Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Diese Arbeit wurde mit Mitteln aus den National Institutes of Health (NIH) GM103554 und GM110767, (T.W.G.) und das National Center for Research Resources 5P20RR018751 und das National Institute of General Medical Sciences 8 P 20 GM103513 (zu G.W.H.) unterstützt.

Tierhaltung und Experimente wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und die IACUC an der University of Nevada durchgeführt.
1. Vorbereitung von Membranen und phrenicus Nerven von transgenen Mäusen
<ol><li>Kaufen Sie Transgene Mäuse und Oligonucleotide Zündkapseln, Genotyp dieser Mäuse. Hinweis: Die Primer werden für jede dieser Mäuse auf der Seite "Informationen" aufgeführt.<ol>
<li>Züchten von 3 bis...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Hier stellen wir einige Beispiele für Ca2 + Antworten in bestimmte Zellen in intaktem neuromuskuläre Gewebe mit Hilfe von GECI exprimierenden Mäusen zu messen. Um diese Experimente erfolgreich durchführen zu können, ist es nicht unbedingt Nervus phrenicus während der Präparation zu verletzen. Um Ca2 + Antworten in Schwann-Zellen bei hohen oder niedrigen Leistung (d.h.20 X oder X 60) Bild, ist es notwendig, BHC oder µ-vor Block Bewegung zu verwenden. Für Niederleistungs-Bildgebung v...

NMJ, wie alle Synapsen besteht aus drei Elementen: ein präsynaptischen Terminal abgeleitet eines Neurons, einer postsynaptischen Neuron/Effektor-Zelle und eine Perisynaptic glial cell1,2. Während die grundlegenden Aspekte der synaptischen Übertragung dieser Synapse3erstmals nachgewiesen wurden, bleiben viele Aspekte dieses Prozesses unbekannt, teilweise aufgrund der Ausdruck der gleichen Moleküle durch die ausgeprägte zelluläre Elemente dieser Synapse. Beispielsweise werden Rezeptoren für die Purin Adenin Nukleotide ATP und Acetylcholin (ACh), die von Motoneuronen bei Wirbeltieren NMJ Co freigesetzt werden, durch Muskel-, Schwann-Zellen und motorischen Neuronen, so erschwert die Interpretation eines ausgedrückt. funktionelle Wirkung ausgeübt durch diese Substanzen (z.B.Sender Freigabe oder Antwort, Muskel Krafterzeugung)4. Darüber hinaus die dreigliedrigen Komponenten der NMJ sind zwar einfach im Vergleich zu, z. B. Neuronen im zentralen Nervensystem die oft mehreren synaptischen Eingänge aufweisen ob die motorischen Nervenzellen, Muskelzellen oder Schwann-Zellen als Reaktion auf Reize, die Basis variieren auf ihre inneren Heterogenität (z.B., embryonale Ableitung, Faser-Subtyp, Morphologie) ist unklar. Um alle diese Probleme zu lösen, wäre es vorteilhaft, die Reaktion vieler Zellen innerhalb einer synaptischen Element sowie Track, zur gleichen Zeit, solch eine Reaktion auf die einzelnen Elemente gleichzeitig verfolgen. Konventionelle Strategien mit chemischen Farbstoffen zu Kalzium Signalisierung messen können diese zwei Ziele nicht erreichen, weil Bad angewendet Farbstoff durch mehrere Zelltypen nach Anwendung auf Gewebe aufgenommen wird und intrazellulär geladen Farbstoff nur verwendet werden, kann um zu visualisieren Person oder einer kleinen Kohorten von Zellen. Hier, mit Hilfe transgener Mäuse mit dem Ausdruck GECIs entworfen, um zellspezifische Kalzium Signalisierung zusammen mit bestimmten Bildgebung und Software Tools5, wir führen die erste dieser zwei allgemeine Ziele und erläutern wie die Zugabe von neu Transgene Werkzeuge würde helfen, die Sekunde zu erreichen. Diese Technik wird für alle interessierten bei der Verfolgung von Kalzium Dynamik oder andere zellulare signalisieren Ereignisse beobachten durch gen-kodierte optische Sensoren in mehrere Zellpopulationen zur gleichen Zeit nützlich sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

