Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

نقر الدكتور جيسي كوك (جامعة ولاية أوهايو) يرجى السماح لنا باستخدام برنامجه الكشف عن وضع متعددة لبعض التجارب الأولية. البحث عنها في هذه المقالة أيده بالمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية من "المعاهد الوطنية للصحة" تحت رقم جائزة RO1AI107250 إلى سيبو ستيفاني. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية "المعاهد الوطنية للصحة".

1-إعداد
<ol><li>طلاء الخلية ملاحظة: الإنسان الخلايا الظهارية عنق الرحم، هيلا وهيلا معربا عن هيستون 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل)، واستخدمت في هذا البروتوكول، ولكن هذا الفحص يمكن تكييفها ل خلايا الثدييات الأخرى19.<ol>
<li>فصل الخلايا ملتصقة من 75 سم2 خلية ثقافة قارورة غسل...

هذا التحليل تدابير كفاءة الغشاء إعادة ختم على مستوى السكان الخلية مع القدرات الإنتاجية العالية. ويمكن استخدامه للكشف عن المكونات الخلوية أو مكتبات المخدرات التي يمكن أن تؤثر على تصليح غشاء. استخدمت مقايسة وصف شكل لوحة 96-جيدا، ولكن فإنه يمكن تكييفها مع لوحات 384-جيدا لأعلى من الناتج. ميزة له...

