Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

עבודה זו נתמכה בכספים של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) GM103554, GM110767 אל (T.W.G.) ומן המרכז הלאומי לחקר משאבי 5P20RR018751, את GM103513 8P 20 הלאומית המכון של כללי למדעי הרפואה (ל G.W.H.).

גידול בעלי חיים, ניסויים בוצעו על פי מוסדות לאומיים של בריאות המדריך עבור הטיפול, השימוש של חיות מעבדה, את IACUC-האוניברסיטה של נבאדה.
1. הכנת דיאפרגמות ועצבים הסרעפת מן העכברים הטרנסגניים
<ol><li>לרכוש העכברים הטרנסגניים לנוקלאוטידים גנוטיפ אלו עכברים. הערה: תחל מפורטים בדף "מ?...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

כאן אנו מספקים דוגמאות של מדידת Ca2 + תגובות תאים מסוימים ברקמת עצב-שריר שלם, שימוש בעכברים לבטא GECI. על מנת לבצע בהצלחה ניסויים אלה, זה הכרחי כדי לא לפצוע את עצב הסרעפת בזמן. לשיקוף Ca2 + תגובות בתאי שוואן בעוצמה נמוך או גבוה (כלומר, 20 X או 60 X), יש צורך להשתמש BHC או ממוצע-conotoxin חסום ל?...

NMJ, כמו כל הסינפסות, מורכב משלושה אלמנטים: מסוף presynaptic נגזר תא עצב, תא נוירון postsynaptic/אפקטור, ותא perisynaptic גליה1,2. בעוד ההיבטים הבסיסיים של ההעברה הסינאפסית היו שהראו-זה סינפסה3, היבטים רבים של תהליך זה נשאר לא ידוע, בחלקו בשל הביטוי של מולקולות אותו על ידי אלמנטים הסלולר ברורים של סינפסה הזה. לדוגמה, קולטני פורין אדנין נוקלאוטיד ATP והן אצטילכולין (ACh), אשר פורסם במשותף על ידי מנוע נוירונים ב- NMJ חוליות, באים לידי ביטוי על ידי שריר, תאי שוואן מוטורי לגלוקוז, ובכך שמסבך את הפירוש של כל השפעה תפקודית שהופעל על ידי אלה חומרים (למשל, משדר השחרור או תגובה, יצירת כח השריר)4. יתר על כן, למרות NMJ מרכיבי ה-tripartite פשוטים בהשוואה, לדוגמה, נוירונים במערכת העצבים המרכזית אשר לעתים קרובות להפגין תשומות סינפטית מרובים, אם המנוע נוירונים, תאי שריר או תאי שוואן להשתנות בתגובה לגירויים מבוסס על מהותי שלהם הטרוגניות (למשל, נגזרת עובריים, סוג של סיבים, מורפולוגיה) אינו ברור. על מנת לטפל בכל הבעיות הללו, זה יהיה יתרון לאתר בו זמנית את התגובה של תאים רבים בתוך אחד רכיב סינפטית, כמו גם מסלול, באותו הזמן, תגובה כזו גם שאר הרכיבים נפרדים. אסטרטגיות המקובלת באמצעות צבעם למדוד סידן איתות לא יכול להשיג שתי מטרות אלה, בגלל צבע שהוחל אמבטיה הוא נלקח על ידי סוגי תאים מרובים לאחר היישום לרקמות, צבע טעון intracellularly יכול לשמש רק לדמיין גדודים נפרדים או קטן של תאים. כאן, ניצול העכברים הטרנסגניים לבטא GECIs תוכנן כדי למדוד סידן לתא ספציפי איתות, יחד עם הדמיה ספציפית, כלי תוכנה5, אנחנו מדגימים הראשון של אלה שתי מטרות הכוללת ונדון כיצד התוספת של חדש כלים הטרנסגניים יעזור להשיג השני. טכניקה זו יהיה שימושי עבור מי שמעוניין מעקב אחר הדינמיקה סידן או אחרים הסלולר איתות האירועים נצפות דרך גן מקודד חיישנים אופטיים אוכלוסיות תאים מרובים בו-זמנית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

