Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Este trabalho foi financiado com fundos de institutos nacionais de saúde (NIH) GM103554 e GM110767 a (T.W.G.) e do centro nacional de pesquisa recursos 5P20RR018751 e o Instituto Nacional de ciências médicas de geral 8P 20 GM103513 (para G.W.H.).

Pecuária e experimentos foram realizados em conformidade com os institutos nacionais de saúde guia para o cuidado e uso de animais de laboratório e o IACUC na Universidade de Nevada.
1. preparação dos diafragmas e nervos frênico de ratos transgênicos
<ol><li>Compre ratos transgénicos e primeiras demão do oligonucleotide genótipo estes ratos. Nota: Os primers são listados na página "Informações" para cada um destes ratos.<ol>
<li>Criar um mouse de 3 a 6 meses de idade, expres...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Aqui nós fornecemos alguns exemplos de Ca2 + respostas em células específicas no tecido neuromuscular intacto, usando ratos Lino-expressando de medição. Para executar com êxito estes experimentos, é imperativo para não machucar o nervo frênico durante a dissecção. ParaCa 2 + respostas nas células de Schwann em baixa ou alta potência (ou seja, 20 X ou 60 X) de imagem, é necessário usar BHC ou µ-conotoxina ao movimento do bloco. Para imagens de baixo consumo de energia de Ca<s...

O MNJ, como todas as sinapses, é composto por três elementos: um terminal pré-sináptica derivado de um neurônio, uma célula neurônio pós-sináptico/efetoras, e um perisynaptic glia celular1,2. Enquanto os aspectos básicos de transmissão sináptica primeiro foram demonstrados neste de sinapse3, muitos aspectos deste processo permanecem desconhecidos, em parte devido a expressão das mesmas moléculas por elementos celulares distintas desta sinapse. Por exemplo, os receptores de ambos os nucleotídeos de adenina Purina ATP e acetilcolina (ACh), que são co liberados por neurônios motores no MNJ vertebrado, são expressos por músculo, células de Schwann e neurônios motores, complicando, assim, a interpretação de qualquer efeito funcional exercido por estas substâncias (por exemplo, liberação de transmissor ou resposta, geração de força muscular)4. Além disso, embora os componentes tripartites o MNJ são simples em comparação com, por exemplo, os neurônios no sistema nervoso central que muitas vezes apresentam múltiplas entradas sinápticas, se os neurônios motores, células musculares ou células de Schwann variam em resposta a estímulos com base na sua intrínseca heterogeneidade (por exemplo, derivação embrionária, subtipo de fibra, morfologia) não é clara. A fim de abordar cada uma destas questões, seria vantajoso para controlar simultaneamente a resposta de muitas células dentro de um elemento sináptico, bem como faixa, ao mesmo tempo, essa resposta em qualquer um dos outros elementos separados. Estratégias convencionais usando corantes químicos para medir a sinalização de cálcio não podem atingir esses dois objetivos, porque banho-aplicado tintura é retomada por vários tipos de células após a aplicação de tecido e intracelular carregado da tintura só pode ser usada para Visualizar individuais ou pequenas divisões de células. Aqui, utilizar ratos transgênicos expressando GECIs projetado para medir a célula específica cálcio sinalização, juntamente com imagens específicas e ferramentas de software5, demonstramos o primeiro destes dois objectivos globais e discutir como a adição de novos ferramentas de transgénicas ajudaria a alcançar o segundo. Esta técnica será útil para qualquer pessoa interessada em acompanhar a dinâmica de cálcio ou outro celular sinalização observáveis de eventos através de sensores ópticos gene codificado em várias populações de células ao mesmo tempo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

