Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ce travail a été soutenu avec des fonds des National Institutes of Health (NIH) GM103554 et GM110767 à (T.W.G.) et le National Center for Research Resources 5P20RR018751 et le National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (pour G.W.H.).

L’élevage et les expériences ont été effectuées conformément au instituts nationaux de santé Guide pour les soins et utilisation des animaux de laboratoire et l’IACUC à l’Université du Nevada.
1. préparation des diaphragmes et des nerfs phréniques chez des souris transgéniques
<ol><li>Acheter souris transgéniques et des amorces au génotype de ces souris. Remarque : Les amorces sont répertoriés sur la page « Informations » pour chacun de ces souris.<ol>
<li>Repro...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Nous fournissons ici quelques exemples de mesure Ca2 + réponses dans certaines cellules dans le tissu neuromusculaire intact, à l’aide de souris exprimant le GECI. Pour réaliser ces expériences, il est impératif de ne pas blesser le nerf phrénique au cours de la dissection. Pour image réponses Ca2 + dans les cellules de Schwann à haute ou basse puissance (c'est-à-dire, 20 X ou 60 X), il est nécessaire d’utiliser le BHC ou µ-conotoxine au mouvement du bloc. Pour l’imagerie d...

Le NMJ, comme toutes les synapses, se compose de trois éléments : une terminaison présynaptique dérivé d’un neurone, une cellule de neurone postsynaptique/effecteurs, et un périsynaptique glial cell1,2. Alors que les aspects fondamentaux de la transmission synaptique étaient tout d’abord montrés à cette synapse3, beaucoup d’aspects de ce processus demeure inconnus, en partie en raison de l’expression des molécules de mêmes par les éléments cellulaires distincts de cette synapse. Par exemple, des récepteurs pour les séquences de nucléotides puriques adénine ATP et l’acétylcholine (ACh), qui sont conjointement libérées par les neurones moteurs à la NMJ vertébré, sont exprimés par muscle, les cellules de Schwann et les neurones moteurs, ce qui complique l’interprétation de le quelconque effet fonctionnel exercée par ces substances (p. ex., libération des transmetteurs ou réponse, génération de la force musculaire)4. En outre, bien que les composants tripartites de la NMJ sont simples par rapport à, par exemple, les neurones du système nerveux central qui présentent souvent des entrées synaptiques multiples, si les motoneurones, les cellules musculaires ou des cellules de Schwann varient en réponse à des stimuli basé sur leur intrinsèque hétérogénéité (p. ex., dérivation embryonnaire, sous-type de fibre, morphologie) n’est pas claire. Afin de répondre à chacune de ces questions, il serait avantageux de suivre simultanément la réponse de plusieurs cellules dans un seul élément synaptique, ainsi que piste, en même temps, une telle réponse dans un des autres éléments distincts. Les stratégies conventionnelles utilisant des teintures chimiques pour mesurer la signalisation calcique ne peut pas atteindre ces deux buts, car appliqué au bain de teinture est repris par plusieurs types de cellules après application sur tissu, et utilisable uniquement dans les cellules chargées de colorant pour visualiser individuels ou de petites cohortes de cellules. Ici, utilisant des souris transgéniques exprimant GECIs conçu pour mesurer la signalisation calcique spécifique des cellules, ainsi que l’imagerie spécifique et logiciels outils5, nous montrer la première de ces deux objectifs généraux et discuter comment l’ajout de nouveaux outils transgéniques permettrait d’atteindre le second. Cette technique sera utile pour tous ceux intéressés par le suivi dynamique du calcium ou autres cellulaires observables d’événements de signalisation par l’intermédiaire de capteurs optiques gène codé dans plusieurs populations de cellules en même temps.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