وتخضع خلايا الثدييات الإجهاد الميكانيكي وناضح والبيوكيميائية، أدى إلى فقدان سلامة غشاء البلازما. دون إعادة ختم سريعة وفعالة، أن تستسلم الخلايا التالفة بسرعة حتى الموت المبرمجة أو نخرية. منذ الستينات، وكان الدافع وراء الجهود الرامية إلى فهم غشاء البلازما إعادة ختم عملية بالعواقب المدمرة المرتبطة الخلل. في الواقع، قد تم ربط إصلاح غشاء البلازما ناقصة بسبب الطفرات في dysferlin ترميز الجينات، وإنتاج متقدمة glycation المنتجات النهائية، والعيوب في أمراض مثل ضمور العضلات أطرافهم-حزام، والسكري، ومتلازمة Higashi شيدياك منظم CHS1، على التوالي1،2،،من34،،من56الليزوزومية من الاتجار بالبشر. ومع ذلك، حتى الآن، أن فهمنا للغشاء إعادة ختم هو ما زالت محدودة7. وقد أثبتت الدراسات الأولية أن إعادة ختم الغشاء يتم تهيئتها بواسطة تدفق خارج الخلية Ca2 + من خلال غشاء البلازما التالفة8،،من910. ومنذ ذلك الحين، عدة غير التبادلية Ca2 +-تعتمد آليات قد اقترحت إعادة ختم الخلايا. وتقترح فرضية التصحيح أن حويصلات داخل الخلايا بالقرب من الجرح، تلتحم مع بعضها البعض وغشاء البلازما التالفة بمثابة تصحيح11،12،،من1314. نموذج ثاني يقترح أن الرقابة تعتمد على الكالسيوم من lysosomes في الجرح إصدارات موقع سفينجوميليناسي حمض الإنزيمات الليزوزومية، الذي يحول سفينجوميلين إلى السيراميد في النشرة الخارجي من غشاء البلازما. يؤدي هذا التغيير المفاجئ في تكوين الدهن يحركها السيراميد الالتقام المنطقة التالفة15،،من1617. وأخيراً، تنطوي الآلية المقترحة ثالث دور اندوسومال الفرز المعقدة اللازمة للنقل (اسكرت) لتشجيع تشكيل حويصلات المواجه للخارج أن برعم قبالة من غشاء البلازما18. حدد فقط مجموعة محدودة من البروتينات في هذه النماذج، ويجب كذلك توضيح آلياتها.
هنا يصف لنا مقايسة الفائق الذي توسط التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات ملتصقة تعرض للتلف المؤتلف ليستيريوليسين س (LLO)19. LLO السم تشكيل المسام (بفت) يفرزها الممرض داخل الخلايا اختياري الليستريه المستوحدة20،،من2122 وينتمي إلى مكف/مركز السيطرة على الأمراض (مجمع الهجوم غشاء، بيرفورين، و فوق عائلة سيتوليسين تعتمد على نسبة الكولسترول في الدم). ماكبف تشكيل المسام الثدييات التي تنتجها البروتينات المشاركة في الدفاعات المناعية، بينما المؤلفان السموم البكتيرية أساسا إيجابية العوامل الممرضة التي تضر بالخلايا المضيفة النهوض أنماط الحياة الممرضة23. يتم توليف المؤلفان مونومرات للذوبان في الماء أو dimers التي تربط الكولسترول الموجودة في غشاء البلازما، وأوليجوميريزي إلى مجمع بربري من وحدات فرعية تصل إلى 50. ثم يعيد ترتيب بربري المعقدة لإدراج β-خيوط عبر بلير الدهن، تشكيل مسام بيتا للبرميل الذي يمتد 30-50 نانومتر في قطرها24،25،،من2627.  هذه المسام كبيرة تسمح بتدفق الأيونات والمكونات الخلوية الصغيرة داخل وخارج الخلية؛ رغم ذلك، وقد اقترحت بعض الدراسات أن مسام أصغر حجماً هي أيضا شكلت28،،من2930. بين المؤلفان، يعرض LLO خصائص فريدة من نوعها، بما في ذلك التجميع تعتمد درجة الحموضة ودرجة الحرارة لا رجعة فيه، مما يفضي إلى تحليلات الفائق31،32. يمكن إضافة LLO إلى مستنبت الخلية في 4 ˚C، درجة حرارة متساهلة إلى ملزمة لها للخلايا، ولكن ليس إلى تشكيل المسام المعقدة. ثم يمكن