Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet med midler fra National Institutes of Health (NIH) GM103554 og GM110767 til (T.W.G.) og National Center for forskning 5P20RR018751 og National Institute of General Medical Sciences 8P 20 GM103513 (til G.W.H.).

Husdyrhold og eksperimenter ble utført i samsvar med den nasjonale institutter for helse Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr og IACUC på University of Nevada.
1. forberedelse av membraner og Phrenic nerver fra transgene mus
<ol><li>Kjøpe transgene mus og oligonucleotide primere for genotype disse musene. Merk: Primerne vises på siden "Informasjon" for hver av disse musene.<ol>
<li>Rase 3 til 6-måneden-gamle musen uttrykke en kopi av det aktuelle transgene/knock-i grobunn-driver a...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Her gi vi noen eksempler på måler Ca2 + svar i bestemte celler i intakt nevromuskulær vev ved hjelp av GECI-uttrykke mus. For å utføre disse eksperimentene, er det viktig ikke å skade phrenic nerve under dissection. For å bilde Ca2 + svar i Schwann celler på enten lav eller høy effekt (dvs20 X eller 60 X), er det nødvendig å bruke enten BHC eller μ-conotoxin til å blokkere bevegelse. For lavt strømforbruk avbildning av Ca2 + svar i muskelceller er det mulig å måle...

NMJ, som alle synapser, består av tre elementer: en presynaptic terminal avledet fra en Nevron, en postsynaptic Nevron/effektor celle, og en perisynaptic glial celle1,2. Mens de grunnleggende aspektene av synaptic overføring ble først vist på denne synapse3, fortsatt mange aspekter av denne prosessen ukjent, delvis på grunn av uttrykket av de samme molekylene av de forskjellige Mobiltlf elementene av denne synapse. For eksempel uttrykkes reseptorer for både purine adenine nukleotid ATP og acetylkolin (ACh), som er co utgitt av motor neurons på virveldyrenes NMJ, av muskel, Schwann cellene og motor neurons, dermed kompliserer tolkningen av noen funksjonell effekt utøves av stoffer (f.eks, sender utgivelse eller svar, muskel styrkegenerering)4. Videre, selv om de tre komponentene i NMJ er enkelt forhold til, for eksempel nerveceller i sentralnervesystemet som ofte viser flere synaptic innganger, om motor neurons, muskelceller eller Schwann celler varierer i respons på stimuli basert på deres iboende heterogenitet (f.eksembryonale avledning fiber undertypen, morfologi) er uklart. For å møte hver av disse problemene, ville det være fordelaktig å samtidig spore responsen av mange celler innenfor en synaptic element, i tillegg til spor på samme tid, slik respons i ett av de andre momenter. Konvensjonelle strategies bruke kjemiske fargestoffer måle kalsium signalering kan ikke oppnå disse to mål, fordi bad brukte fargestoff er tatt opp av flere celletyper etter søknad til vev og intracellulært lastet fargestoff kan bare brukes til å visualisere individuelle eller små kohorter av celler. Her bruker transgene mus uttrykke GECIs utformet for å måle celle-spesifikke kalsium signalnettverk, bestemte bildebehandling og programvare verktøy5, vi viser først av disse to overordnede mål og diskutere hvordan tillegg av nye transgene verktøy ville bidra til å oppnå andre. Denne teknikken vil være nyttig for alle som er interessert i å spore kalsium dynamics eller andre mobilnettet signalisering hendelser observerbare gjennom gen-kodet optiske sensorer i flere celle populasjoner samtidig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

Den elektriske aktiviteten i cellene i vev kan overvåkes av elektrofysiologiske teknikker, men disse er vanligvis begrenset til analyse av individuelle celler. Siden en økning av intracellulær kalsium (Ca2 +) i stoffer ofte skyldes den elektriske aktiviteten, eller svar på et mylder av andre stimuli, denne prosessen kan overvåkes av lastet avbilding av celler med fluorescerende kalsium-sensitive fargestoffer.  Det er imidlertid vanskelig å avbilde dette svaret i en enkelt celle type i hele vev fordi disse fargestoffer er tatt opp av alle celletyper i vevet. I kontrast, genetisk kodet kalsium indikatorer (GECIs) kan uttrykkes ved en enkeltcelle type og fluoresce svar på en økning på intracellulær Ca2 +, og tillater avbilding av Ca2 + signalering i hele populasjoner av individuelle celletyper. Her bruker vi bruk av GECIs GCaMP3/6 musen nevromuskulær veikrysset, en tredelt synapse mellom motor neurons, skjelettlidelser muskel og terminal/perisynaptic Schwann celler. Viser vi nytten av denne teknikken i klassisk ex vivo vev preparater. Bruker en optisk splitter, utføre vi dual-bølgelengde bildebehandling dynamisk Ca2 + signaler og en statisk etikett av nevromuskulær krysset (NMJ) i en tilnærming som kan være enkelt tilpasses til å overvåke to celle-spesifikke GECI eller genetisk kodet spenning indikatorer (GEVI) samtidig. Til slutt, vi diskutere rutinene som brukes til å fange romlige kart over fluorescens intensitet. Sammen kan disse optisk transgene og analytiske teknikker brukes til å studere biologiske aktivitet distinkte celle subpopulasjoner på NMJ i en rekke sammenhenger.

