Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto con fondi del National Institutes of Health (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e dal centro nazionale per le risorse di ricerca 5P20RR018751 e il National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (per G.W.H.).

Zootecnia e gli esperimenti sono stati effettuati conformemente alla istituti nazionali di salute Guida per la cura e uso di animali da laboratorio e il IACUC presso l'Università del Nevada.
1. preparazione dei diaframmi e nervi frenici da topi transgenici
<ol><li>Acquisto di topi transgenici e iniettori del oligonucleotide di genotipo questi topi. Nota: Gli iniettori sono elencati nella pagina "Informazioni" per ciascuno di questi topi.<ol>
<li>Allevare un mouse di 3-6 mesi esprimendo u...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Qui forniamo alcuni esempi di Ca2 + risposte in celle specifiche in tessuto neuromuscolare intatto facendo uso dei topi che esprimono GECI di misura. Per eseguire correttamente questi esperimenti, è imperativo di non ferire il nervo frenico durante la dissezione. Per realizzare l'immagine Ca2 + risposte in cellule di Schwann a potenza alto o basso (cioè, X 20 o 60 X), è necessario utilizzare BHC o µ-conotossina al blocco movimento. Per l'imaging di bassa potenza di Ca2 + risp...

La giunzione neuromuscolare, come tutte le sinapsi, è composto da tre elementi: un terminale presinaptico derivato da un neurone, una cellula postsynaptic neurone/effettrici, e un perisinaptici glial cell1,2. Mentre gli aspetti fondamentali della trasmissione sinaptica in primo luogo sono stati dimostrati a questa sinapsi3, molti aspetti di questo processo rimangano sconosciuti, in parte a causa dell'espressione delle molecole stesse di distinti elementi cellulari di questa sinapsi. Ad esempio, ricevitori per sia l'acetilcolina (ACh) e del purina adenina nucleotide ATP che co-sono rilasciati dai neuroni di motore alle NMJ vertebrati, sono espresse da muscolo, cellule di Schwann e neuroni di motore, così che complica l'interpretazione di qualsiasi funzionale effetto esercitato da queste sostanze (ad es., rilascio del trasmettitore o risposta, generazione di forza muscolare)4. Inoltre, sebbene i componenti tripartiti della giunzione neuromuscolare sono semplici rispetto a, per esempio, i neuroni nel sistema nervoso centrale che spesso esibiscono più input sinaptico, se motoneuroni, cellule muscolari o cellule di Schwann variano in risposta a stimoli basato il loro intrinseca eterogeneità (ad es., derivazione embrionale, sottotipo di fibra, morfologia) è poco chiaro. Al fine di affrontare ciascuno di questi problemi, sarebbe vantaggioso per monitorare simultaneamente la risposta di molte cellule all'interno di un elemento sinaptica, così come traccia, allo stesso tempo, tale risposta in uno degli altri elementi separati. Le strategie convenzionali utilizzando coloranti chimici per misurare la segnalazione del calcio non possono raggiungere questi due obiettivi, perché applicati a vasca di tintura è occupata da più tipi di cella dopo l'applicazione del tessuto e tintura intracellulare caricata può essere utilizzata solo per visualizzare coorti di individui o piccoli delle cellule. Qui, utilizzando topi transgenici esprimenti GECIs progettato per misurare la segnalazione del calcio cellula-specifico, insieme a specific Imaging, imaging e software strumenti5, dimostriamo il primo di questi due obiettivi globali e discutere come l'aggiunta di nuovi strumenti transgenici aiuterebbe a raggiungere il secondo. Questa tecnica sarà utile per chiunque sia interessato a rilevamento dinamica del calcio o altri cellulari osservabile di eventi di segnalazione attraverso sensori ottici gene-codificato in più popolazioni di cellule allo stesso tempo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

