Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Este trabajo fue financiado con fondos de los institutos nacionales de salud (NIH) GM103554 y GM110767 a (T.W.G.) y del centro nacional para recursos de investigación 5P20RR018751 y el Instituto Nacional de Ciencias de médicas General 8P 20 GM103513 (a G.W.H.).

Cría de animales y los experimentos se realizaron según los institutos nacionales de salud guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y la IACUC en la Universidad de Nevada.
1. preparación de los diafragmas y los nervios frénicos de ratones transgénicos
<ol><li>Comprar ratones transgénicos y cartillas del oligonucleótido a genotipo de estos ratones. Nota: Los iniciadores están listados en la página de "Información" para cada uno de estos ratones.<ol>
<li>Criar un rat...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Aquí le ofrecemos algunos ejemplos de medición de Ca2 + respuestas en células específicas en tejido neuromuscular intacto usando ratones expresan GECI. Para realizar exitosamente estos experimentos, es imperativo de no lesionar el nervio frénico durante la disección. Para imagen de Ca2 + respuestas en las células de Schwann en baja o alta energía (es decir, 20 X o 60 X), es necesario utilizar BHC o μ-Conotoxina al movimiento del bloque. Para la proyección de imagen de baja potenci...

El NMJ, como todas las sinapsis, se compone de tres elementos: una terminal presináptica deriva de una neurona, una célula postsynaptic neurona/efector, y un perisynaptic glial de la célula1,2. Mientras que los aspectos básicos de la transmisión sináptica se demostraron por primera vez en esta sinapsis3, muchos aspectos de este proceso siguen siendo desconocidos, en parte debido a la expresión de las moléculas del mismo por los distintos elementos celulares de esta sinapsis. Por ejemplo, se expresan receptores para acetilcolina (ACh) tanto el nucleótido de purina adenina ATP que conjuntamente son liberados por las neuronas motoras en lo vertebrado NMJ, músculo, células de Schwann y las neuronas motoras, así que complica la interpretación de cualquier efecto funcional ejercida por estas sustancias (p. ej., liberación de transmisor o respuesta, generación de fuerza muscular)4. Por otra parte, aunque los componentes tripartitos de la NMJ son simples en comparación con, por ejemplo, las neuronas en el sistema nervioso central que a menudo exhiben múltiples entradas sinápticas, si las neuronas motoras, las células musculares o las células de Schwann varían en respuesta a estímulos en en su intrínseca heterogeneidad (p. ej., derivación embrionaria, subtipo de fibra, morfología) es confuso. Para abordar cada uno de estos temas, sería ventajoso seguir simultáneamente la respuesta de muchas células dentro de un elemento sináptica, como pista, a la vez, una respuesta en cualquiera de los otros elementos. Estrategias convencionales utilizando colorantes químicos para medir calcio señalización no pueden alcanzar estos dos objetivos, porque aplicar baño de tinte es tomado por varios tipos de la célula después de la aplicación al tejido, y tinte intracelular cargado puede utilizarse para visualizar individuales o pequeñas cohortes de las células. Aquí, utilizando ratones transgénicos que expresaban GECIs diseñado para medir calcio celular específico señalización, junto con la proyección de imagen específica y herramientas de software5, que demostrar la primera de estas dos metas generales y discutir cómo la adición de nuevos herramientas de transgénicos ayudaría a alcanzar al segundo. Esta técnica será útil para cualquier persona interesada en el seguimiento de la dinámica del calcio u otro celular señalización observable de eventos a través de sensores ópticos codificada por el gen en varias poblaciones de la célula al mismo tiempo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

La actividad eléctrica de las células en los tejidos puede ser monitoreada por técnicas electrofisiológicas, pero éstos se limitan generalmente para el análisis de células individuales. Ya que un aumento del calcio intracelular (Ca2 +) en el citosol ocurre a menudo debido a la actividad eléctrica, o en respuesta a una multitud de otros estímulos, este proceso puede ser monitoreado por la proyección de imagen de células cargadas con fluorescente sensible al calcio colorantes.  Sin embargo, es difícil esta respuesta en un tipo de células individuales dentro del tejido de todo la imagen porque estos tintes son tomados por todos los tipos de células dentro del tejido. En cambio, los indicadores genético codificados calcio (GECIs) pueden expresarse mediante un tipo de célula individual y fluorescencia en respuesta a un aumento de intracelular Ca2 +, lo que permite la proyección de imagen de Ca2 + en poblaciones enteras de tipos de células individuales. Aquí aplicamos el uso de GECIs GCaMP3/6 a la Unión neuromuscular de ratón, células de Schwann de sinapsis entre las neuronas motoras, el músculo esquelético y terminal/perisynaptic tripartita. Demostramos la utilidad de esta técnica en preparaciones de tejido clásico ex vivo . El uso de un divisor óptico, realizar proyección de imagen de doble longitud de onda de Ca2 + señales de dinámica y estática etiqueta de la placa neuromuscular (NMJ) en un enfoque que podría ser fácilmente adaptado para monitorear dos GECI específicos de la célula o voltaje genéticamente codificado indicadores (GEVI) simultáneamente. Finalmente, discutimos las rutinas que utilizan para capturar mapas espaciales de intensidad de fluorescencia. Juntos, pueden emplearse estas técnicas ópticas, transgénicos y analíticas para el estudio de la actividad biológica de las subpoblaciones de células distintas en el NMJ en una amplia variedad de contextos.