Die elektrische Aktivität der Zellen in den Geweben durch elektrophysiologische Techniken überwacht werden kann, aber diese sind in der Regel auf die Analyse der einzelnen Zellen beschränkt. Da eine Erhöhung der intrazellulären Kalzium (Ca2 +) in die Zellflüssigkeit oft aufgrund der elektrischen Aktivität tritt oder in Reaktion auf eine Vielzahl von anderen reizen, dieser Prozess sich durch lässt die Darstellung der Zellen mit fluoreszierenden Calcium-Sensitive geladen Farbstoffe.  Allerdings ist es schwierig, diese Antwort in einer einzelnen Zelle Art im gesamten Gewebe Bild, da diese Farbstoffe durch alle Zelltypen im Gewebe entnommen werden. Im Gegensatz dazu genetisch codierte Kalzium Indikatoren (GECIs) können durch eine einzelne Zelle Art ausgedrückt werden und fluoreszieren in Reaktion auf eine Erhöhung der intrazellulären Ca2 +, erlaubt die Bildgebung von Ca2 + in der gesamten Bevölkerung der Signalisierung einzelnen Zelltypen. Hier wenden wir die Verwendung von GECIs GCaMP3/6 auf der Maus neuromuskulären Synapse, eine dreigliedrige Synapse zwischen Motoneuronen, Skelettmuskel und Terminal/Perisynaptic Schwann-Zellen. Wir zeigen den Nutzen dieser Technik im klassischen ex Vivo Gewebe Vorbereitungen. Mit Hilfe eines optischen Splitters, führen wir Dual-Wellenlänge Bildgebung der dynamischen Ca2 + Signale und eine statische Beschriftung der neuromuskulären Synapse (NMJ) in einem Ansatz, der an zwei zellspezifische GECI oder genetisch codierte Spannung überwachen leicht angepasst werden könnte Indikatoren (GEVI) gleichzeitig. Schließlich diskutieren wir die Routinen verwendet, um räumliche Karten der Fluoreszenzintensität zu erfassen. Zusammen, können diese optischen, transgenen und analytische Techniken eingesetzt werden, um die biologische Aktivität der Zelle unterschiedliche Subpopulationen bei NMJ in einer Vielzahl von Kontexten zu studieren.