أن تكون متزامنة الشروع في تشكيل المسام برفع درجة الحرارة إلى 37 ˚C، مما يسمح لنشر فعالة من الجزيئات السمية في طائرة الغشاء بشكل ليغومرات ويعيد البناء كونفورماشونال المشاركة في توليد المسام. ولذلك، يلي رمز التبديل في درجة الحرارة، والحركية لتلف الخلايا يعتمد على مقدار السمية منضمة إلى غشاء البلازما. الأهم من ذلك، LLO القابلة للذوبان (ليست ملزمة بغشاء البلازما) بسرعة وبلا رجعة المجاميع عند درجة حرارة تصل إلى 37 ˚C، مما يخفف من الحاجة إلى يغسل الجزيئات السمية غير منضم ويحد من مدى الضرر الغشاء على مر الزمن. وأخيراً، لأن LLO تربط بين الكوليسترول وأشكال المسام في الأغشية الغنية بالكولسترول، هذا التحليل قابلة لمجموعة واسعة من خلايا الثدييات. من المهم أن نضع في اعتبارنا أن LLO يؤثر على الخلية المضيفة إشارات أساسا عن طريق تشكيل المسام، مع استثناءات قليلة في خلية مستقلة عن المسامية التي قد تحدث مما يشير إلى33،34،35،36 ،37،،من3839. ولذلك، فإنه لا يمكن استبعاد أن LLO مما يشير إلى أنشطة قد تؤثر على عملية إصلاح غشاء.
ويقيم هذا التحليل مباشرة مدى إصابة الخلية بقياس إدماج خلية إيمبيرمينت fluorochrome (مثلاً، يوديد propidium) الذي يدخل الخلايا الجرحى سلبية ويصبح الفلورية العالية بمجرد أنه يربط مع الأحماض النووية . ومن ثم، يمكن الحفاظ على فلوروتشرومي في مستنبت الخلية طوال هذه التجربة، السماح للتحليلات في الوقت الحقيقي للخلية مما أسفر عن إصابة. كثافة fluorescence صبغ الحمض النووي الملزمة سوف تزيد مع تركيز السمية، لتركيز معين من السمية، سوف تزيد مع مرور الوقت حتى تتشكل جميع المسام، وهي إصلاح الخلايا تماما أو حتى يتم التوصل إلى التشبع. تدفق خارج الخلية Ca2 + من خلال مسام الغشاء حدث شرط أساسي لإعادة ختم. ولذلك، يمكن أن يدل كفاءة ريسيلينج غير مباشر بمقارنة إصابة خلية في المتوسط الثقافة التي تحتوي على Ca2 + (حالة الإصلاح الدلالية) لإصابة في Ca2 +-المتوسطة الحرة (إصلاح الشرط التقييدي). نظراً لكثافة fluorescence صبغ الحمض النووي ملزم طرديا مع تركيز خلية في كل بئر، من المهم أن خلايا البذور في تركيز نفسها في جميع الآبار. من المهم أيضا أن تعداد الخلايا في كل بئر قبل وبعد الفحص لضمان أن الخلية المفرزة لم تحدث، كعائم، الخلايا المجمعة يمكن أن تحجب fluorescence القراءات التي قد تؤدي إلى تعقيد تفسير البيانات. تعداد الخلايا، والخلايا معربا عن هيستون النووية مترجمة 2B-التجارة والنقل (H2B-التجارة والنقل) استخدمت في هذا التحليل. التحكم في درجة الحرارة، وضع متعددة، والقراء الميكروسكوبية الجمع بين القياسات السريعة، الفائق (باستخدام تنسيق لوحة 96 أو 384-جيدا) من شدة الأسفار مع التصوير المجهري للخلايا الحية في 37 درجة مئوية. يمكن استخدام هذا الأخير لعد عدد الخلايا ومراقبة تشكيل خلية متميزة السكان في نهاية المطاف.
في نهاية المطاف، هذا الفحص يوفر للمستخدمين القدرة على توسيع معرفتهم بتعقيد آليات إصلاح الغشاء بالكشف عن الجزيئات المضيف أو إصلاح المركبات مناشئ المضافة التي يمكن التحكم في الغشاء. البروتوكول التالية توضح الخطوات التجريبية لقياس كفاءة الخلايا المعرضة ل LLO ريسيلينج وتقييم آثار المخدرات معين أو العلاج الخلوي في كفاءة إعادة ختم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

