Name: ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm
Uploaded: 2018-10-04T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Bu eser fonları sağlık (NIH) GM103554 ve GM110767 (T.W.G.) için ulusal Enstitüleri ve araştırma kaynakları 5P20RR018751 Ulusal Merkezi ve Ulusal Enstitüsü genel tıbbi Bilimler 8 P 20 GM103513 (için G.W.H.) ile desteklenmiştir.

Hayvancılık ve deneyler için bakım ve kullanım laboratuvar hayvan ve IACUC University of Nevada, Ulusal Sağlık Rehberi Enstitüleri uygun olarak yapıldı.
1. zarlar ve frenik sinir transgenik fareler üzerinden hazırlanması
<ol><li>Transgenik fareler ve oligonükleotid astar genotip için bu fare satın alabilirsiniz. Not: Astar her bu fareler için "Bilgi" sayfasında listelenir.<ol>
<li>3 - için 6-ay-yaşlı fare uygun transgenik/knock-in Cre-sürücü alleli bir kopyasını ...

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annual Review of Neuroscience. 22, 389-442 (1999).</li><li>Darabid, H., Perez-Gonzalez, A. P., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+synaptogenesis:+coordinating+partners+with+multiple+functions.">Neuromuscular synaptogenesis: coordinating partners with multiple functions.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (11), 703-718 (2014).</li><li>Fatt, P., Katz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+end-plate+potential+recorded+with+an+intracellular+electrode.">An analysis of the end-plate potential recorded with an intracellular electrode.</a> Journal of Physiology. 115 (3), 320-370 (1951).</li><li>Todd, K. J., Robitaille, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+modulation+of+synaptic+signalling+at+the+neuromuscular+junction.">Purinergic modulation of synaptic signalling at the neuromuscular junction.</a> Pflugers Archive. 452 (5), 608-614 (2006).</li><li>Hennig, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Genetically+Encoded+Calcium+Indicators+(GECIs)+Combined+with+Advanced+Motion+Tracking+Techniques+to+Examine+the+Behavior+of+Neurons+and+Glia+in+the+Enteric+Nervous+System+of+the+Intact+Murine+Colon.">Use of Genetically Encoded Calcium Indicators (GECIs) Combined with Advanced Motion Tracking Techniques to Examine the Behavior of Neurons and Glia in the Enteric Nervous System of the Intact Murine Colon.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 9, 436 (2015).</li><li>Heredia, D. J., Schubert, D., Maligireddy, S., Hennig, G. W., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Striated+Muscle-Specific+Myosin-Blocking+Drug+for+the+Study+of+Neuromuscular+Physiology.">A Novel Striated Muscle-Specific Myosin-Blocking Drug for the Study of Neuromuscular Physiology.</a> Frontiers of Cellular Neuroscience. 10, 276 (2016).</li><li>Johnson, B. R., Hauptman, S. A., Bonow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+simple+suction+electrode+for+extracellular+recording+and+stimulation.">Construction of a simple suction electrode for extracellular recording and stimulation.</a> Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 6 (1), A21-A26 (2007).</li><li>Hong, S. J., Chang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+geographutoxin+II+(mu-conotoxin)+for+the+study+of+neuromuscular+transmission+in+mouse.">Use of geographutoxin II (mu-conotoxin) for the study of neuromuscular transmission in mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 97 (3), 934-940 (1989).</li><li>Heredia, D. J., Feng, C. Y., Hennig, G. W., Renden, R. B., Gould, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-induced+Ca2++signaling+in+perisynaptic+Schwann+cells+of+the+early+postnatal+mouse+is+mediated+by+P2Y1+receptors+and+regulates+muscle+fatigue.">Activity-induced Ca2+ signaling in perisynaptic Schwann cells of the early postnatal mouse is mediated by P2Y1 receptors and regulates muscle fatigue.</a> Elife. 7, e30839 (2018).</li><li>Cho, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+GCaMP-R+Family+of+Genetically+Encoded+Ratiometric+Calcium+Indicators.">The GCaMP-R Family of Genetically Encoded Ratiometric Calcium Indicators.</a> ACS Chemical Biology. 12 (4), 1066-1074 (2017).</li></ol>

