld, worden receptoren voor zowel de purine adenine nucleotide ATP en acetylcholine (ACh), die mede door motorische neuronen bij de gewervelde NMJ zijn vrijgegeven, uitgedrukt door spieren, cellen van Schwann en motorische neuronen, dus de interpretatie van een complicerende functioneel effect uitgeoefend door deze stoffen (b.v., zender release of reactie, spier strijdkrachtgeneratie)4. Bovendien, hoewel de tripartiete componenten van de NMJ eenvoudig zijn in vergelijking met, bijvoorbeeld neuronen in het centrale zenuwstelsel die vaak meerdere synaptic ingangen vertonen, of motorische neuronen, spiercellen, of cellen van Schwann in reactie op stimuli op basis verschillen op hun intrinsieke heterogeniteit (bijvoorbeeldembryonale afleiding, vezel subtype, morfologie) is onduidelijk. Om elk van deze kwesties, zou het voordelig voor het gelijktijdig het bijhouden van de reactie van veel cellen binnen één synaptic element, evenals spoor, op hetzelfde moment, een dergelijk antwoord op een van de andere afzonderlijke elementen. Conventionele strategieën door middel van chemische kleurstoffen te meten calcium signalering niet kunnen deze twee doelen, bereiken omdat Bad-toegepast kleurstof in beslag door meerdere celtypen na toepassing aan weefsel genomen wordt, en intracellulair geladen kleurstof kan alleen worden gebruikt om te visualiseren individuele of kleine cohorten van cellen. Hier, met behulp van transgene muizen uiting van GECIs ontworpen voor de meting van de cel-specifieke calcium signalering, samen met specifieke imaging en software tools5, we tonen de eerste van deze twee algemene doelstellingen en bespreken hoe de toevoeging van nieuwe transgene hulpmiddelen zou helpen met het bereiken van de tweede. Deze techniek zal zitten nuttig voor iedereen die geïnteresseerd is in het bijhouden van calcium dynamics of andere cellulaire gebeurtenissen waarneembare signalering via gen gecodeerde optische sensoren in meerdere cel populaties op hetzelfde moment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

De elektrische activiteit van cellen in weefsels door elektrofysiologische technieken kan worden gecontroleerd, maar deze zijn meestal beperkt tot de analyse van afzonderlijke cellen. Aangezien een verhoging van intracellulair calcium (Ca2 +) in het cytosol wordt vaak door de elektrische activiteit veroorzaakt, of in antwoord op een groot aantal andere stimuli, dit proces kan worden gecontroleerd door de beeldvorming van cellen geladen met fluorescerende calcium-gevoelige kleurstoffen.  Het is echter moeilijk om het imago van deze reactie in een afzonderlijke celtype binnen hele weefsel, omdat deze kleurstoffen worden overgenomen door alle celtypes in het weefsel. In tegenstelling, genetisch gecodeerde calcium indicatoren (GECIs) kunnen worden uitgedrukt in een afzonderlijke celtype en lichten in antwoord op een verhoging van intracellulaire Ca2 +, dus de beeldvorming van Ca2 + signalering in hele bevolkingen van het toelaat individuele celtypes. Hier, wij het gebruik van de GECIs GCaMP3/6 van toepassing op de muis motorische eindplaat, een tripartiete SYNAPS tussen motorische neuronen, skeletspieren en terminal/perisynaptic cellen van Schwann. We tonen het nut van deze techniek in klassieke ex vivo weefsel preparaten. Met behulp van een optische splitter, voeren wij dual-golflengte beeldvorming van dynamische Ca2 + signalen en een statische label van de motorische eindplaat (NMJ) in een benadering die kan gemakkelijk aangepast worden aan twee cel-specifieke GECI of genetisch gecodeerde spanning controleren indicatoren (GEVI) tegelijk. Tot slot bespreken we de routines gebruikt voor het vastleggen van ruimtelijke kaarten van de intensiteit van de fluorescentie. Samen kunnen deze optische, transgene en analytische technieken worden toegepast om te bestuderen van de biologische activiteit van afzonderlijke cel subpopulaties op de NMJ in een breed scala van contexten.