L’activité électrique des cellules dans les tissus peut être surveillée par des techniques électrophysiologiques, mais ceux-ci sont généralement limités à l’analyse des cellules individuelles. Puisqu’une augmentation du calcium intracellulaire (Ca2 +) dans le cytosol se produit souvent en raison de l’activité électrique, ou en réponse à une myriade d’autres stimuli, ce processus peut être surveillé par l’imagerie de cellules chargé avec fluorescentes sensibles au calcium colorants.  Toutefois, il est difficile d’imager cette réponse en un type de cellule individuelle au sein de tissus entiers parce que ces colorants sont repris par tous les types de cellules dans les tissus. En revanche, les indicateurs de calcium génétiquement encodé (GECIs) peuvent être exprimées par un type de cellule individuelle et sont fluorescents en réponse à une augmentation du Ca intracellulaire2 +, ce qui permet l’imagerie de Ca2 + signalisation des populations entières de types de cellules individuelles. Ici, nous appliquons l’utilisation du GECIs GCaMP3/6 à la jonction neuromusculaire de la souris, une synapse tripartite entre les motoneurones du muscle squelettique et terminal/périsynaptique les cellules de Schwann. Nous démontrent l’utilité de cette technique dans les préparations de tissu classique ex vivo . À l’aide d’un diviseur optique, nous réalisons l’imagerie double longueur d’onde des signaux dynamiques de Ca2 + et une étiquette statique de la jonction neuromusculaire (NMJ) dans une approche qui pourrait être facilement adaptée pour surveiller deux GECI spécifiques des cellules ou tension génétiquement encodée indicateurs (GEVI) simultanément. Finalement, nous discutons les routines utilisées pour capturer des cartes spatiales de l’intensité de la fluorescence. Ensemble, ces techniques optiques, transgéniques et analytiques peuvent être utilisées pour étudier l’activité biologique des sous-populations de cellules distinctes à la NMJ dans une grande variété de contextes.

Plusieurs exemples de changements d’intensité de fluorescence, médiées par l’augmentation du Ca intracellulaire2 + dans les types de cellules déterminées de la NMJ, montrent l’utilité de cette approche. Ces résultats sont présentés sous forme de cartes d’intensité spatiale de fluorescence, qui fournissent la localisation des cellules ayant répondu au questionnaire, ainsi que l’intensité de leurs réponses, ce qui permet l’évaluation de combien les cellu...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Nous présentons ici un protocole au calcium image de signalisation dans les populations de types de cellules individuelles à la jonction neuromusculaire murine.

Ex Vivo Imagerie du Calcium cellulaire spécifique de signalisation à la Synapse Tripartite du diaphragme souris