A atividade elétrica das células em tecidos pode ser monitorizada por técnicas eletrofisiológicas, mas estas geralmente limitam-se a análise de células individuais. Desde que um aumento de cálcio intracelular (Ca2 +) no citosol ocorre muitas vezes devido à atividade elétrica, ou em resposta a uma miríade de outros estímulos, esse processo pode ser monitorado pela imagem de células carregado com sensíveis ao cálcio fluorescente corantes.  No entanto, é difícil esta resposta em um tipo de célula individual dentro de todo tecido da imagem porque estas tinturas são aceites por todos os tipos de células dentro do tecido. Em contraste, os indicadores de cálcio geneticamente codificado (GECIs) podem ser expressa por um tipo de célula individual e fluorescem em resposta a um aumento de intracelular Ca2 +, permitindo assim a imagem de Ca2 + sinalização em populações inteiras de tipos de células individuais. Aqui, nós aplicamos o uso do GECIs GCaMP3/6 até a junção neuromuscular do mouse, uma sinapse tripartida entre os neurônios motores, músculo esquelético e terminal/perisynaptic células de Schwann. Vamos demonstrar a utilidade desta técnica em preparações do tecido clássico ex vivo . Usando um divisor ótico, realizamos imagem dual-comprimento de onda de Ca2 + sinais dinâmicos e um rótulo estático da junção neuromuscular (JNM) em uma abordagem que poderia ser facilmente adaptada para monitorar duas células específicas Lino ou tensão geneticamente codificado indicadores (GEVI) simultaneamente. Finalmente, discutimos as rotinas usadas para capturar espacial de mapas de intensidade de fluorescência. Juntas, estas técnicas ópticas, transgênicas e analíticas podem ser empregadas para estudar a atividade biológica das subpopulações de células distintas para o MNJ em uma ampla variedade de contextos.

Vários exemplos de mudanças de intensidade de fluorescência, mediadas por aumentos de intracelular Ca2 + dentro de tipos de células definidas do MNJ, mostram a utilidade desta abordagem. Estes resultados são apresentados como mapas de intensidade de fluorescência espacial, que fornecem a localização das células de resposta, bem como a intensidade de suas respostas, permitindo, assim, para a avaliação de quantas células respondem e quanto cada célula responde a uma ...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Aqui nós apresentamos um protocolo ao cálcio imagem sinalização em populações de tipos de células individuais na junção neuromuscular murino.

Ex Vivo Imagem de célula específica cálcio sinalização em sinapse tripartida do diafragma de rato