في بيئتهم الفسيولوجية، كثيرا ما تتعرض خلايا الثدييات الإجهادات الميكانيكية والكيميائية الحيوية التي تؤدي إلى تلف غشاء البلازما. واستجابة لهذه الأضرار، ختم الأجهزة الجزيئية المعقدة سرعة غشاء البلازما لاستعادة وظيفتها الحاجز والمحافظة على بقاء الخلية. 60 عاماً بحوث في هذا الميدان، وعلى الرغم من أننا لا تزال تفتقر إلى فهم شامل للخلية إعادة ختم الجهاز. أن عنصر التحكم إعادة ختم غشاء البلازما أو الأدوية التي يمكن تحسين إعادة ختم، وقد وضعنا الفائق تحليل القائم على الأسفار أن التدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات بهدف تحديد المكونات الخلوية مثقف في ميكروبلاتيس. كنظام نموذجي للضرر غشاء البلازما، تتعرض الخلايا إلى ليستيريوليسين السم البكتيري تشكيل المسام س (LLO)، الذي يشكل كبير 30-50 نانومتر القطر البروتينية المسام في المحتوية على نسبة الكولسترول في الدم الأغشية. يسمح استخدام قارئ الميكروسكوبية المتعدد وضع التحكم في درجة الحرارة لقياسات سبيكتروفلوروميتريك السريع والحساسة في تركيبة مع برايتفيلد والأسفار التصوير المجهري للخلايا الحية. التحليل الحركي لشدة الأسفار المنبعثة من فلوروتشرومي الحمض النووي ملزم إيمبيرمينت غشاء يعكس مدى الغشاء مما أدى إلى إصابة وإعادة ختم على مستوى السكان الخلية، مما يتيح لحساب الخلية إعادة ختم الكفاءة . تصوير مجهرية fluorescence يسمح لتعداد الخلايا، تعبر عن حلما فلورسنت من 2B هيستون البروتين النووي، في كل بئر الميكروسكوبية لمراعاة الاختلافات المحتملة في العدد من مؤثرا ويسمح في نهاية المطاف تحديد هوية السكان خلية متميزة. هذا التحليل الفائق هو أداة قوية يتوقع توسيع فهمنا لآليات إصلاح الغشاء عن طريق فحص الجينات المضيف أو مناشئ إضافة المركبات التي تحكم غشاء البلازما إعادة ختم.

