Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
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이 작품은 자금 및 연구 자원 5P20RR018751에 대 한 국립 센터 및 국립 연구소의 종합 의료 과학 8 P 20 GM103513 (G.W.H.)에 건강 (NIH) GM103554 및 GM110767 (T.W.G.)에 국립 보건원에서 지원 되었다.

축산 및 실험 치료 및 실험 동물의 사용 및 네바다의 대학에 IACUC 국가 학회 건강 가이드에 따라 수행 했다.
1. 격 막 및 유전자 변형 쥐에서 인할지 신경의 준비
<ol><li>유전자 변형 쥐와 유전자 형을 oligonucleotide 뇌관 이러한 마우스 구입. 참고: 뇌관은 이러한 쥐의 각에 대 한 "정보" 페이지에 표시 됩니다.<ol>
<li>Cre 드라이버 대립 유전자 변형/노크-에서 적절 한 1 부와 조건부...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

여기 우리는 측정 캘리포니아2 + 그대로 신경 근육 학 조직 GECI 표현 하는 마우스를 사용 하 여 특정 셀에 응답의 몇 가지 예제를 제공 합니다. 이러한 실험을 성공적으로 수행 하려면 인할지 신경 해 부 동안에 상처를 하지 필수적입니다. 캘리포니아2 + 응답 Schwann 세포 낮은 또는 높은 전력 (즉, 20 X 또는 X 60)에, 이미지를 제너 시스 또는 µ-conotoxin 블록에 사용할 필요가 있다. ...

모든 시 냅 스 처럼 NMJ 3 요소의 구성: 터미널 연 접 신경 postsynaptic 신경/이펙터 셀에서에서 파생 하 고 perisynaptic glial 세포1,2. 시 냅 시스 전송의 기본적인 측면 처음이 시 냅 스3에서 설명 되었다, 하는 동안이 프로세스의 여러 측면,이 시 냅이 스의 고유 셀룰러 요소에 의해 동일한 분자의 표현 때문에 부분에서 알 수 없는 남아 있습니다. 예를 들어 모터 뉴런 척추 NMJ에 의해 공동 출시 되는 퓨 린 아데닌 뉴클레오티드 ATP와 아 세 틸 콜린 (ACh) 수용 체 근육, Schwann 세포, 모터 신경, 따라서 복잡의 해석에 의해 표현 됩니다. 이러한 물질 (예를 들어, 송신기 릴리스 또는 응답, 근육 힘 세대)4에 의해 발휘 하는 기능 효과. 또한,는 NMJ의 같은 구성 요소는 간단한에 비해, 예를 들어 신경 중앙 신경 조직에 여러 개의 시 냅 스 입력, 수시로 전시 하는 모터 신경 세포, 근육 세포, 또는 Schwann 세포 다를 기반으로 하는 자극에 대 한 응답 여부 그들의 내장에 (예를 들어, 배아 파생, 섬유 하위, 형태학)이 명확 하지 않다. 각 이러한 문제를 해결 하기 위해 그것은 동시에 같은 시간, 같은 다른 별도 요소 중 하나에 응답에 트랙 뿐만 아니라 한 시 냅 스 요소 내의 많은 세포의 응답을 추적 하는 것입니다. 칼슘 신호 측정 화학 염료를 사용 하 여 기존의 전략 목욕 적용 염료 조직으로, 신청 후 여러 셀 유형에 의해 채택 되 고 침 로드 염료 시각화에 사용할 수 있기 때문에이 두 가지 목표를 달성할 수 없는 셀의 개인 또는 작은 동료 여기, 휴대 전용 칼슘 신호, 특정 영상 및 소프트웨어 도구5, 우리는이 두 가지 전반적인 목표의 처음을 설명 하 고 토론을 측정 하도록 설계 GECIs를 표현 하는 유전자 변형 쥐를 이용 하 여 어떻게의 새로운 유전자 변형 도구 두 번째 달성 도움이 될. 이 기술은 추적 칼슘 역학 또는 동시에 여러 세포 인구에서 유전자 인코딩 광학 센서를 통해 이벤트 관찰할 신호 다른 세포에 관심이 사람에 대 한 유용할 것 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