ניתן לנטר את הפעילות החשמלית של תאי ברקמות בטכניקות אלקטרופיזיולוגיות, אך אלה הם בדרך כלל מוגבל לניתוח של תאים בודדים. מאז עלייה של תאיים סידן (Ca2 +) ציטוזול מתרחש לעיתים קרובות בגלל הפעילות החשמלית, או בתגובה מספר עצום של גירויים אחרים, תהליך זה יכול להיות במעקב על ידי ההדמיה של תאים נטען עם פלורסנט סידן רגיש צבענים.  עם זאת, קשה תמונה תגובה זו בסוג של תא בודד בתוך רקמת כל כי צבע אלה נתפסות על ידי כל סוגי תאים בתוך הרקמה. לעומת זאת, סידן מקודדים גנטית אינדיקטורים (GECIs) יכול לבוא לידי ביטוי על ידי סוג של תא בודד, לזרוח בתגובה לעליה של תאיים Ca2 +, וכך מאפשר ההדמיה של Ca2 + איתות של אוכלוסיות שלמות של סוגי תאים בודדים. כאן, אנו מיישמים את השימוש של GECIs GCaMP3/6 לצומת neuromuscular העכבר, תאי שוואן סינפסה התלת-צדדי בין מוטורי לגלוקוז, שרירי השלד מסוף/perisynaptic. נדגים את התועלת של טכניקה זו קלאסי שמחוץ רקמות ההכנות. שימוש של הפיצול אופטי, אנו מבצעים הדמיה כפולה באורך הגל של Ca דינמי2 + אותות ותווית סטטי של צומת עצב-שריר (NMJ) בגישה זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לפקח על שני GECI תא ספציפי או מתח מקודדים גנטית אינדיקטורים (GEVI) בו זמנית. לבסוף, נדון את רוטינות המשמש ללכידה מפות מרחביות של עוצמת קרינה פלואורסצנטית. יחד, טכניקות אלו אופטי, מהונדס, אנליטית יכול להיות מועסק ללמוד את הפעילות הביולוגית של subpopulations תאים נפרדים ב- NMJ במגוון רחב של הקשרים.

מספר דוגמאות של שינויים בעוצמה פלורסצנטיות, מתווכת על-ידי עליות של תאיים Ca2 + בתוך התא מוגדרים סוגי NMJ, להראות את התועלת של גישה זו. תוצאות אלו מוצגים כמו זריחה המרחבי בעוצמה מפות, אשר מספקים את מיקומו של תאים מגיבה, כמו גם את עוצמת התגובות שלהם, ובכך מאפשר על ההערכה של ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

כאן אנו מציגים פרוטוקול סידן התמונה איתות באוכלוסיות של סוגי תאים בודדים באזור צומת עצב-שריר מאתר.