خلية عد الدقة: خلايا هيلا كثيرا ما تستخدم كخط خلية الثديية نموذجي لاستكشاف آليات إصلاح الغشاء. عند تقييم إصلاح الغشاء على مستوى السكان الخلية، من المهم أن خلايا لوحة في تركيز نفسها في جميع الآبار لتفسير البيانات المناسبة. من المهم أيضا التحقق من وقت الفحص أن أرقام الخلية ...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

هنا يصف لنا تحليل القائم على الأسفار الفائق تدابير غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة من خلال تحليلات فلوروميتريك والتصوير في الخلايا الحية. يمكن استخدام هذا الفحص لفحص المخدرات أو الجينات المستهدفة التي تنظم إعادة ختم غشاء البلازما في خلايا الثدييات.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

وقد تم تطوير هذا الفحص لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا غشاء البلازما وتحديد مدى كفاءة الخلايا التالفة يمكن إعادة الغشاء البلازما الخاصة بهم. ويمكن استخدام هذه التقنية لقياس كفاءة إعادة الغشاء البلازما في قدرة عالية الإنتاجية وتحديد بروتينات محددة والمسارات المقابلة التي تتوسط إعادة الغشاء البلازما. تبدأ بإضافة 20 ملليلتر من 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة هيلا لكل ملليلتر من تعليق متوسط النمو في حوض ماص معقمة واستخدام ماصة المصلية 10 ملليلتر لخلط الخلايا جيدا.المقبل, استخدام micropipette متعددة القنوات لذر البذور 100 ميكرولتردات من الخلايا في كل بئر في ثلاثية في 96-well شقة, قاع واضح, أسود البوليسترين الأنسجة ثقافة المعالجة لوحة. تذكر أن توزيع الخلايا المتجانسة هو المفتاح لتجربة ناجحة حيث أن المقارنات بين جميع الشروط التجريبية تتطلب عدد خلايا مكافئ. بعد 24 ساعة في حاضنة ثقافة الخلايا المرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، أحذر قارئ اللوحة إلى 37 درجة مئوية وتعيين التكوين البصري إلى monochromator ، وضع القراءة إلى الفلوريسانس ، ونوع القراءة إلى الحركية.تحت إعدادات الطول الموجي، حدد 9 نانمتر الإثارة و15 نانومتر الانبعاثات bandpass. بالنسبة للمجايسات باستخدام يوديد البروديم، حدد الإثارة والأطوال الموجية للانبعاثات إلى 535 نانومتر و617 نانومتر، على التوالي. تحت نوع اللوحة، حدد 96-آبار لتنسيق اللوحة، وحدد تكوين لوحة مسبقة الضبط المطابق للوحة أسفل الجدار الأسود واضحة.تحت منطقة القراءة، وتسليط الضوء على الآبار التي سيتم تحليلها في جميع أنحاء مقايسة الحركية. تحت PMT والبصريات، مسبقا ومضات لكل قراءة إلى ستة وتحديد مربع للقراءة من أسفل. ضمن التوقيت، أدخل صفر ساعة 30 دقيقة و ثواني صفر في إجمالي وقت التشغيل لمقتها 30 دقيقة الحركة وأدخل صفر ساعة خمس دقائق و ثواني صفر للفاصل الزمني.تأكيد الإعدادات المحددة في معلومات الإعدادات ثم انقر فوق موافق. ثم انقر فوق قراءة لبدء تشغيل الحركية. لتعيين معلمات التصوير ضمن وضع الإعدادات، قم بتعيين MiniMax للتكوين البصري، والتصوير لوضع القراءة، ونقطة النهاية لنوع القراءة. تحت الأطوال الموجية، حدد الضوء المرسل ومربعات الفلورس المناسبة المقابلة للإثارة التجريبية وأطوال الموجة للانبعاثات.تعيين نوع لوحة ومنطقة القراءة كما أظهرت للتو وتحت إعداد منطقة البئر، تعيين عدد المواقع داخل بئر ليكون صورة. ضمن إعدادات الحصول على الصور لـ GFP، قم بتعيين الجهاز على صورة البئر بالكامل مع وقت تعرض يبلغ 20 مللي ثانية لكل صورة. بالنسبة للضوء المنقول، احصل على صورة واحدة لمركز كل بئر مع وقت تعرض ثمانية ميلي ثانية.بالنسبة للإيودينيوم، احصل على صورة واحدة في مركز كل بئر مع وقت التعرض 20 مللي ثانية. ثم قم بتأكيد الإعدادات في معلومات الإعدادات وانقر فوق موافق وقراءة لبدء التصوير. لإعداد مقياس مُنَتَسِر على فلورية عالي الإنتاجية للظروف المتساهلة للإصلاح، اغسل الخلايا مرتين بـ 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M1 متوسطة لكل بئر وإضافة 100 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M1 متوسطة طازجة مكمّلة بـ 30 يوديد بروفيديوم ميكرومولر بعد التخلص من الغسيل الثاني.لإصلاح الظروف التقييدية، وغسل الخلايا مرة واحدة مع 200 ميكرولترات من 37 درجة مئوية M2 المتوسطة تكملها خمسة مللي EGTA في بئر تليها غسل واحد مع 200 ميكرولترات من M2 المتوسطة وحدها. بعد التخلص من الغسيل الثاني، إضافة 100 ميكرولترات من 37 درجة مئوية جديدة M2 المتوسطة تكملها 30 يوديد برودييوم ميكرومولار في بئر. ثم صورة لوحة تحت الضوء المنقولة، GFP، وPI كما أظهرت للتو.