Mehrere Beispiele für Fluoreszenz Intensität Änderungen, vermittelt durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2 + in bestimmten Zelltypen von NMJ, zeigt das Dienstprogramm dieses Ansatzes. Diese Ergebnisse werden als räumliche Fluoreszenz Intensität Karten, präsentiert die geben die Position der antwortenden Zellen sowie die Intensität ihrer Antworten, so dass für die Bewertung von wie viele Zellen reagieren und wie viel jeder Zelle reagiert auf ein bestimmtes Reiz. Zu...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im neuromuskulären Bereich zu beantworten, wie die Rolle der Kalzium-Signalisierung in Muskel- oder Schwann-Zellen als Reaktion auf die Nervenstimulation. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass man die Aktivierung bestimmter Zelltypen als Reaktion auf die Nervenstimulation abbilden kann. Um zu beginnen, erhalten Transgene Mäuse, und genotyp sie wie im Textprotokoll detailliert beschrieben.Nach Dereutasasien, quer Abschnitt über das gesamte Tier direkt unter der Leber und knapp über dem Herzen und der Lunge mit Iridectomie Schere. Sezieren Sie die Leber, das Herz und die Lunge. Achten Sie darauf, eine Länge des Phrenonischen Nervs zu halten, die lang genug ist, um in eine Saugelektrode gezogen zu werden.Entfernen Sie den Rippenkäfig und die Wirbelsäule weiter, mit Ausnahme des dünnen Grats um das Zwerchfell. Legen Sie das Zwerchfell und die phrenische Nervenprobe in eine Mikrofugenröhre mit Krebs-Ringer-Lösung, die ein Mikrogramm pro Milliliter fluoreszierend alpha Bungarotoxin enthält. Lassen Sie die Probe in der Lösung für 10 Minuten im Dunkeln inkubieren.Mit Minutienstiften wird das Zwerchfell immobilisiert, indem man es auf eine sechs Zentimeter große Schale fixiert, die mit Silikon-Dielektrikum-Gel beschichtet und mit etwa acht Millilitern sauerstoffhaltiger Krebs-Ringer-Lösung gefüllt ist. Legen Sie die Schale auf die Mikroskopbühne. Dann durchdringen Sie das Zwerchfell mit mehr Krebs-Ringer-Lösung bei acht Milliliter pro Minute für 30 Minuten.Bei vierfacher Vergrößerung, mit einem Mikromanipulator, bewegen Sie die Saugelektrode über den linken Phrenonalnerv. Tragen Sie die Saugkraft auf, indem Sie den Lauf einer Fünf-Milliliter-Spritze herausziehen, die mit dem Schlauch verbunden ist, der an der Saugelektrode befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass sich die Membran als Reaktion auf die Einhertz-Stimulation zusammenzieht, indem Sie sie visuell mit Brightfield-Beleuchtung untersuchen.Wenn nicht, stellen Sie die Spannung ein, indem Sie den Spannungsknopf inkrementell drehen, um einen supramaximalen Impuls zu erreichen, der durch visuelle Untersuchung der Muskelkontraktion überprüft werden kann. Wenn immer noch nicht sichtbar, blasen Sie den Nerv mit der Spritze und versuchen, es wieder durch Aufbringen von Saugung zu ziehen. Schalten Sie nun die Perfusion aus, um den muskelspezifischen Myosin-Inhibitor BHC oder den spannungsverzerbten Natriumkanal-Antagonisten Mu-Conotoxin hinzuzufügen.Bereiten Sie die BHC-Vorverdünnung vor, indem Sie vier Mikroliter 200 Millimolar-Lager BHC in DMSO in einem Milliliter Krebs-Ringer-Lösung pipetieren. Entfernen Sie einen Milliliter Krebs-Ringer-Lösung aus der Schale. Dann den vorverdünnten BHC in die Schale geben.Nach 30 Minuten die Durchblutung der frischen Krebs-Ringer-Lösung für weitere 20 bis 30 Minuten einschalten. Tragen Sie Handschuhe, bereiten Sie die Aufnahmeelektrode vor, indem Sie ein Borosilikat-Filamentglas mit einem Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,4 Millimetern in einen Mikropipette-Zieher legen. Ziehen Sie die Zifferblätter fest, um sie in Position zu klemmen und die Abziehertür zu schließen.Programmieren Sie dann den Puller, wie im Textprotokoll beschrieben. Bei embryonalen Membranen den Widerstand mit Softwaresteuerungen des Verstärkers messen. Stellen Sie sicher, dass der Widerstand in der Nähe von 60 Megaohm und für ältere Membranen, 10 bis 20 Megaohm.Laden Sie nun die Aufnahmeelektrode mit drei Molkaliumchlorid. Bei der 10-fachen Vergrößerung senken Sie die Elektrode in den Muskel mit einem zweiten Mikromanipulator auf der gegenüberliegenden Seite der Bühne als stimulierende Elektrode. Mit hilfe elektrophysiologischer Datenerfassungssoftware warten, bis sich das Potenzial der ruhenden Membran von null auf minus 65 Millivolt oder darunter ändert.Stimulieren Sie bei einem Hertz und überprüfen Sie das Vorhandensein eines Muskelwirkungspotenzials, indem Sie auf ein großes Potenzial überprüfen, das eine