לשעבר Vivo הדמיה של סידן לתא ספציפי איתות על הסינפסה התלת-צדדי של הסרעפת העכבר

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום neuromuscular, כגון התפקיד של סידן איתות בשריר או תאי שוואן בתגובה לגירוי עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין את ההפעלה של סוגי תאים ספציפיים בתגובה לגירוי עצבי. כדי להתחיל, להשיג עכברים מהו מהודרים, ו genotype אותם כמפורט בפרוטוקול הטקסט.בעקבות המתת חסד, חתך רוחבי על פני החיה כולה ממש מתחת לכבד וקצת מעל הלב והריאות עם מספריים iridectomy. לנתח את הכבד, הלב והריאות. הקפדה לשמור על אורך העצב הפוrenic כי הוא מספיק זמן כדי להיגרר לתוך אלקטרודה יניקה.עוד להסיר את כלוב הצלעות ואת עמוד החוליות, למעט הרכס הדק סביב הסרעפת. מניחים את הסרעפת ואת דגימת העצב הפרני בצינור microfuge עם פתרון קרבס-רינגר המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin. אפשר את הדגימה דגירה בתסומה במשך 10 דקות בחושך.באמצעות סיכות minutien לשתק את הסרעפת על ידי הצמדת אותו על צלחת שישה סנטימטר מצופה ג'ל דיאלקטרי סיליקון ומלא כשמונה מיליליטר של פתרון קרבס-רינגר מחומצן. מניחים את המנה על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, לבלבל את הסרעפת עם פתרון קרבס-רינגר יותר בשמונה מיליליטר לדקה במשך 30 דקות.בהגדלה פי ארבעה, באמצעות מיקרומניפולטור, הזיזו את אלקטרודה היניקה מעל העצב הפרעוני השמאלי. החל את היניקה על ידי משיכת החבית של מזרק חמישה מיליליטר מחובר צינורות המחובר אל אלקטרודה היניקה. ודא כי הסרעפת מתכווצת בתגובה לגירוי הרץ אחד על ידי בדיקה ויזואלית זה עם תאורת ברייטפילד.אם לא, להתאים את המתח על ידי הפיכת כפתור המתח בהדרגה כדי להשיג דופק על-טבעי אשר ניתן לאמת על ידי בדיקה חזותית של התכווצות שרירים. אם עדיין לא נראה, לפוצץ את העצב עם המזרק ולנסות למשוך אותו שוב על ידי החלת יניקה. עכשיו, לכבות את זלבול להוסיף את מעכבי מיוסין ספציפי לשריר BHC או מתח מגודר נתרן ערוץ אנטגוניסט mu-conotoxin.הכן את BHC טרום דילול על ידי צינור ארבעה microliters של 200 מילימולאר מלאי BHC ב DMSO במיליליטר אחד של פתרון קרבס-רינגר. מוציאים מיליליטר אחד של תוסף קרבס-רינגר מהצלחת. לאחר מכן מוסיפים את BHC מדולל מראש לצלחת.לאחר 30 דקות, להפעיל את תדלוק של פתרון קרבס-רינגר טרי עוד 20 עד 30 דקות. לובש כפפות, להכין את האלקטרודה הקלטה על ידי הנחת זכוכית חוטית borosilicate עם קוטר חיצוני של מילימטר אחד קוטר פנימי של 0.4 מילימטרים לתוך מושך micropipette. הדק את המחוגים כדי להדק אותו למקומו ולסגור את דלת המוציא.לאחר מכן תכנת את המוציא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבור דיאפרגמות עובריות, למדוד את ההתנגדות באמצעות פקדי תוכנה של המגבר. ודא שההתנגדות קרובה ל-60 מגה-הום ולסרעפות ישנות יותר, 10 עד 20 מגה-ם.עכשיו, לטעון את האלקטרודה הקלטה עם שלושה אשלגן כלורי דיוח. בהגדלה פי 10, מנמיכים את האלקטרודה לשריר באמצעות מיקרומניפולטור שני בצד הנגדי של הבמה כאלקטרודה מגרה. שימוש בתוכנה לרכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים ממתין עד שהממברנה המנוחה משתנה מאפס למינוס 65 מילי-וולט ומטה.לעורר בהרץ אחד ולאמת את נוכחותו של פוטנציאל פעולה שריר על ידי בדיקת פוטנציאל גדול המציג overshoot צנוע. אין לבלבל חפץ גירוי עם פוטנציאל פעולה. ב 20 פעמים הגדלה לאתר את רצועת צלחת הקצה במרכז השריר על ידי מחפש פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin צמתים neuromuscular תחת העירור אור צהוב ירוק.