Burada biz Ca2 + yanıt sağlam nöromüsküler doku GECI ifade fare kullanarak belirli hücrelerde ölçme bazı örnekler sağlar. Bu deneyler başarıyla gerçekleştirebilmek sırasında diseksiyon frenik sinir incitmek değil zorunludur. CA2 + Schwann hücreleri (Örneğin, 20 X veya 60 X) düşük veya yüksek güçte yanıtlarında görüntüye, ya BHC ya da µ-conotoxin blok hareket için kullanmak gereklidir. Düşük güç görüntüleme için tepkilerin Ca2 + kas hücr...

Gibi tüm sinapslarda, NMJ üç unsurdan oluşur: presynaptic bir terminal türetilmiş bir nöron, bir postsinaptik nöron/efektör hücre ve bir perisynaptic gliyal hücre1,2. Sinaptik iletimi temel yönlerini ilk bu synapse3' te gösterilen, birçok açıdan, bu işlemin kısmen nedeniyle bu synapse farklı hücresel elementlerin tarafından aynı moleküllerden ifadesi bilinmeyen kalır. Örneğin, omurgalı NMJ, motor nöronlar tarafından ortak yayımlanan, reseptörleri pürin adenin nükleotit ATP ve asetilkolin (ACh), kas, Schwann hücreleri ve motor nöronlar, böylece herhangi bir yorumu karmaşık hale getiren tarafından ifade edilir Bu maddeler (Örneğin, verici yayın veya Yanıt, kas kuvvet oluşturma)4tarafından sarf fonksiyonel etkisi. Basit, NMJ Üçlü bileşenleridir motor nöronlar, kas hücreleri veya Schwann hücreleri bizi canlı tutan göre değişir olup olmadığını Ayrıca, hangi sık sık birden çok sinaptik girdi, sergi, nöronlarda için merkezi sinir sistemi karşılaştırıldığında kendi içsel olarak heterojen (Örneğin, embriyonik türetme, fiber alt tür, morfoloji) belirsiz. Her biri bu sorunları gidermek için aynı anda bir sinaptik öğesi yanı sıra parça, aynı zamanda, böyle bir tepki'a ayrı diğer öğeler içinde birçok hücre yanıtı izlemek için avantajlı olur. Boya banyo uygulanan birden çok hücre tipleri tarafından doku uygulamaya sonra kaplıyor ve intracellularly yüklü boya sadece görselleştirmek için kullanılabilir çünkü geleneksel stratejileri kalsiyum sinyal ölçmek için kimyasal boyalar kullanarak bu iki gol elde edemez hücre bireysel ya da küçük tabur kadar. Burada, transgenik fareler turk ifade kullanan hücre özgü kalsiyum, belirli görüntüleme ve yazılım araçları5, ile birlikte biz bu iki genel hedefleri ilk göstermek ve tartışmak sinyal ölçmek için tasarlanmış nasıl yanı sıra yeni transgenik araçları ikinci elde yardımcı. Bu teknik kalsiyum dynamics veya diğer hücresel olaylar gözlemlenebilir aynı anda birden çok hücre popülasyonlarının gen kodlanmış optik sensörler aracılığıyla sinyal izlemek isteyen herkes için faydalı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Myf5-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#007893</td>
			<td>Drives muscle cell expression as early as E136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt1-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#003829</td>
			<td>Drives expression into all&#160; Schwann cells at E13 but not P209</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox10-Cre mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#025807</td>
			<td>Drives Schwann cell expression at older ages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP3 mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#029043</td>
			<td>Expresses GCaMP3 in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conditional GCaMP6f mice</td>
			<td>Jax</td>
			<td>#024105</td>
			<td>Expresses GCaMP6f in cell-specific fashion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)</td>
			<td>Hit2Lead</td>
			<td>#5102862</td>
			<td>Blocks skeletal muscle myosin but not neurotransmission6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF594-&#945;-BTX</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>#00007</td>
			<td>Labels acetylcholine receptor clusters at NMJ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-conotoxin GIIIb</td>
			<td>Peptides Int&#39;l</td>
			<td>#CONO20-01000</td>
			<td>Blocks Nav1.4 voltage-dependent sodium channel8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Dielectric Gel; aka Sylgard</td>
			<td>Ellswoth Adhesives</td>
			<td># Sil Dielec Gel .9KG&#160;</td>
			<td>Allows for the immobilization of the diaphragm by minutien pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins (0.1mm diameter)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>Immobilizes diaphragm onto silicone dielectric gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse FN1 upright microscope&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MBA74100</td>
			<td>Allows staging and observation of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Fixed Microscope Platform with Manual XY Microscope Translator&#160;</td>
			<td>Autom8</td>
			<td>MXMScr</td>
			<td>Allows movement of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual micromanipulator&#160;</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>M-152</td>
			<td>Holds recording and stimulating electrodes&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axoclamp 900A</td>
			<td>Allows sharp electrode intracellular electrophysiological recording</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode low-noise data acquisition system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Digidata 1550&#160;</td>
			<td>Allows electrophysiological data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode data analysis system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>PCLAMP 10 Standard</td>
			<td>Performs electrophysiological data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square wave stimulator</td>
			<td>Grass</td>
			<td>S48</td>
			<td>Stimulates nerve to excite muscle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolation Unit</td>
			<td>Grass</td>
			<td>PSIU6</td>
			<td>Reduces&#160; stimulation artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.0 mm outer diameter, 0.5mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>FG-GBF100-50-15</td>
			<td>Impales and records nerve-evoked muscle potentials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate filaments, 1.5 mm outer diameter, 1.17mm internal diameter&#160;</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>BF150-117-15</td>
			<td>Lengthened and used for suction electrode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97&#160;</td>
			<td>Pulls and prepares recording electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1200x1200 pixel, back-illuminated cMOS camera&#160;</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Prime 95b</td>
			<td>Sensitive camera that allows high-resolution, high-speed imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light Source</td>
			<td>Lumencor</td>
			<td>Spectra X</td>
			<td>Provides illumination from LEDs for fluorescence obsevation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Infinity-corrected fluorescent water immersion objectives, W.D. 2mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>CFI60</td>
			<td>Provide long working distances for visualization of specimen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp</td>
			<td>Sumita</td>
			<td>LS-DWL-N</td>
			<td>Provides illumination for brightfield observation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>W-View Gemini Image Splitter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>Projects 1 pair of dual wavelength images separated by a dichroic to single camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single-band Bandpass Filters&#160; (512/25-25 and 630/92-25)&#160;</td>
			<td>SemRock</td>
			<td>FF01-512/25-25; FF01-630/92-25</td>
			<td>Permits dual band imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>560 nm Single-Edge Dichroic Beamsplitter</td>
			<td>Sem Rock</td>
			<td>FF560-FDi01-25x36</td>
			<td>Dichroic mirror which separates beams of light to allow dual-wavelength imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data acquisition system</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS Elements - MQS31000</td>
			<td>Allows imaging data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wavelength control module</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41220</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emission splitter hardware module&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MQS41410</td>
			<td>Module for imaging data acqusiition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging data analysis system</td>
			<td>NA</td>
			<td>Volumetry 8D5, Fiji</td>
			<td>Allows analysis of fluorescence intensity and other imaging data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo imaging of cell-specific calcium signaling at the tripartite synapse of the mouse diaphragm