في حين يجري تصوير لوحة، وضع 96 جولة جيدا أسفل البولي بروبلين microplate على الجليد وتكوين لوحة كما أظهرت للتو ل لوحة السابقة. لإصلاح شروط متساهلة، إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M1 المتوسطة تكملها 60 يوديد برودييوم ميكرومولار في بئر تليها إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M1 مع أو بدون 4X listeriolysin O في البئر. لإصلاح الظروف التقييدية، إضافة 100 microliters من الجليد الباردة M2 المتوسطة تكملها 60 ميكرومولار برودييوم يوديد في بئر تليها إضافة 100 ميكرولترات من الجليد البارد M2 مع أو بدون 4X listeriolysin O في البئر.ويتحتم إعداد قائمة القوائم في التركيز التجريبي المناسب على الجليد قبل خمس دقائق تقريبا من بدء الفحص الحركي عندما تكون اللوحة الأولى على الجليد ويجري إعداد اللوحة الثانية. عند الانتهاء من اللوحة الأولى التصوير، على الفور نقل لوحة على ورقة من رقائق الألومنيوم على الجليد. بعد خمس دقائق، نقل 100 ميكرولترات من كل بئر من لوحة الثانية إلى بئر المقابلة المناسبة في لوحة تبريد الأولى، وإدراج نصائح ماصة تحت الغضروف المفصلي من الحل في كل بئر قبل إخراج وحدة التخزين دون خلط للتوزيع السليم للسموم.السماح للسم لربط الخلايا المضيفة لمدة دقيقة واحدة ونقل على الفور لوحة الأولى إلى قارئ لوحة للم مقايسة ما بعد الحركية باستخدام وضع مقياس الطيف. في نهاية الفحص الحركي، الحصول على الفور تصوير ما بعد الحركية من لوحة الصورة كما هو موضح للتصوير قبل الحركية. لتحديد عدد الخلايا استناداً إلى الفلورسين النووية، في برنامج تعداد الخلايا المصغرة تحت الإعدادات، حدد إعادة التحليل، وفي إعدادات تحليل الصور، حدد تحليل كائن منفصل باستخدام 541 كطول موجي للعثور على الكائنات.ضمن الخيار العثور على الكائنات، استخدم الرسم على طريقة العثور على الصور، حدد نوى، وانقر فوق تطبيق، ثم انقر فوق موافق وقراءة لبدء خوارزمية عد الخلايا. لا يتداخل تعبير GFP مع قياسات كثافة يوديدات البروديم في وجود أو عدم وجود علاج القوائم الطبية O. التعبير عن يوديد بروبديسيوم يمكن أن تنزف من خلال الفلوراسة GFP كما يتضح من زيادة في كثافة الفلورية GFP في خلايا H2B-GFP في تحليل التصوير بعد الحركة مقارنة مع التحليل قبل الحركية.ولكن الأهم من ذلك، لا يؤثر هذا الانتقال على عد الخلايا، حيث أن عملية التجزئة التي تشارك في تعداد النوى لا تتأثر بزيادة في الفلورسيات GFP. في غياب الليسيريوليسين O، سلامة غشاء البلازما لا تزال ثابتة في وجود أو عدم وجود الكالسيوم خارج الخلية، في حين أن علاج ليستيريوليسين O في وجود الكالسيوم تكمل نتائج متوسطة في زيادة مطردة في كثافة الفلور البروديويد. في غياب الكالسيوم خارج الخلية ومع ذلك، هناك زيادة أكثر حدة بشكل ملحوظ في الفلوري اديوميد بروبديوم، مما يعكس عدم وجود إعادة الغشاء.بدلا من ذلك، يمكن استبدال صبغة ربط حمض الكربوسيانين النووي مع الفلوريس في الأحمر البعيد من يوديد البرودينيوم لتقليل التداخل الطيفي مع GFP. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معامل الإثارة الأكبر للصبغة الحمراء البعيدة يعرض إشارة أعلى إلى نسبة الضوضاء ودقة أفضل بين الشروط التقييدية للإصلاح والإصلاح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، يوصى بتسمية جميع الأنابيب قبل يوم واحد من التجربة ، لأن هذا سيعدك لجميع إعداد الكاشف في يوم التجربة.بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل التصوير للخلايا للإجابة على أسئلة إضافية، مثل هل المسام تشكيل السموم تلف جميع الخلايا بشكل موحد أو بعض الخلايا أكثر عرضة من غيرها. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات الأمراض المعدية وإصلاح غشاء البلازما لاستكشاف آثار حجم المسام على كفاءة إصلاح أنواع الخلايا المختلفة.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

الفحص في المختبر من الالتصاق الجرثومي على الخلايا الظهارية الثدييات

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

قياس نشاط V عامل في البلازما البشرية باستخدام الفحص التخثر صفيحة ميكروسكوبية

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

عالية الإنتاجية قياس خارج الخلية DNA الإصدار والكمي NET تشكيل في العدلات الإنسان<em&gt; في المختبر</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في<em&gt; البروسيلا</em&gt; إصابة خلايا هيلا

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

موثوقة وعالية استخراج كفاءة الكلى الخلايا المناعية

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

تنفيذ نظام العدوى أساس إدراج-نافذ غشاء لدراسة آثار يفرز البكتيرية السموم على خلايا المضيف الثدييات

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...