L'attività elettrica delle cellule nei tessuti può essere monitorata da tecniche elettrofisiologiche, ma questi sono solitamente limitati all'analisi delle singole celle. Poiché un aumento di calcio intracellulare (Ca2 +) nel citosol si verifica spesso a causa dell'attività elettrica, o in risposta ad una miriade di altri stimoli, questo processo può essere monitorato dall'imaging delle cellule caricati con fluorescente calcio sensibili coloranti.  Tuttavia, è difficile per questa risposta in un tipo di cella singola all'interno di intero tessuto di immagine perché questi coloranti sono presi da tutti i tipi di cellule all'interno del tessuto. Al contrario, codificato geneticamente calcio indicatori (GECIs) possono essere espresso da un tipo di cella singola e reagiscono in risposta ad un aumento di Ca intracellulare2 +, permettendo così l'imaging del Ca2 + segnalazione in intere popolazioni di tipi di cellule singole. Qui, applichiamo l'uso di GECIs GCaMP3/6 alla giunzione neuromuscolare del mouse, un tripartito sinapsi tra i neuroni di motore, muscolo scheletrico e terminal/perisinaptici in cellule di Schwann. Dimostriamo l'utilità di questa tecnica nelle preparazioni di tessuto classico ex vivo . Utilizzando un separatore ottico, eseguiamo imaging di doppio-lunghezza d'onda di Ca2 + segnali dinamici e un'etichetta statica della giunzione neuromuscolare (NMJ) in un approccio che può essere facilmente adattato per monitorare due cellula-specifico GECI o tensione codificato geneticamente indicatori (GEVI) contemporaneamente. Infine, si discutono la routine utilizzate per acquisire mappe spaziali di intensità di fluorescenza. Insieme, queste tecniche ottiche, transgeniche e analitiche possono essere impiegate per studiare l'attività biologica delle sottopopolazioni distinte delle cellule alle NMJ in un'ampia varietà di contesti.