Doku hücreleri elektriksel aktivitesinin elektrofizyolojik teknikleri tarafından izlenebilir ama bunlar genellikle tek tek hücreler analiz için sınırlıdır. Hücre içi kalsiyum (Ca2 +) sitozol artış kez elektriksel aktivite nedeniyle oluşur veya sayısız diğer uyaranlara yanıt olarak, bu işlem tarafından izlenebilir sonra hücreleri görüntüleme florasan kalsiyum duyarlı ile yüklü boyalar.  Ancak, bu boyalar doku içinde tüm hücre tipleri tarafından alınır çünkü bu yanıtı tüm doku içinde bireysel bir hücreye görüntü zordur. Buna ek olarak, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (turk) bir tek hücre türüne göre ifade edilebilir ve böylece tüm nüfus içinde sinyal Ca2 + görüntüleme erişimine izin verme intrasellüler Ca2 +, artış yanıt olarak belli tek hücre türleri. Burada, biz turk GCaMP3/6 Kullanım fare nöromüsküler kavşak uygulamak, motor nöronlar, iskelet kası ve terminal/perisynaptic arasında üçlü bir synapse Schwann hücreleri. Biz bu teknik klasik ex vivo doku müstahzarları yarar göstermek. Bir optik bölücü kullanarak, biz çift dalga boyu görüntüleme dinamik Ca2 + sinyal ve nöromüsküler kavşak (NMJ) statik bir etiket iki hücre özgü GECI veya genetik olarak kodlanmış gerilim izlemek için kolayca adapte olabilir bir yaklaşım yerine Göstergeler (GEVI) aynı anda. Son olarak, biz floresan yoğunluğu uzamsal haritalar yakalamak için kullanılan yordamları tartışıyorlar. Birlikte, bu optik, transgenik ve analitik teknikler farklı hücre altgrupları çeşitli bağlamlarda NMJ, biyolojik aktivitesini incelemek için istihdam edilebilir.

Çeşitli değişikliklere örnek olarak artar olan intrasellüler Ca2 + NMJ türleri tanımlanmış hücre içinde tarafından aracılı floresan yoğunluğu, belgili tanımlık yarar bu yaklaşımın göster. Bu sonuçlar yanıt veren hücrelerin konumunu, hem de böylece kaç hücre yanıt ve ne kadar her hücre için belirli bir yanıt değerlendirilmesi için izin verdikleri yanıtlara yoğunluğunu sağlamak kayma floresan yoğunluğu haritalar olarak sunulur uyarıcı. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm at JoVE.com

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

The electrical activity of cells in tissues can be monitored by electrophysiological techniques, but these are usually limited to the analysis of ...