Electrophysiological 기법에 의해 조직에 있는 세포의 전기적 활동을 모니터링할 수 있습니다 있지만 이들은 일반적으로 개별 셀의 분석을 제한. 셀의 이미징 형광 칼슘-민감한 로드 이후는 cytosol에서 세포내 칼슘 (캘리포니아2 +)의 증가 종종 전기 활동 때문에 발생 합니다 또는 다른 자극의 무수에 응답,이 프로세스에 의해 모니터링 수 있습니다. 염료입니다.  그러나, 그것은이 염료는 조직 내의 모든 세포 유형에 의해 채택 하기 때문에 전체 조직 내에서 개별 셀 형식에서이 응답을 이미지 어렵다. 반면, 유전자 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)는 개별 셀 형식에 의해 표현 될 수 있습니다 및 세포내 캘리포니아2 +, 따라서 허용의 캘리포니아2 + 의 전체 인구에 있는 신호 이미징의 증가에 대 한 응답 형광 개별 셀 종류입니다. 여기, 우리는 마우스 신경 근육 학 교차로 적용할 GECIs GCaMP3/6의 사용, 모터 신경, 골격 근육, 및 터미널/perisynaptic 사이 3 자간 냅 Schwann 세포. 조직 준비 클래식 비보 전 에이 기법의 유틸리티를 설명합니다. 광 스플리터를 사용 하 여, 우리 수행 동적 캘리포니아2 + 신호 듀얼-파장 이미징 및 신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 정적 레이블 두 셀 전용 GECI 또는 유전자 인코딩된 전압 모니터링을 쉽게 적용할 수 있는 방법을 지표 (GEVI) 동시에. 마지막으로, 우리는 형광 강도의 공간 지도 캡처하는 데 사용 하는 루틴을 논의. 함께, 이러한 광학, 유전자 변형, 그리고 분석 기술은 공부를 다양 한 문맥에서에서 NMJ에 뚜렷한 세포 모집단의 생물 학적 활동을 사용할 수 있습니다.

형광 강도 변화, 세포내 캘리포니아2 + , NMJ의 정의 된 세포 유형 내에서 증가 의해 중재의 몇 가지 예는이 접근의 유틸리티 표시. 이러한 결과 응답 셀의 위치 뿐만 아니라 셀 수 응답 및 얼마나 많은 각 셀에 특정 응답의 평가 되므로 그들의 반응의 강도 제공 하는 공간 형광 강도 지도 제시 자극입니다. 예를 들어 그림 1에서 보듯이, 우리의 ?...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

여기 이미지 칼슘 murine neuromuscular 접속점에 개별 셀 종류의 인구에 있는 신호 프로토콜 선물이.