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuromusculaire, comme le rôle de la signalisation du calcium dans les cellules musculaires ou schwann en réponse à la stimulation nerveuse. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut l’image de l’activation de types de cellules spécifiques en réponse à la stimulation nerveuse. Pour commencer, obtenir des souris transgéniques, et génotypez-les comme détaillé dans le protocole de texte.Après l’euthanasie, section transversale à travers l’animal entier juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux iridectomy. Disséquez le foie, le cœur et les poumons. Prendre soin de maintenir une longueur du nerf phrénique suffisamment longue pour être aspirée dans une électrode d’aspiration.Retirez davantage la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la mince crête autour du diaphragme. Placez le diaphragme et l’échantillon de nerf phrénique dans un tube de microfuge avec la solution Krebs-Ringer contenant un microgramme par millilitre d’alpha bungarotoxin étiqueté fluorescent. Laissez le spécimen couver dans la solution pendant 10 minutes dans l’obscurité.À l’aide d’épingles minutien immobiliser le diaphragme en l’épinglant sur un plat de six centimètres recouvert de gel diélectrique en silicone et rempli d’environ huit millilitres de solution Krebs-Ringer oxygénée. Placez le plat au microscope. Ensuite, perfusez le diaphragme avec plus de solution Krebs-Ringer à huit millilitres par minute pendant 30 minutes.À quatre reprises grossissement, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacer l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche. Appliquez l’aspiration en retirant le canon d’une seringue de cinq millilitres reliée au tube qui est fixé à l’électrode d’aspiration. Assurez-vous que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation hertzienne en l’examinant visuellement avec l’éclairage Brightfield.Sinon, ajustez la tension en tournant le bouton de tension progressivement pour obtenir une impulsion supramaximale qui peut être vérifiée par l’examen visuel de la contraction musculaire. S’il n’est toujours pas visible, soufflez le nerf avec la seringue et essayez de la tirer à nouveau en appliquant l’aspiration. Maintenant, éteignez la perfusion pour ajouter l’inhibiteur de la myosine spécifique au muscle BHC ou l’antagoniste du canal de sodium fermé par tension mu-conotoxin.Préparer la pré-dilution du BHC en pipetant quatre microlitres de 200 millimolaires de stock BHC dans DMSO en un millilitre de solution Krebs-Ringer. Retirer un millilitre de la solution Krebs-Ringer du plat. Ajouter ensuite le BHC pré-dilué au plat.Après 30 minutes, allumer la perfusion de la solution Krebs-Ringer fraîche pendant encore 20 à 30 minutes. En portant des gants, préparez l’électrode d’enregistrement en plaçant un verre filamenté borosilicate d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre intérieur de 0,4 millimètre dans un pull de micropipette. Serrez les cadrans pour le serrer en position et fermez la porte du tiroir.Programmez ensuite le puller tel que décrit dans le protocole texte. Pour les diaphragmes embryonnaires, mesurez la résistance à l’aide des commandes logicielles de l’amplificateur. Assurez-vous que la résistance est proche de 60 mégaohms et pour les diaphragmes plus anciens, 10 à 20 mégaohms.Maintenant, chargez l’électrode d’enregistrement avec trois chlorure de potassium molaire. À 10 fois le grossissement, abaissez l’électrode dans le muscle à l’aide d’un deuxième micromanipulateur de l’autre côté de la scène comme électrode stimulante. À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez que le potentiel de la membrane de repos passe de zéro à moins 65 millivolts ou moins.Stimulez à un hertz et vérifiez la présence d’un potentiel d’action musculaire en vérifiant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste. Ne confondez pas l’artefact de stimulation avec un potentiel d’action. À 20 fois le grossissement localiser la bande de plaque d’extrémité au centre du muscle en recherchant fluorescente étiquette alpha bungarotoxin jonctions neuromusculaires sous excitation lumière jaune vert.Passez à l’excitation de la lumière bleue pour l’image des réponses de calcium dans les cellules musculaires, motoneuriques ou schwann. Dans cet exemple GCaMP trois est exprimé dans les cellules musculaires. Si vous le souhaitez, configurez le séparateur d’image avec des filtres de passage de bande et un filtre dichroïque à bord unique pour l’imagerie à double longueur d’onde.Effectuez des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de table de recherche fixée à 110% du niveau auquel l’indicateur de calcium génétiquement codé exprimant les tissus présente une saturation à 20 fois le grossissement sans binning en réponse au chlorure de potassium. Enregistrez à 20 images par seconde afin de ne pas manquer d’événements rapides. Stimulez avec un à 45 secondes de 20 à 40 hertz de stimulation nerveuse en livrant un train d’impulsions à l’aide d’une électrode d’aspiration et de recueillir des réponses dynamiques de calcium fluorescent dans un sous-type cellulaire avec le statique fluorescent étiqueté alpha bungarotoxin signal de jonction neuromusculaire.Les agonistes pharmacologiques peuvent également être ajoutés par application de bain ou par perfusion et les réponses fluorescentes dynamiques de calcium peuvent être rassemblées de la même manière. Lorsque les expériences d’imagerie ou d’électrophysiologie sont terminées parce que les résultats souhaités ont été atteints, perfuser l’eau à travers les lignes de perfusion et sucer l’eau deux à trois fois à travers l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne s’accumulent pas. Une carte spatiale des réponses de calcium de cellules de Schwann à la stimulation phrénique de nerf d’un Wnt un GCaMP trois diaphragme de souris au septième jour post natal montrent une restriction aux cellules synaptiques terminales de Schwann à la jonction neuromusculaire.Le même diaphragme a été photographié après étiquetage avec bungarotoxin alpha fluorescentement étiqueté, qui se lie pour permettre aux récepteurs d’acétylcholine de la jonction neuromusculaire. Le même diaphragme a également été photographié sous l’illumination de Brightfield pour guider une électrode d’enregistrement à la région post-synaptique du muscle par la jonction neuromusculaire. Il est indiqué ici la démarcation spatiale des cellules codées en couleur ou des régions d’intérêt prises pour l’analyse des transitoires individuels de calcium.La carte spatiale des réponses de calcium de cellules musculaires d’un mth 5 GCaMP trois diaphragme de souris à P quatre à la stimulation phrénique de nerf en présence de l’inhibiteur de myosin BHC montre une réponse dans toute la région de toutes les cellules musculaires de diaphragme. En revanche, la stimulation du même diaphragme en présence de mu-conotoxine provoque une réponse de calcium spatialement restreinte dans la région médiale de toutes les cellules musculaires du diaphragme qui correspond à la bande de plaque d’extrémité enrichie par cluster récepteur d’acétylcholine. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’immuno histochimie ou l’immunoblotting peuvent être réalisées afin de répondre à d’autres questions telles que le profil moléculaire des cellules identifiées par électrophysiologie ou imagerie calcique?Cette méthode peut fournir un aperçu des réponses de la population des cellules de Schwann et des cellules musculaires à la stimulation nerveuse chez les souris néonatales normales. Il peut également être appliqué à l’étude de souris plus âgées ou à l’étude de souris exprimant des protéines associées aux maladies neuromusculaires.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

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Recherche

Neurosciences

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