bescheidene Überschreitung aufweist. Verwechseln Sie Stimulationsartefakt nicht mit einem Aktionspotenzial. Bei 20-facher Vergrößerung lokalisieren Sie das Endplattenband in der Mitte des Muskels, indem Sie unter grüngelber Lichterregung nach fluoreszierend markierten neuromuskulären Knoten alpha-Bungarotoxin suchen.Wechseln Sie zu Blaulicht-Erregung, um Kalzium-Antworten in Muskel-, Motorneuron- oder Schwann-Zellen zu erhalten. In diesem Beispiel wird GCaMP drei in Muskelzellen exprimiert. Richten Sie auf Wunsch den Bildteiler mit Bandpassfiltern und einem dichroitischen Einkantfilter für die Dual-Wellenlängen-Bildgebung ein.Führen Sie Experimente mit dem Helligkeitsbalken auf dem Aufsuchtischbalken durch, der auf 110 % des Niveaus eingestellt ist, auf dem der genetisch kodierte Kalziumindikator, der Gewebe ausdrückt, eine Sättigung bei 20-facher Vergrößerung aufweist, ohne als Reaktion auf Kaliumchlorid zu binning. Rekord mit 20 Bildern pro Sekunde, um keine schnellen Events zu verpassen. Stimulieren Sie mit einer bis 45 Sekunden von 20 bis 40 Hertz Nervenstimulation, indem Sie einen Impulszug mit einer Saugelektrode liefern und dynamische fluoreszierende Calciumreaktionen in einer Zelle zusammen mit dem statischen fluoreszierend als Alpha-Bungarotoxin-Neuromuskelknotensignal bezeichneten Neuro-Bungarotoxin-Knotensignal sammeln.Pharmakologische Agonisten können auch durch Badapplikation oder per Perfusion hinzugefügt werden und die dynamischen fluoreszierenden Calciumreaktionen können auf die gleiche Weise gesammelt werden. Wenn die bildgebenden oder elektrophysiologischen Experimente abgeschlossen sind, weil die gewünschten Ergebnisse erzielt wurden, durchdringen Sie Wasser durch die Perfusionsleitungen und saugen Sie Wasser zwei- bis dreimal durch die Saugelektrode, um sicherzustellen, dass sich Salze nicht bilden. Eine räumliche Karte der Schwann-Zell-Calciumreaktionen auf die phrenische Nervenstimulation eines Wnt ein GCaMP Drei-Maus-Membran am postnatalen Tag sieben zeigen eine Beschränkung auf terminale parasynaptische Schwann-Zellen an der neuromuskulären Kreuzung.Das gleiche Zwerchfell wurde nach der Kennzeichnung mit fluoreszierend markiertem Alpha-Bungarotoxin abgebildet, das sich bindet, um Acetylcholin-Rezeptoren der neuromuskulären Kreuzung zu ermöglichen. Das gleiche Zwerchfell wurde auch unter Brightfield-Beleuchtung abgebildet, um eine Aufnahmeelektrode in den postsynaptischen Bereich des Muskels durch die neuromuskuläre Kreuzung zu führen. Hier ist die räumliche Abgrenzung von farbcodierten Zellen oder Interessengebieten zu sehen, die für die Analyse einzelner Kalziumtransienten genutzt werden.Die räumliche Karte der Muskelzell-Calcium-Antworten eines mth 5 GCaMP drei Maus-Membran bei P vier zu phrenischen Nervenstimulation in Gegenwart des Myosin-InhibitorS BHC zeigt eine Reaktion in der gesamten Region aller Membranmuskelzellen. Im Gegensatz dazu verursacht die Stimulation des gleichen Zwerchfells in Gegenwart von Mu-Conotoxin eine räumlich eingeschränkte Kalziumantwort im medialen Bereich aller Membranmuskelzellen, die dem Acetylcholin-Rezeptor-Cluster-angereicherten Endplattenband entspricht. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Immunhistochemie oder Immunoblotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. Wie hoch ist das molekulare Profil von Zellen, die durch Elektrophysiologie oder Kalzium-Bildgebung identifiziert werden?Diese Methode kann Einblick in die Reaktion der Bevölkerung von Schwann-Zellen und Muskelzellen auf die Nervenstimulation bei normalen neonatalen Mäusen geben. Es kann auch auf die Untersuchung von älteren Mäusen oder auf die Studie von Mäusen angewendet werden, die neuromuskuläre Krankheit assoziierte Proteine exzessiös ausdrücken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex-Vivo Calcium Imaging zur Visualisierung von Gehirn Reaktionen auf endokrine Signalisierung bei Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Reaktionen auf Geschmacksreize

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Maus Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Abgleich von optischen Kohärenztomographie-Fasergrammen im sichtbaren Licht mit konfokalen Bildern derselben Maus-Netzhaut

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Kalzium-Bildgebung bei elektrisch stimulierten, flach montierten Netzhäuten

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Kalzium-Bildgebung für Drosophila-Modell der Epilepsie

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...