Diversi esempi di cambiamenti di intensità di fluorescenza, mediate da un aumento di Ca intracellulare2 + all'interno di tipi di cella definita della giunzione neuromuscolare, dimostrano l'utilità di questo approccio. Questi risultati sono presentati come mappe di intensità di fluorescenza spaziale, che forniscono la posizione delle cellule risponde, così come l'intensità delle loro risposte, consentendo in tal modo la valutazione di quante cellule rispondono e quanto ogni...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuromuscolare, come il ruolo della segnalazione del calcio nei muscoli o nelle cellule di Schwann in risposta alla stimolazione nervosa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può immaginare l'attivazione di specifici tipi di cellule in risposta alla stimolazione nervosa. Per iniziare, ottenere topi transgenici e genotipi come descritto nel protocollo di testo.Dopo l'eutanasia, si seziona trasversalmente l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore e i polmoni con forbici per l'iridectomia. Sezionare il fegato, il cuore e i polmoni. Fare attenzione a mantenere una lunghezza del nervo phrenic sufficientemente lunga da essere attratta in un elettrodo di aspirazione.Rimuovere ulteriormente la gabbia toracica e la colonna vertebrale, ad eccezione della sottile cresta attorno al diaframma. Posizionare il diaframma e il campione di nervo phrenico in un tubo di microfugo con soluzione di Krebs-Ringer contenente un microgrammo per millilitro di bungarotossine alfa etichettate fluorescentmente. Lasciare incubare il campione nella soluzione per 10 minuti al buio.L'uso di perni di minuzia immobilizza il diaframma fissarlo su un piatto di sei centimetri rivestito con gel dielettrico in silicone e riempito con circa otto millilitri di soluzione Krebs-Ringer ossigenata. Posizionare il piatto sul palco del microscopio. Quindi, perfondi il diaframma con più soluzione Krebs-Ringer a otto millilitri al minuto per 30 minuti.A quattro volte l'ingrandimento, usando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo di aspirazione sul nervo phrenico sinistro. Applicare l'aspirazione estraendo la canna di una siringa da cinque millilitri collegata al tubo collegato all'elettrodo di aspirazione. Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione di un hertz esaminandolo visivamente con l'illuminazione Brightfield.In caso meno, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso supramaximale che può essere verificato mediante esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di disegnarlo di nuovo applicando l'aspirazione. Ora, spegnere la perfusione per aggiungere l'inibitore della miosina specifico del muscolo BHC o la mu-conotossina antagonista del canale del sodio gated di tensione.Preparare la pre-diluizione BHC pipettando quattro microlitri di BHC da 200 millimolari in DMSO in un millilitro di soluzione Krebs-Ringer. Rimuovere un millilitro della soluzione Krebs-Ringer dal piatto. Quindi aggiungere il BHC pre-diluito al piatto.Dopo 30 minuti, accendere la perfusione della fresca soluzione Krebs-Ringer per altri 20-30 minuti. Indossando guanti, preparare l'elettrodo di registrazione posizionando un vetro filamentoso borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,4 millimetri in un estrattore di micropipette. Stringere i quadranti per bloccarlo in posizione e chiudere la porta dell'estrattore.Quindi programmare l'estrattore come descritto nel protocollo di testo. Per i diaframmi embrionali, misurare la resistenza utilizzando i controlli software dell'amplificatore. Assicurarsi che la resistenza sia vicina a 60 megaohm e per i diaframmi più vecchi, da 10 a 20 megaohm.Ora, caricare l'elettrodo di registrazione con tre cloruri molari di potassio. A 10 volte l'ingrandimento, abbassare l'elettrodo nel muscolo usando un secondo micromanipolatore sul lato opposto dello stadio come elettrodo stimolante. Utilizzando il software di acquisizione dati elettrofisiologici attendere che il potenziale della membrana a riposo cambi da zero a meno 65 millivolt o inferiori.Stimolare in un unico hertz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che mostra un modesto superamento. Non confondere l'artefatto di stimolazione con un potenziale d'azione. A 20 volte l'ingrandimento individua la banda della piastra finale al centro del muscolo cercando giunzioni neuromuscolari alfa bungarotossine etichettate fluorescentmente sotto eccitazione a luce gialla verde.Passare all'eccitazione della luce blu per immaginire le risposte di calcio nelle cellule muscolari, motoneuroni o Schwann. In questo esempio GCaMP tre è espresso nelle cellule muscolari. Se lo si desidera, impostare lo splitter dell'immagine con filtri passa banda e un filtro dicroico a bordo singolo per l'imaging a doppia lunghezza d'onda.Eseguire esperimenti con la barra di luminosità sulla barra della tabella di ricerca impostata sul 110% del livello al quale l'indicatore di calcio codificato geneticamente che esprime il tessuto mostra saturazione a 20 volte l'ingrandimento senza binning in risposta al cloruro di potassio. Registra a 20 fotogrammi al secondo in modo da non perdere eventi veloci. Stimolare con uno o 45 secondi da 20 a 40 hertz di stimolazione nervosa fornendo un treno di impulsi utilizzando un elettrodo di aspirazione e raccogliere risposte dinamiche di calcio fluorescente in un sottotipo cellulare insieme al segnale di giunzione neuromuscolare alfa bungarotoxina fluorescente statico.Gli agonisti farmacologici possono anche essere aggiunti per applicazione del bagno o per perfusione e le risposte dinamiche del calcio fluorescente possono essere raccolte allo stesso modo. Al termine degli esperimenti di imaging o elettrofisiologici perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, perfondere l'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua da due a tre volte attraverso l'elettrodo di aspirazione per garantire che i sali non si accumulino. Una mappa spaziale delle risposte del calcio cellulare di Schwann alla stimolazione nervosa phrenica di un diaframma del topo Wnt one GCaMP al settimo giorno postnatale mostra una restrizione alle cellule terminali parasynattiche di Schwann alla giunzione neuromuscolare.Lo stesso diaframma è stato immaginato dopo l'etichettatura con alfa bungarotoxina etichettata fluorescentmente, che si lega per consentire i recettori dell'acetilcolina della giunzione neuromuscolare. Lo stesso diaframma è stato anche immaginato sotto l'illuminazione brightfield per guidare un elettrodo di registrazione verso la regione post-sinaptica del muscolo dalla giunzione neuromuscolare. Qui è mostrata la demarcazione spaziale di cellule codificate a colori o regioni di interesse prese per l'analisi dei singoli transitori di calcio.La mappa spaziale delle risposte di calcio delle cellule muscolari di un mth 5 GCaMP tre diaframma del topo a P quattro alla stimolazione nervosa phrenic in presenza dell'inibitore della miosina BHC mostra una risposta in tutta la regione di tutte le cellule muscolari del diaframma. Al contrario, la stimolazione dello stesso diaframma in presenza di mu-conotossina causa una risposta al calcio limitata spazialmente nella regione mediale di tutte le cellule muscolari del diaframma che corrisponde all'ammasso di cellule finali arricchite del gruppo del recettore dell'acetilcolina. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come l'immunoirochimica o l'immunoblotting al fine di rispondere a domande aggiuntive come, qual è il profilo molecolare delle cellule identificate dall'elettrofisiologia o dall'imaging del calcio?Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte della popolazione delle cellule di Schwann e delle cellule muscolari alla stimolazione nervosa nei normali topi neonatali. Può anche essere applicato allo studio di topi più anziani o allo studio di topi che esprimono proteine associate alla malattia neuromuscolare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

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Neuroscienze

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