עבור לגירוי אור כחול לתגובות סידן תמונה בשרירים, נוירון מוטורי, או תאים שוואן. בדוגמה זו GCaMP שלוש מתבטא בתאי שריר. אם תרצה, הגדר את מפצל התמונה עם מסנני מעבר פס ומסנן קצה יחיד דיכרואי להדמיית אורך הגל הכפול.בצעו ניסויים עם סרגל הבהירות על סרגל טבלת בדיקת המידע שנקבע ל-110% מהרמה שבה מחוון הסידן המקודד גנטית מבטא רוויה ברקמות בהגדלה פי 20 מבלי לבלום בתגובה לאשלגן כלורי. הקליטו במהירות של 20 פריימים לשנייה כדי לא לפספס אירועים מהירים. לעורר עם אחד עד 45 שניות של 20 עד 40 הרץ של גירוי עצבי על ידי אספקת רכבת של דחפים באמצעות אלקטרודה יניקה ולאסוף תגובות סידן פלואורסצנטי דינמי בתת סוג תא אחד יחד עם סטטי פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin נוירומוסקולרי צומת אות.אגוניסטים תרופתיים ניתן להוסיף גם על ידי יישום אמבטיה או על ידי חיסון ואת התגובות סידן פלואורסצנטי דינמי ניתן לאסוף באותו אופן. כאשר ההדמיה או הניסויים האלקטרופיזיולוגיים הסתיימו מכיוון שהתוצאות הרצויות הושגו, מזיפים מים דרך קווי הזיוף ומוצצים מים פעמיים עד שלוש פעמים דרך אלקטרודה היניקה כדי להבטיח שמלחים לא יצטברו. מפה מרחבית של תגובות סידן תא שוואן גירוי עצבי פרוני של Wnt אחד GCaMP שלושה דיאפרגמת עכבר ביום שלאחר הלידה שבע להראות הגבלה לתאי שוואן parasynaptic מסוף בצומת neuromuscular.אותה דיאפרגמה תדמית לאחר תיוג עם פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin, אשר קשרים כדי לאפשר קולטני אצטילכולין של צומת neuromuscular. אותה דיאפרגמה גם דימוי תחת תאורת ברייטפילד כדי להנחות אלקטרודה הקלטה לאזור הפוסט סינפטי של השריר על ידי צומת neuromuscular. מוצג כאן הוא תיחום מרחבי של תאים מקודדים בצבע או אזורים של עניין נלקח לניתוח של ארעי סידן בודדים.המפה המרחבית של תגובות סידן תא שריר של mth 5 GCaMP שלוש דיאפרגמת העכבר ב P ארבע לגירוי עצבי פרוני בנוכחות מעכבי מיוסין BHC מראה תגובה בכל האזור של כל תאי השריר הסרעפת. לעומת זאת, גירוי של אותה דיאפרגמה בנוכחות מו-קונוטוקסין גורם לתגובת סידן מוגבלת מבחינה מרחבית באזור המדיאלי של כל תאי השריר של הסרעפת התואמת את רצועת צלחת הקצה המועשרת של קולטן האצטילכולין. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונו-היסטוכימיה או אימונובלוט על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, מהו הפרופיל המולקולרי של תאים המזוהים על ידי אלקטרופיזיולוגיה או הדמיית סידן?שיטה זו יכולה לספק תובנה על תגובות האוכלוסייה של תאי שוואן ותאי שריר לגירוי עצבי בעכברים יילודים נורמליים. זה יכול להיות מיושם גם על המחקר של עכברים מבוגרים או על המחקר של עכברים המבטאת מחלות נוירומוסקולריות הקשורות חלבונים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

לשעבר Vivo הדמיית סידן להמחשת התגובות המוח איתות האנדוקרינית ב דרוזופילה

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

אין ויוו הדמיית סידן בשדה רחב ושני פוטונים מעכבר באמצעות חלון גולגולתי גדול

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

הדמיית סידן בעכבר קוליקולוס מעולה

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

יישור של טומוגרפיית טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של אור נראה עם תמונות קונפוקליות של אותה רשתית עכבר

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

הדמיית סידן ברשתית שטוחה עם גירוי חשמלי

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

אקס ויוו הדמיית סידן למודל דרוזופילה לאפילפסיה

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...