Verschillende voorbeelden van fluorescentie intensiteit veranderingen, gemedieerd door verhogingen van intracellulaire Ca2 + binnen de gedefinieerde celtypes van het NMJ, tonen het nut van deze aanpak. Deze resultaten worden gepresenteerd als ruimtelijke fluorescentie intensiteit kaarten, waarmee de locatie van de reagerende cellen, alsmede de intensiteit van hun antwoorden, zodat voor de beoordeling van hoeveel cellen reageren en hoeveel elke cel reageert op een bepaalde stimu...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Hier presenteren we een protocol bij afbeelding calcium signalering bij populaties van individuele celtypes op de lymfkliertest motorische eindplaat.

Ex Vivo Beeldvorming van cel-specifieke Calcium signalering in de tripartiete Synaps van het middenrif muis

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het neuromusculaire veld, zoals de rol van calcium signalering in spier- of Schwanncellen in reactie op zenuwstimulatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men de activering van specifieke celtypes kan beeld in reactie op zenuwstimulatie. Om te beginnen, verkrijgen van transgene muizen, en genotype ze zoals beschreven in het tekstprotocol.Na euthanasie, dwars doorsnede over het hele dier net onder de lever en net boven het hart en de longen met een irisctomieschaar. Ontleed de lever, het hart en de longen. Voorzichtig zijn om een lengte van de phrenic zenuw die voldoende lang genoeg is om te worden getrokken in een zuigelektrode te handhaven.Verwijder verder de ribbenkast en de wervelkolom, met uitzondering van de dunne nok rond het middenrif. Plaats het middenrif en het phrenic zenuwmonster in een microfugebuis met Krebs-Ringer oplossing die één microgram per milliliter fluorescerend gelabeld alfa bungarotoxine bevat. Laat het monster in het donker 10 minuten in de oplossing uitbroeden.Met behulp van minutien pinnen immobiliseren het middenrif door pinning het op een schaal van zes centimeter bekleed met siliconen diëlektrische gel en gevuld met ongeveer acht milliliter zuurstofrijke Krebs-Ringer oplossing. Leg de schotel op het microscooppodium. Vul vervolgens het middenrif door met meer Krebs-Ringer-oplossing met acht milliliter per minuut gedurende 30 minuten.Bij vier keer vergroting, met behulp van een micromanipulator, verplaats de zuigelektrode over de linker phrenic zenuw. Breng de zuigkracht aan door het vat van een vijf milliliter spuit eruit te trekken die is aangesloten op de slang die aan de zuigelektrode is bevestigd. Zorg ervoor dat het middenrif contracten in reactie op de ene hertz stimulatie door visueel te onderzoeken met Brightfield verlichting.Zo niet, pas de spanning door het draaien van de spanning knop stapsgewijs om een supramaximale puls die kan worden geverifieerd door visueel onderzoek van spiercontractie te bereiken. Als nog steeds niet zichtbaar, blaas de zenuw met de spuit en proberen om het te trekken in opnieuw door het toepassen van zuigkracht. Zet nu de perfusie uit om de spierspecifieke myosineremmer BHC of de spanning gated natriumkanaal antagonist mu-conotoxine toe te voegen.Bereid de BHC pre-verdunning door het pipetten van vier microliters van 200 millimolar voorraad BHC in DMSO in een milliliter van Krebs-Ringer oplossing. Haal een milliliter Krebs-Ringer-oplossing uit de schaal. Voeg vervolgens de voorverdunde BHC toe aan de schotel.Zet na 30 minuten de perfusie van verse Krebs-Ringer-oplossing nog 20 tot 30 minuten aan. Het dragen van handschoenen, bereiden de opname elektrode door het plaatsen van een borosilicaat filamented glas met een buitenste diameter van een millimeter en een binnendiameter van 0,4 millimeter in een micropipette trekker. Draai de wijzerplaten vast om deze in positie te klemmen en sluit de deur van de trekker.Programmeer vervolgens de trekker zoals beschreven in het tekstprotocol. Voor embryonale diafragma's meet u de weerstand met behulp van softwarebesturingselementen van de versterker. Zorg ervoor dat de weerstand is in de buurt van 60 megaohms en voor oudere diafragma's, 10 tot 20 megaohms.Laad de opnameelektrode met drie molaire kaliumchloride. Bij 10 keer vergroting, laat de elektrode in de spier met behulp van een tweede micromanipulator aan de andere kant van het podium als een stimulerende elektrode. Met behulp van elektrofysiologische data acquisitie software wachten tot de rustende membraan potentieel verandert van nul tot min 65 