Bu yöntem nöromüsküler alanda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, sinir stimülasyonu yanıt olarak kas veya Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalrolü gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinir stimülasyonuna yanıt olarak belirli hücre tiplerinin aktivasyonunu görüntülenebilmektir. Başlamak için, transgenik fareler edinin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak genotipleyin.Ötenaziden sonra, karaciğerin hemen altında tüm hayvan boyunca ve sadece kalp ve akciğer üzerinde iridektomi makas ile enine bölüm. Karaciğeri, kalbi ve akciğerleri parçalar. Bir emme elektrot içine çekilecek kadar uzun frenik sinir uzunluğunu korumak için dikkatli olmak.Ayrıca diyafram çevresindeki ince sırt dışında, göğüs kafesi ve vertebral sütun kaldırın. Diyafram ve frenik sinir örneğini krebs-Ringer çözeltisi içeren bir mikrofuge tüpe yerleştirin ve floresan alfa bungarotoksin etiketli mililitre başına bir mikrogram alın. Numunenin karanlıkta 10 dakika boyunca çözeltide kuluçkaya yatmasını bekleyin.Minutien pimleri kullanarak silikon dielektrik jel ile kaplı ve oksijenli Krebs-Ringer çözeltisi yaklaşık sekiz mililitre ile dolu altı santimetre çanak üzerine sabitleyerek diyafram immobilize. Yemeği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra diyaframı dakikada sekiz mililitrede 30 dakika boyunca daha fazla Krebs-Ringer çözeltisi ile perfitlendirin.Dört kat büyütme, bir mikromanipülatör kullanarak, sol frenik sinir üzerinde emme elektrot hareket ettirin. Emme elektrot bağlı boru bağlı beş mililitrelik şırınga varil çekerek emme uygulayın. Diyaframın brightfield aydınlatmaile görsel olarak inceleyerek hertz stimülasyonuna yanıt olarak kasılmasını sağlayın.Aksi takdirde, kas kasılmasının görsel incelemesi ile doğrulanabilecek bir supramaximal darbe elde etmek için voltaj dizini kademeli olarak çevirerek voltajı ayarlayın. Hala görünmüyorsa, şırınga ile sinir dışarı darbe ve emme uygulayarak tekrar çizmek için deneyin. Şimdi, kas spesifik miyozin inhibitörü BHC veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti mu-conotoxin eklemek için perfüzyon kapatın.Krebs-Ringer çözeltisinin bir mililitresinde DMSO'da 200 milimolar stok BHC'nin dört mikrolitresini pipetleyerek BHC ön seyreltmesini hazırlayın. Bir mililitre Krebs-Ringer çözeltisini yemekten çıkarın. Sonra çanak önceden seyreltilmiş BHC ekleyin.30 dakika sonra, taze Krebs-Ringer çözeltisinin perfüzyonunu 20 ila 30 dakika daha açın. Eldiven giyen, bir milimetre dış çapı ve bir micropipeette puller içine 0,4 milimetre iç çapı ile bir borosilikat filamented cam yerleştirerek kayıt elektrot hazırlamak. Tuşları sıkın ve onu konuma sıkıştırın ve çekmece kapağını kapatın.Daha sonra çekmeceyi metin protokolünde açıklandığı şekilde programlayın. Embriyonik diyaframlar için amplifikatörün yazılım kontrollerini kullanarak direnci ölçün. Direnci n60 megaohms ve eski diyaframlar için, 10-20 megaohms yakın olduğundan emin olun.Şimdi, kayıt elektrotuna üç azı potasyum klorür yükleyin. 10 kez büyütme, uyarıcı bir elektrot olarak sahnenin karşı tarafında ikinci bir mikromanipülatör kullanarak kas içine elektrot indirin. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımını kullanarak istirahat membranı potansiyel sıfırdan eksi 65 milivolt veya altında değişene kadar bekleyin.Bir hertz teşvik ve mütevazı bir overshoot sergileyen büyük bir potansiyel için kontrol ederek bir kas eylem potansiyelinin varlığını doğrulamak. Uyarım artifakı ile eylem potansiyelini karıştırmayın. 