전 비보 마우스 다이어 프 램의 같은 시 냅 스에서 신호 세포 특정 칼슘의 이미징

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

이 방법은 신경 자극에 응하여 근육 또는 슈완 세포에서 칼슘 신호의 역할과 같은 신경 근육 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 자극에 반응하여 특정 세포 유형의 활성화를 이미지화 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면, 형질 전환 마우스를 얻고, 텍스트 프로토콜에 상세한 대로 유전자형을 얻을.안락사 에 따라, 횡방향 간 바로 아래와 iridectomy 가위와 심장과 폐 바로 위에 전체 동물을 가로 질러 섹션. 간, 심장 및 폐를 해부합니다. 흡입 전극에 끌릴 만큼 충분히 긴 프린닉 신경의 길이를 유지하기 위해 주의.다이어프램 주위의 얇은 능선을 제외하고, 흉곽과 척추 컬럼을 추가로 제거합니다. 형광으로 표지된 알파 분가로톡신의 밀리리터 당 1마이크로그램을 함유한 크렙스 링거 용액을 함유한 미세분리관에 다이어프램과 프린소 신경 샘플을 배치합니다. 표본이 어둠 속에서 10 분 동안 용액에 인큐베이션되도록 하십시오.미누티엔 핀을 사용하여 실리콘 유전체 젤로 코팅하고 산소가 공급된 크렙스 링거 용액약 약 8밀리리터로 채워진 6센티미터 접시에 고정하여 다이어프램을 고정합니다. 현미경 단계에 접시를 놓습니다. 그런 다음 분당 8 밀리리터에서 30분 동안 더 많은 크렙스 링거 용액으로 다이어프램을 견딜 수 있습니다.4배 배율에서, 마이크로 조작기를 사용하여, 좌측 프렌닉 신경 위로 흡입 전극을 이동합니다. 흡입 전극에 부착된 튜브에 연결된 5밀리리터 주사기의 배럴을 꺼내 흡입을 적용합니다. 다이어프램이 브라이트필드 조명으로 시각적으로 검사하여 헤르츠 자극에 대응하여 수축되는지 확인합니다.그렇지 않은 경우, 전압 노브를 점진적으로 돌려 근육을 수축하는 육안 검사에 의해 확인할 수 있는 초막펄스를 달성하여 전압을 조절한다. 여전히 보이지 않는 경우 주사기로 신경을 날려 흡입을 적용하여 다시 그릴 수 있습니다. 지금, 근육 특이적 미오신 억제제 BHC 또는 전압 게이트 나트륨 채널 길항제 mu-conotoxin를 추가하기 위해 관혈을 끕니다.크렙스 링거 솔루션의 1밀리리터에 DMSO에 200 밀리머 스톡 BHC의 4개의 마이크로리터를 배관하여 BHC 사전 희석을 준비하십시오. 접시에서 크렙스 링거 용액 1밀리리터를 제거합니다. 그런 다음 미리 희석 된 BHC를 접시에 추가합니다.30분 후, 신선한 크렙스 링거 용액의 관류를 20~30분 간 돌립니다. 장갑을 착용하고, 1밀리미터의 외지와 0.4밀리미터의 내지름을 마이크로피펫 풀러에 배치하여 기록 전극을 준비합니다. 다이얼을 조여 제자리에 고정하고 풀러 도어를 닫습니다.그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 풀러를 프로그래밍합니다. 배아 다이어프램의 경우 앰프의 소프트웨어 제어를 사용하여 저항을 측정합니다. 저항이 60 메가옴에 가깝고 오래된 다이어프램, 10~ 20메가옴에 가깝습니다.이제 기록 전극을 3개의 어금니 칼륨염으로 적재합니다. 10배 배율에서, 자극전극으로 무대 반대편에 있는 두 번째 미세 조작기를 사용하여 전극을 근육으로 낮추어보라고 한다. 전기 생리학적 데이터 수집 소프트웨어를 사용하면 휴게멤브레인이 0에서 영하 65밀리볼트 이하로 변경될 때까지 기다립니다.한 hertz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슈트를 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 행동 잠재력의 존재를 확인. 자극 아티팩트를 작업 잠재력과 혼동하지 마십시오. 20배 배율은 녹색 노란 빛 여기 아래 형광표 알파 분가로톡신 신경근육 접합을 찾아 근육의 중심에 엔드 플레이트 밴드를 찾습니다.근육, 운동 신경 또는 슈완 세포에서 칼슘 반응을 이미지하기 위해 청색 광 여기로 전환하십시오. 이 예에서 GCaMP 3근육 세포에서 발현된다. 원하는 경우, 밴드 패스 필터와 이중 파장 이미징을 위한 디크로이크 단일 가장자리 필터로 이미지 스플리터를 설정합니다.슈타튬 염화물에 반응하여 비닝하지 않고 조직을 표현하는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기가 20배 배율로 포화를 나타내는 레벨의 110%로 설정된 조회 테이블 바의 밝기 막대로 실험을 수행합니다. 빠른 이벤트를 놓치지 않도록 초당 20 프레임으로 기록하십시오. 흡입 전극을 사용하여 충동의 기차를 제공함으로써 신경 자극의 20 에서 40 헤르츠의 1 ~ 45 초로 자극하고 정적 형광표시 알파 bungarotoxin 신경 근육 접합 신호와 함께 한 세포 하위 유형에서 동적 형광 칼슘 반응을 수집합니다.약리학 작용제는 또한 목욕 응용 프로그램에 의해 또는 관류에 의해 추가될 수 있고 동적 형광 칼슘 반응은 같은 방법으로 수집될 수 있습니다. 화상 진찰 또는 전기 생리학적 실험이 완료되면 원하는 결과가 달성되었기 때문에, 관류 선을 통해 물을 퍼퓨아서 흡입 전극을 통해 2~3회 물을 빨아 소금이 쌓이지 않도록 한다. 7일 산후일에 Wnt 1 GCaMP 3개의 마우스 횡격막의 프렌트 신경 자극에 대한 슈완 세포 칼슘 반응의 공간지도는 신경근육 접합부에서 말단 파라시냅틱 슈반 세포에 대한 제한을 나타낸다.같은 다이어프램은 형광으로 표지된 알파 분가로톡신으로 라벨을 붙인 후 이미지화되었으며, 이는 신경 근육 접합의 아세틸콜린 수용체를 가능하게 하는 결속을 결합합니다. 동일한 다이어프램은 또한 신경 근육 접합에 의해 근육의 시냅스 후 부위에 기록 전극을 안내하기 위해 브라이트 필드 조명 에서 이미지되었다. 여기에 개별 칼슘 과도의 분석을 위해 취한 색 코딩 된 세포 또는 관심 영역의 공간 경계가 있습니다.mth 5 GCaMP3 마우스 다이어프램의 근육 세포 칼슘 반응의 공간 맵은 모신 억제제 BHC의 존재에서 프렌닉 신경 자극에 모든 다이어프램 근육 세포의 전체 영역에 걸쳐 응답을 나타낸다. 대조적으로, 무코노톡신이 존재하여 동일한 다이어프램의 자극은 아세틸콜린 수용체 클러스터농축 단판 대역에 대응하는 모든 다이어프램 근육 세포의 내측 영역에서 공간적으로 제한된 칼슘 반응을 일으킨다. 이 절차에 따라 면역-히스토케또는 면역블로팅과 같은 다른 방법은 전기생리학 또는 칼슘 이미징에 의해 확인된 세포의 분자 프로파일과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니까?이 방법은 일반적인 신생아 마우스에 있는 신경 자극에 Schwann 세포 및 근육 세포의 인구 반응에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 더 오래 된 쥐의 연구 또는 신경 근육 질환 관련 된 단백질을 표현 하는 쥐의 연구에 적용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

전 비보 내 분 비 신호 초파리 에 두뇌 응답을 시각화 칼슘 이미징

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

연구

신경과학

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

마우스 의 생체 칼슘 이미징에서 맛 자극에 신경절 신경 반응

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Align of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina(가시광선 광간섭 단층 촬영 파이버그램과 동일한 마우스 망막의 컨포칼 이미지 정렬)

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

전기적으로 자극된 평판 장착 망막의 칼슘 이미징

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo (체외 주행) 간질의 초파리 모델을 위한 칼슘 영상

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...