millivolt of lager.Stimuleren op een hertz en controleer de aanwezigheid van een spier actie potentieel door te controleren op een groot potentieel dat een bescheiden overshoot vertoont. Verwar stimulatieartefact niet met een actiepotentieel. Bij 20 keer vergroting lokaliseren van de eindplaat band in het midden van de spier door te zoeken naar fluorescerend gelabeld alpha bungarotoxine neuromusculaire knooppunten onder groen geel licht excitatie.Overschakelen naar blauw licht excitatie naar beeld calcium reacties in spier, motorneuron, of Schwann cellen. In dit voorbeeld wordt GCaMP drie uitgedrukt in spiercellen. Stel indien gewenst de beeldsplitser in met bandpassfilters en een dichroic single edge filter voor de dubbele golflengte beeldvorming.Voer experimenten uit met de helderheidsbalk op de opzoektafelbalk die is ingesteld op 110% van het niveau waarop de genetisch gecodeerde calciumindicator die weefsel uitdrukt, verzadiging vertoont bij 20 keer vergroting zonder binning in reactie op kaliumchloride. Record op 20 frames per seconde dus niet te missen snelle evenementen. Stimuleer met één tot 45 seconden van 20 tot 40 hertz zenuwstimulatie door een trein van impulsen te leveren met behulp van een zuigelektrode en verzamel dynamische fluorescerende calciumreacties in één celsubtype samen met het statische fluorescerende alfaimparotoxine neuromusculaire verbindingssignaal.Farmacologische agonisten kunnen ook worden toegevoegd door badtoepassing of perfusie en de dynamische fluorescerende calciumreacties kunnen op dezelfde manier worden verzameld. Wanneer de beeldvorming of elektrofysiologische experimenten zijn voltooid omdat de gewenste resultaten zijn bereikt, doorsneed water door de perfusielijnen en zuigen water twee tot drie keer door de zuigelektrode om ervoor te zorgen dat zouten niet opbouwen. Een ruimtekaart van de celcalciumreacties van Schwann aan phrenic zenuwstimulatie van een Wnt GCaMP drie muisdiafragma op post natale dag zeven toont een beperking aan terminale parasynaptische Schwann cellen bij de neuromusculaire verbinding.Hetzelfde diafragma werd afgebeeld na het labelen met fluorescerend gelabeld alpha bungarotoxine, die obligaties om acetylcholine receptoren van de neuromusculaire kruising mogelijk te maken. Hetzelfde diafragma werd ook afgebeeld onder Brightfield verlichting om een opname-elektrode te begeleiden naar de post-synaptische regio van de spier door de neuromusculaire verbinding. Hier wordt ruimtelijke afbakening van kleurgecodeerde cellen of gebieden van belang genomen voor de analyse van individuele calcium voorbijgaande stoffen.De ruimtelijke kaart van spiercel calcium reacties van een mth 5 GCaMP drie muis diafragma bij P vier tot phrenic zenuwstimulatie in aanwezigheid van de myosine remmer BHC toont een reactie in het hele gebied van alle diafragma spiercellen. In tegenstelling, stimulatie van hetzelfde diafragma in de aanwezigheid van mu-conotoxine veroorzaakt een ruimtelijk beperkte calciumrespons in het mediale gebied van alle diafragma spiercellen die overeenkomt met de acetylcholine receptor cluster verrijkt eindplaat band. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals immuno-histochemie of immunoblotting om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals, wat is het moleculaire profiel van cellen geïdentificeerd door elektrofysiologie of calciumbeeldvorming?Deze methode kan inzicht geven in de reacties van de bevolking van Schwann cellen en spiercellen op zenuwstimulatie in normale neonatale muizen. Het kan ook worden toegepast op de studie van oudere muizen of op de studie van muizen die neuromusculaire ziekte geassocieerde eiwitten uitdrukken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging voor het visualiseren van hersenen reacties op endocriene signalering in Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Wide-Field en Two-Photon Calcium Imaging van een muis met behulp van een groot craniaal venster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Uitlijning van optische coherentietomografievezelgrammen in zichtbaar licht met confocale beelden van hetzelfde netvlies van de muis

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Calciumbeeldvorming in elektrisch gestimuleerde plat gemonteerde netvliezen

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Calciumbeeldvorming voor Drosophila-model van epilepsie

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...