20 kez büyütme yeşil sarı ışık uyarma altında floresan alfa bungarotoksin nöromüsküler kavşaklar etiketlenmiş arayarak kas merkezinde son plaka bandı bulmak.Kas, motor nöron veya Schwann hücrelerinde görüntü kalsiyum yanıtları için mavi ışık uyarma geçin. Bu örnekte GCaMP üç kas hücrelerinde ifade edilir. İstenirse, çift dalga boyu görüntüleme için bant geçiş filtreleri ve dikroik tek kenar filtresi ile görüntü ayırıcısını ayarlayın.Potasyum klorüre yanıt vermeden dokuyu 20 kat büyütme de doygunluğu ifade eden genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin %110 seviyesine ayarlanan arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğu ile deneyler yapın. Hızlı etkinlikleri kaçırmamak için saniyede 20 kare lik kayıt kaydedin. Bir emme elektrot kullanarak impulsların bir tren teslim ederek sinir stimülasyonu 20 ila 40 hertz bir ila 45 saniye ile teşvik ve statik floresan alfa bungarotoxin nöromüsküler kavşak sinyali etiketli ile birlikte bir hücre alt türünde dinamik floresan kalsiyum yanıtları toplamak.Farmakolojik agonistler de banyo uygulaması veya perfüzyon ile eklenebilir ve dinamik floresan kalsiyum yanıtları aynı şekilde toplanabilir. İstenilen sonuçlar elde edildiği için görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler tamamlandığında, perfüzyon hatları na su geçirin ve tuzların birikmemesi için emme elektrotu ile suyu 2-3 kez emerek emerek. Doğum sonrası yedinci doğum gününde Wnt bir GCaMP üç fare diyafram frenik sinir stimülasyonu Schwann hücre kalsiyum yanıtları bir mekansal harita nöromüsküler kavşakta terminal parasinaptik Schwann hücreleri için bir kısıtlama göstermektedir.Aynı diyafram floresan alfa bungarotoksin etiketli sonra görüntülendi, hangi bağlar nöromüsküler kavşak asetilkolin reseptörlerini etkinleştirmek için. Aynı diyafram da Brightfield aydınlatma altında nöromüsküler kavşak tarafından kas post-sinaptik bölgeye bir kayıt elektrot rehberlik etmek için görüntülendi. Burada gösterilen renk kodlu hücrelerin mekansal çizim veya bireysel kalsiyum geçici analizi için alınan ilgi bölgeleri.Bir mth kas hücresi kalsiyum yanıtları mekansal harita 5 GCaMP p dört de möyürin inhibitörü BHC varlığında frenik sinir stimülasyonu için tüm diyafram kas hücrelerinin tüm bölgede bir yanıt gösterir. Buna karşılık, mu-conotoxin varlığında aynı diyafram stimülasyonu asetilkolin reseptör kümesi zenginleştirilmiş uç plaka bandına karşılık gelen tüm diyafram kas hücrelerinin medial bölgede mekansal olarak sınırlı kalsiyum yanıtı neden olur. Bu işlemin ardından immüno-histokimya veya immünoblotlama gibi ek sorulara cevap vermek için başka yöntemler de yapılabilir, elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme ile tanımlanan hücrelerin moleküler profili nedir?Bu yöntem, schwann hücrelerinin ve kas hücrelerinin normal neonatal farelerde sinir stimülasyonuna popülasyon yanıtları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca yaşlı farelerin çalışmasına veya nöromüsküler hastalık ilişkili proteinleri ifade farelerin çalışma için uygulanabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Vivo Imaging of Cell-specific Calcium Signaling at the Tripartite Synapse of the Mouse Diaphragm