Flere eksempler på fluorescens intensitet endringer, formidlet av økning av intracellulær Ca2 + innenfor definerte celletyper NMJ, viser verktøyet av denne tilnærmingen. Disse resultatene presenteres som romlig fluorescens intensitet kart, som gir plasseringen av svarer cellene og intensiteten av svar, slik at for vurdering av hvor mange cellene reagerer og hvor mye hver celle svarer på et bestemt stimulans. For eksempel, som vist i figur 1, ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Her presenterer vi en protokoll til bildet kalsium signalering i populasjoner av enkelte celletyper i murine nevromuskulær krysset.

Ex Vivo Bilde av celle-spesifikke kalsium signalisering på tre Synapse av musen membranen

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i det nevromuskulære feltet, for eksempel rollen som kalsiumsignalering i muskel- eller Schwann-celler som svar på nervestimulering. Den største fordelen med denne teknikken er at man kan bilde aktiveringen av bestemte celletyper som svar på nervestimulering. For å begynne, få transgene mus, og genotype dem som beskrevet i tekstprotokollen.Etter eutanasi, tverrgående seksjon over hele dyret like under leveren og like over hjertet og lungene med iridektomi saks. Dissekere bort leveren, hjertet og lungene. Vær forsiktig med å opprettholde en lengde på phrenic nerve som er tilstrekkelig lang nok til å bli trukket inn i en sugeelektrode.Fjern ytterligere ribbeburet og vertebralkolonnen, bortsett fra den tynne ryggen rundt membranen. Plasser membranen og phrenic nerveprøven i et mikrofugerør med Krebs-Ringer-løsning som inneholder ett mikrogram per milliliter fluorescerende merket alfa bungarotoksin. La prøven inkubere i oppløsningen i 10 minutter i mørket.Ved hjelp av minutien pinner immobilisere membranen ved å feste den på en seks centimeter parabolen belagt med silikon dielektrisk gel og fylt med ca åtte milliliter oksygenert Krebs-Ringer løsning. Plasser parabolen på mikroskopstadiet. Deretter perfuse membranen med mer Krebs-Ringer løsning på åtte milliliter per minutt i 30 minutter.Ved fire ganger forstørrelse, ved hjelp av en mikromanipulator, flytt sugeelektroden over venstre phrenic nerve. Påfør sugesugingen ved å trekke ut sylinderen på en fem milliliter sprøyte koblet til slangen som er festet til sugeelektroden. Sørg for at membranen trekker seg sammen som svar på den ene hertz-stimuleringen ved å visuelt undersøke den med Brightfield-belysning.Hvis ikke, juster spenningen ved å dreie spenningsknappen trinnvis for å oppnå en supramaksimal puls som kan verifiseres ved visuell undersøkelse av muskelsammentrekning. Hvis den fortsatt ikke er synlig, blås ut nerven med sprøyten og forsøk å trekke den inn igjen ved å påføre suging. Nå, slå av perfusjonen for å legge til muskelspesifikke myosinhemmer BHC eller spenningen gated natriumkanal antagonist mu-conotoxin.Forbered BHC-fortynningen ved å pipe fire mikroliter på 200 millimolarlager BHC i DMSO i en milliliter Krebs-Ringer-løsning. Fjern en milliliter Krebs-Ringer løsning fra parabolen. Tilsett deretter den forhåndsfortynnede BHC til parabolen.Etter 30 minutter, slå på perfusjonen av fersk Krebs-Ringer løsning i ytterligere 20 til 30 minutter. Bruk hansker, forberede opptakselektroden ved å plassere et borosilikat filamented glass med en ytre diameter på en millimeter og en indre diameter på 0,4 millimeter i en mikropipette avtrekker. Stram skivene for å klemme den på plass og lukk avtrekkerdøren.Programmer deretter avtrekkeren som beskrevet i tekstprotokollen. For embryonale membraner, måle motstanden ved hjelp av programvarekontroller av forsterkeren. Sørg for at motstanden er nær 60 megaohms og for eldre membraner, 10 til 20 megaohms.Last nå opptakselektroden med tre molarkaliumklorid. Ved 10 ganger forstørrelse, senk elektroden i muskel ved hjelp av en annen mikromanipulator på motsatt side av scenen som en stimulerende elektrode. Ved hjelp av elektrofysiologiske datainnsamling programvare vente til hvilemembran potensielle endringer fra null til minus 65 millivolts eller under.Stimulere på en hertz og verifisere tilstedeværelsen av en muskel handling potensial