Varios ejemplos de cambios de intensidad de fluorescencia, mediados por el aumento de intracelular Ca2 + dentro de tipos definida de la célula de la NMJ, Mostrar la utilidad de este enfoque. Estos resultados se presentan como mapas de intensidad de fluorescencia espacial, que proporcionan la localización de las células respondieron a esta pregunta, así como la intensidad de sus respuestas, lo que permite la evaluación de cuántas células responden y cuánto cada célula r...

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Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuromuscular, como el papel de la señalización de calcio en el músculo o las células Schwann en respuesta a la estimulación nerviosa. La principal ventaja de esta técnica es que se puede imaginar la activación de tipos celulares específicos en respuesta a la estimulación nerviosa. Para empezar, obtener ratones transgénicos, y genotipo como se detalla en el protocolo de texto.Después de la eutanasia, sección transversal a través de todo el animal justo debajo del hígado y justo por encima del corazón y los pulmones con tijeras iridectomía. Disecciona el hígado, el corazón y los pulmones. Tener cuidado de mantener una longitud del nervio frénico que es lo suficientemente largo como para ser arrastrado a un electrodo de succión.Retire aún más la caja torácica y la columna vertebral, excepto por la cresta delgada alrededor del diafragma. Coloque el diafragma y la muestra del nervio frénico en un tubo de microfure con la solución Krebs-Ringer que contenga un microgramo por mililitro de bungarotoxina alfa con etiqueta fluorescente. Deje que el espécimen se incubar en la solución durante 10 minutos en la oscuridad.El uso de pasadores minutien inmovilizan el diafragma clasificándolo en un plato de seis centímetros recubierto con gel dieléctrico de silicona y lleno de aproximadamente ocho mililitros de solución oxigenada Krebs-Ringer. Coloque el plato en la etapa del microscopio. Luego, perfunda el diafragma con más solución Krebs-Ringer a ocho mililitros por minuto durante 30 minutos.A cuatro veces el aumento, usando un micromanipulador, mueva el electrodo de succión sobre el nervio frénico izquierdo. Aplique la succión tirando del barril de una jeringa de cinco mililitros conectada al tubo que está unido al electrodo de aspiración. Asegúrese de que el diafragma se contraiga en respuesta a la estimulación de un hercio examinándolo visualmente con iluminación Brightfield.Si no es así, ajuste la tensión girando la perilla de voltaje de forma incremental para lograr un pulso supramaximal que se puede verificar mediante el examen visual de la contracción muscular. Si aún no es visible, sople el nervio con la jeringa e intente extraerlo de nuevo aplicando succión. Ahora, apague la perfusión para agregar el inhibidor de la miosina específico del músculo BHC o el antagonista del canal de sodio cerrado por voltaje mu-conotoxina.Preparar la pre-dilución BHC pipeteando cuatro microlitros de 200 mililitros de BHC en DMSO en un mililitro de solución Krebs-Ringer. Retire un mililitro de solución Krebs-Ringer del plato. A continuación, agregue el BHC pre-diluido al plato.Después de 30 minutos, encienda la perfusión de la solución fresca de Krebs-Ringer durante otros 20 a 30 minutos. Usando guantes, prepare el electrodo de grabación colocando un vidrio filamentado de borosilicato con un diámetro exterior de un milímetro y un diámetro interior de 0,4 milímetros en un tirador de micropipeta. Apriete las esferas para sujetarlo en su posición y cierre la puerta del tirador.A continuación, programe el puller como se describe en el protocolo de texto. Para diafragmas embrionarios, mida la resistencia utilizando controles de software del amplificador. Asegúrese de que la resistencia es de cerca de 60 megamios y para diafragmas más antiguos, 10 a 20 megamios.Ahora, cargue el electrodo de grabación con tres cloruros de potasio molar. A 10 veces el aumento, baje el electrodo en el músculo usando un segundo micromaniprógrafo en el lado opuesto de la etapa como un electrodo estimulante. El uso de software de adquisición de datos electrofisiológicos espere hasta que el potencial de la membrana en reposo cambie de cero a menos 65 milivoltios o inferior.Estimular en un hercio y verificar la presencia de un potencial de acción muscular mediante la comprobación de un gran potencial que exhibe un modesto exceso. No confunda el artefacto de estimulación con un potencial de acción. A 20 veces la ampliación ubica la banda de la placa final en el centro del músculo buscando conexiones neuromusculares alfa bungarotoxina etiquetadas fluorescentemente bajo excitación de luz amarilla verde.Cambie a la excitación de luz azul para probar las respuestas de calcio en el músculo, la neurona motora o las células Schwann. En este ejemplo GCaMP tres se