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging of Mouse Geniculate Ganglion Neuron Responses to Taste Stimuli

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Within the last ten years, advances in genetically encoded calcium indicators (GECIs) have promoted a revolution in in vivo functional imaging. Using ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

Two-Photon and Wide-Field Calcium Imaging in the Superior Colliculus

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

Unveiling Neural Coding and Mechanisms of Visual Processing in the Superior Colliculus (Video) | JoVE

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Mouse Retina OCT Fibergram Alignment with Confocal Images

Alignment of Visible-Light Optical Coherence Tomography Fibergrams with Confocal Images of the Same Mouse Retina

Advancements in In Vivo and Ex Vivo Retinal Imaging for Improved Glaucoma Diagnosis and Treatment (Video) | JoVE

Görünür Işık Optik Koherens Tomografi Fibergramlarının Aynı Fare Retinasının Konfokal Görüntüleri ile Hizalanması

In recent years, in vivo retinal imaging, which provides non-invasive, real-time, and longitudinal information about biological systems and processes, has ...

Evaluating Calcium Activity in Retinal Ganglion Cells Layer

Calcium Imaging In Electrically Stimulated Flat-Mounted Retinas

An Innovative Approach to Neural Electrical Stimulation Using Calcium Imaging (Video) | JoVE

Elektrikle Uyarılan Düz Monte Retinalarda Kalsiyum Görüntüleme

Retinal dystrophies are a leading cause of blindness worldwide. Extensive efforts are underway to develop advanced retinal prostheses that can bypass the ...

Monitoring Epileptiform Events in Drosophila via Calcium Imaging

Ex Vivo Calcium Imaging for Drosophila Model of Epilepsy

Insights into the Techniques and Findings of Recent Advancements in Epilepsy Research (Video) | JoVE

Ex Vivo (Canlı Canlı) Drosophila Epilepsi Modeli için Kalsiyum Görüntüleme

Epilepsy is a neurological disorder characterized by recurrent seizures, partially correlated with genetic origin, affecting over 70 million individuals ...