ved å se etter et stort potensial som viser en beskjeden overshoot. Ikke forveksle stimuleringsartefakt med et virkningspotensial. Ved 20 ganger forstørrelse finne endeplate bandet i midten av muskelen ved å lete etter fluorescerende merket alfa bungarotoxin nevromuskulære veikryss under grønt gult lys eksitasjon.Bytt til eksitasjon av blått lys til bildekalsiumresponser i muskel-, motorneuron- eller Schwann-celler. I dette eksemplet GCaMP tre uttrykkes i muskelceller. Hvis ønskelig, sett opp bildesplitteren med båndpassfiltre og et dichroic enkeltkantfilter for dual wavelength imaging.Utfør eksperimenter med lysstyrkelinjen på oppslagstabelllinjen satt til 110% av nivået der den genetisk kodede kalsiumindikatoren som uttrykker vev, viser metning ved 20 ganger forstørrelse uten binning som svar på kaliumklorid. Ta opp med 20 bilder per sekund for ikke å gå glipp av noen raske hendelser. Stimulere med en til 45 sekunder av 20 til 40 hertz av nervestimulering ved å levere et tog av impulser ved hjelp av en sugeelektrode og samle dynamiske fluorescerende kalsiumresponser i en celle sub-type sammen med statisk fluorescerende merket alfa bungarotoxin nevromuskulært kobling signal.Farmakologiske agonister kan også tilsettes ved bad påføring eller ved perfusjon, og de dynamiske fluorescerende kalsiumresponsene kan samles på samme måte. Når bildebehandling eller elektrofysiologiske eksperimenter er ferdig fordi de ønskede resultatene er oppnådd, perfuse vann gjennom perfusjonslinjene og suge vann to til tre ganger gjennom sugeelektroden for å sikre at salter ikke bygger seg opp. Et romlig kart over Schwann celle kalsium svar på phrenic nerve stimulering av en Wnt en GCaMP tre musemembran på post natal dag syv viser en begrensning til terminal parasynaptiske Schwann celler ved nevromuskulære krysset.Den samme membranen ble avbildet etter merking med fluorescerende merket alfa bungarotoxin, som binder seg for å muliggjøre acetylkolinreseptorer i det nevromuskulære krysset. Den samme membranen ble også avbildet under Brightfield-belysning for å lede en opptakselektrode til den postsynaptiske regionen av muskelen ved det nevromuskulære krysset. Vist her er romlig avgrensning av fargekodede celler eller regioner av interesse tatt for analyse av individuelle kalsiumtransienter.Det romlige kartet over muskelcellekalsiumresponser av en mth 5 GCaMP tre musemembran ved P fire til phrenic nervestimulering i nærvær av myosinhemmeren BHC viser en respons i hele regionen av alle membranmuskelceller. I motsetning forårsaker stimulering av samme membran i nærvær av mu-conotoxin en romlig begrenset kalsiumrespons i medialområdet til alle membranmuskelceller som tilsvarer acetylkolinreseptorklyngen beriket endeplatebånd. Etter denne prosedyren kan andre metoder som immuno-histochemistry eller immunoblotting utføres for å svare på flere spørsmål som, hva er den molekylære profilen til celler identifisert av elektrofysiologi eller kalsiumavbildning?Denne metoden kan gi innsikt i populasjonsresponser av Schwann-celler og muskelceller til nervestimulering hos normale neonatale mus. Det kan også brukes til studiet av eldre mus eller til studiet av mus som uttrykker nevromuskulær sykdom forbundet proteiner.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalsium Imaging for å visualisere hjernen Svar å endokrine signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo kalsiumavbildning av mus Geniculate Ganglion Neuron Responser på smak stimuli

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field og Two-Photon Calcium Imaging fra en mus ved hjelp av et stort kranialt vindu

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Kalsiumavbildning i mus Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Justering av synlig lys optisk koherens tomografi fibergrammer med konfokale bilder av samme mus netthinnen

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Kalsiumavbildning i elektrisk stimulerte flatmonterte netthinner

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Eks Vivo Kalsiumavbildning for Drosophila modell av epilepsi

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...