expresa en células musculares. Si lo desea, configure el divisor de imagen con filtros de paso de banda y un filtro de borde único dicroico para la imagen de longitud de onda dual.Realizar experimentos con la barra de brillo en la barra de la tabla de búsqueda establecida en 110%del nivel en el que el indicador de calcio genéticamente codificado que expresa el tejido exhibe saturación a 20 veces el aumento sin binning en respuesta al cloruro de potasio. Graba a 20 fotogramas por segundo para no perderte ningún evento rápido. Estimule con uno a 45 segundos de 20 a 40 hercios de estimulación nerviosa mediante la entrega de un tren de impulsos utilizando un electrodo de succión y recoger respuestas dinámicas de calcio fluorescente en un subestro de celda junto con la señal de unión neuromuscular alfa bungarotoxina estática etiquetada fluorescentemente.Los agonistas farmacológicos también se pueden añadir mediante la aplicación del baño o por perfusión y las respuestas dinámicas de calcio fluorescente se pueden recoger de la misma manera. Cuando las imágenes o experimentos electrofisiológicos hayan terminado porque se han logrado los resultados deseados, perfunda el agua a través de las líneas de perfusión y succiona el agua dos o tres veces a través del electrodo de aspiración para garantizar que las sales no se acumulen. Un mapa espacial de las respuestas de calcio celular de las células de Schwann a la estimulación del nervio frénico de un diafragma GCaMP tres ratón Wnt en el día siete posterior al parto muestra una restricción a las células Schwann parasinápticas terminales en la unión neuromuscular.El mismo diafragma fue visualizado después del etiquetado con bungarotoxina alfa etiquetada fluorescentemente, que se une para permitir los receptores de acetilcolina de la unión neuromuscular. El mismo diafragma también fue imán bajo iluminación Brightfield para guiar un electrodo de grabación a la región postsináptica del músculo por la unión neuromuscular. Aquí se muestra la demarcación espacial de células codificadas por colores o regiones de interés tomadas para el análisis de transitorios de calcio individuales.El mapa espacial de las respuestas de calcio de las células musculares de un mth 5 GCaMP tres diafragma de ratón en P cuatro a la estimulación del nervio frénico en presencia del inhibidor de la miosina BHC muestra una respuesta en toda la región de todas las células musculares del diafragma. Por el contrario, la estimulación del mismo diafragma en presencia de mu-conotoxina provoca una respuesta de calcio espacialmente restringida en la región medial de todas las células musculares del diafragma que corresponde a la banda de placas finales enriquecida con el clúster de receptores de acetilcolina. Siguiendo este procedimiento se pueden realizar otros métodos como inmuno-histoquímica o inmunoblotting para responder a preguntas adicionales como, ¿cuál es el perfil molecular de las células identificadas por electrofisiología o imágenes de calcio?Este método puede proporcionar información sobre las respuestas poblacionales de las células Schwann y las células musculares a la estimulación nerviosa en ratones neonatales normales. También se puede aplicar al estudio de ratones mayores o al estudio de ratones que expresan proteínas asociadas a enfermedades neuromusculares.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Proyección de imagen de calcio para la visualización de las respuestas cerebrales a la señalización endocrina en Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

Investigación

Neurociencias

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Imágenes de calcio in vivo de las respuestas de las neuronas ganglionares geniculadas de ratón a los estímulos del gusto

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imágenes de calcio en la aceituna inferior de ratón

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Imágenes de calcio en el colículo superior de ratón

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Alineación de figramas de tomografía de coherencia óptica en luz visible con imágenes confocales de la misma retina de ratón

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Imágenes de calcio en retinas planas estimuladas eléctricamente

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo Imágenes de calcio para el modelo de epilepsia de Drosophila

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...

Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging

Implantation of the Headplate in Mouse for Calcium Imaging  (Video) | JoVE 

Implantación de la placa de la cabeza en ratón para la obtención de imágenes de calcio 

Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging

Implanting the Plug in the Mouse for Calcium Imaging (Video) | JoVE 

Implantar el enchufe en el ratón para obtener imágenes de calcio