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo neuromuscular, como o papel da sinalização de cálcio em células musculares ou schwann em resposta à estimulação nervosa. A principal vantagem dessa técnica é que se pode imaginar a ativação de tipos celulares específicos em resposta à estimulação nervosa. Para começar, obtenha camundongos transgênicos e genótipo-los conforme detalhado no protocolo de texto.Seguindo a eutanásia, seção transversal em todo o animal logo abaixo do fígado e logo acima do coração e pulmões com tesoura de iridectomia. Dissecar o fígado, o coração e os pulmões. Ter cuidado para manter um comprimento do nervo frênico que é suficientemente longo o suficiente para ser arrastado para um eletrodo de sucção.Remova ainda mais a caixa torácica e a coluna vertebral, exceto pelo cume fino ao redor do diafragma. Coloque o diafragma e a amostra do nervo frênico em um tubo de microfuge com solução Krebs-Ringer contendo um micrograma por mililitro de bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada. Deixe o espécime incubar na solução por 10 minutos no escuro.O uso de pinos minutien imobiliza o diafragma prendendo-o em um prato de seis centímetros revestido com gel dielétrico de silicone e preenchido com aproximadamente oito mililitros de solução Krebs-Ringer oxigenada. Coloque o prato no palco do microscópio. Em seguida, perfuça o diafragma com mais solução Krebs-Ringer a oito mililitros por minuto durante 30 minutos.Quatro vezes a ampliação, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo. Aplique a sucção puxando o barril de uma seringa de cinco mililitros conectada ao tubo que está preso ao eletrodo de sucção. Certifique-se de que o diafragma contrai em resposta à estimulação hertz examinando-a visualmente com iluminação Brightfield.Caso não, ajuste a tensão girando o botão de tensão incrementalmente para alcançar um pulso supramaximal que pode ser verificado por exame visual da contração muscular. Se ainda não estiver visível, exploda o nervo com a seringa e tente atraí-la novamente aplicando sucção. Agora, desligue a perfusão para adicionar o inibidor de minosina específica do músculo BHC ou o antagonista do canal de sódio de tensão, mu-conotoxina.Prepare a pré-diluição bhc, pipetando quatro microlitadores de 200 mililitros de estoque BHC em DMSO em um mililitro de solução Krebs-Ringer. Remova um mililitro da solução Krebs-Ringer do prato. Em seguida, adicione o BHC pré-diluído ao prato.Após 30 minutos, ligue a perfusão da solução Krebs-Ringer fresca por mais 20 a 30 minutos. Usando luvas, prepare o eletrodo de gravação colocando um vidro filamentado borossilicato com um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,4 milímetros em um puxador de micropipette. Aperte os mostradores para fixá-lo na posição e feche a porta do puxador.Em seguida, programe o puxador como descrito no protocolo de texto. Para diafragmas embrionários, meça a resistência usando controles de software do amplificador. Certifique-se de que a resistência está perto de 60 megaohms e para diafragmas mais antigos, de 10 a 20 megaohms.Agora, carregue o eletrodo de gravação com três cloreto de potássio molar. Em 10 vezes a ampliação, abaixe o eletrodo em músculo usando um segundo micromanipulador no lado oposto do palco como um eletrodo estimulante. O uso do software de aquisição de dados eletrofisiológicos espera até que o potencial de membrana de repouso mude de zero para menos 65 milvolts ou abaixo.Estimule em um hertz e verifique a presença de um potencial de ação muscular verificando um grande potencial que exibe uma superação modesta. Não confunda artefato de estimulação com potencial de ação. Em 20 vezes a ampliação localize a faixa da placa final no centro do músculo procurando por junções neuromusculares alfa fluorescentemente rotuladas sob excitação de luz amarela verde.Mude para excitação de luz azul para respostas de cálcio de imagem em células musculares, neurônios motores ou schwann. Neste exemplo, gCaMP três é expresso em células musculares. Se desejar, configure o divisor de imagens com filtros de passe de banda e um filtro de borda únicadicróica para a imagem de comprimento de onda dupla.Realize experimentos com a barra de brilho na barra de mesa de pesquisa definida para 110% do nível em que o indicador de cálcio geneticamente codificado expressando tecido exibe saturação em 20 vezes a ampliação sem binning em resposta ao cloreto de potássio. Grave a 20 quadros por segundo para não perder nenhum evento rápido. Estimule com um a 45 segundos de 20 a 40 hertz de estimulação nervosa, fornecendo um trem de impulsos usando um eletrodo de sucção e colete respostas dinâmicas de cálcio fluorescente em um subtipo de célula, juntamente com o sinal de junção neuromuscular alfa fluorescentemente rotulado estático.Agonistas farmacológicos também podem ser adicionados por aplicação de banho ou por perfusão e as respostas dinâmicas de cálcio fluorescente podem ser coletadas da mesma forma. Quando os experimentos de imagem ou eletrofisiológico são concluídos porque os resultados desejados foram alcançados, perfuuse a água através das linhas de perfusão e suge água duas a três vezes através do eletrodo de sucção para garantir que os sais não se acumulem. Um mapa espacial das respostas de cálcio celular schwann à estimulação do nervo frênico de um Wnt one GCaMP três diafragma de rato no sétimo dia de natal mostram uma restrição às células schwann parassintálicas terminais na junção neuromuscular.O mesmo diafragma foi imageado após rotulagem com bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada, que se liga para permitir receptores de acetilcolina da junção neuromuscular. O mesmo diafragma também foi imageado sob a iluminação brightfield para guiar um eletrodo de gravação para a região pós-sináptica do músculo pela junção neuromuscular. Aqui mostrada é a demarcação espacial de células codificadas por cores ou regiões de interesse tomadas para análise de transitórios individuais de cálcio.O mapa espacial das respostas de cálcio celular muscular de um mth 5 GCaMP três diafragma de camundongos em P quatro a estimulação nervosa frênica na presença do inibidor de miosina BHC mostra uma resposta em toda a região de todas as células musculares diafragma. Em contraste, a estimulação do mesmo diafragma na presença de mu-conotoxina causa uma resposta espacialmente restrita de cálcio na região medial de todas as células musculares diafragma que corresponde ao aglomerado receptor de acetilcolina enriquecido banda de placa final. Seguindo este procedimento outros métodos como imuno-histoquímica ou imunoblotting podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como, qual é o perfil molecular das células identificadas por eletrofisiologia ou imagem de cálcio?Este método pode fornecer uma visão das respostas populacionais das células schwann e células musculares à estimulação nervosa em camundongos neonatais normais. Também pode ser aplicado ao estudo de camundongos mais velhos ou ao estudo de camundongos que expressam proteínas associadas à doença neuromuscular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Neurociência

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

In vivo Imagem de cálcio do rato Geniculado Gânglio Respostas ao Sabor Estímulo

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Imagem de cálcio de campo amplo e de dois fótons de um rato usando uma grande janela craniana

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imagem de cálcio no colículo superior de camundongos

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alinhamento de Fibrogramas de Tomografia de Coerência Óptica com Luz Visível com Imagens Confocais da Mesma Retina de Camundongo

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Imagem de cálcio em retinas planas eletricamente estimuladas

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Imagem de cálcio para Drosophila Modelo de Epilepsia

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...