Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我们感谢 jesse kwiek 博士 (俄亥俄州立大学) 善意地允许我们使用他的多模式检测平台进行一些初步实验。本文报告的研究得到了国家卫生研究院国家过敏和传染病研究所的支持, 该研究所的编号为 ro1ai107250, 授予 stephanie seveau。内容完全由作者负责, 不一定代表国家卫生研究院的官方观点。

1. 准备工作
<ol><li>电池电镀 注: 本协议中使用了人宫颈上皮细胞、hela 和 hela 表达组蛋白 2b-gfp (h2b-gfp), 但该检测方法可适用于其他哺乳动物细胞19。<ol>
<li>用2毫升的胰蛋白酶-edta 0.25% 清洗细胞, 从75厘米2细胞培养瓶中分离粘附细胞。将使用过的胰蛋白酶替换为2毫升的新鲜胰蛋白酶 edta 0.25%。</li>
		<li>在37°c 下将细胞加氢 5分钟, 直到细胞圆形并与烧瓶分离。</li>
		<li>在...

该方法测量了具有高通量的细胞群体水平上的膜再密封效率。它可用于筛选可能影响膜修复的细胞成分或药物库。所述检测采用了96孔板格式, 但可适用于384孔板, 以获得更高的吞吐量。该方法的优点是能够实时获得粘附活细胞的荧光测量, 而无需进行过多的细胞处理, 如细胞分离、固定或荧光标记固定后。多模板读取器 (如本协议中使用的读取器) 具有足够的灵敏度, 可在96孔板的时间间隔低至30秒?...

哺乳动物细胞受到机械、渗透和生化胁迫, 导致细胞膜完整性的丧失。如果没有快速有效的重新密封, 受损的细胞很快就会死于有程序或坏死的死亡。自20世纪60年代以来, 了解质膜重密封过程的努力的动机是其功能障碍带来的破坏性后果。事实上, 像肢体腰带肌肉营养不良症、糖尿病和 chediak-higashi 综合征这样的疾病与由于基因编码异常的突变、先进的糖基化终产物的生产以及缺陷而导致的质膜修复不足有关。溶酶体贩运调节剂 chs1,分别为 1、2、3、4、5、6.然而, 到目前为止, 我们对膜重封的理解仍然有限。初步研究表明, 膜复位是由细胞外 ca2+通过受损的质膜 8,9,10的流入而引发的。自那时以来, 几个非相互排斥的 ca2 +依赖机制已被提出重新体细胞。贴片假说提出, 在接近伤口的细胞内囊泡融合在一起, 并将受损的质膜作为贴片 11,12,13,14。第二个模型提出, 钙依赖性的溶酶体在伤口部位的渗出释放溶酶酸 sphingomyelinase, 它将 sphingomyelin 转化为质膜外单中的神经酰胺。脂质组成的这种突然变化导致受损区域15、16、17的神经酰胺驱动的内吞。最后, 第三个拟议的机制涉及运输所需的子宫内膜分枝复合体 (escrt) 的作用, 以促进从质膜18中脱落的向外的囊泡的形成。在这些模型中只发现了一组有限的蛋白质, 必须进一步阐明它们的机制。
在这里, 我们描述了一种高通量的测定膜重组李斯特菌蛋白 o (l库)19介导的损伤的粘附哺乳动物细胞的膜重组效率。llo 是一种成孔毒素 (pft), 由细胞内的兼发性病原菌单核细胞增生李斯特菌 20、21、22分泌, 属于 macpf按 cdc (膜攻击复合体, 穿孔,胆固醇依赖性细胞分裂素) 超家族。macpf 是参与免疫防御的哺乳动物成孔蛋白, 而 cdc 是细菌毒素, 主要由革兰氏阳性病原体产生, 损害宿主细胞, 促进其致病性生活方式23。cdc 被合成为水溶性单体或二聚体, 结合质膜中的胆固醇, 并将寡聚结合成最多50个亚基的前孢子复合体。然后, 前孔复合物重新排列, 在脂质双层层上插入β链, 形成直径为 24、25、26、27的β桶孔。 这些大毛孔允许离子和小细胞成分进出细胞;不过, 一些研究提出, 较小尺寸的毛孔也会形成 28、2 9、3 0.在 cdc 中, llo 显示出独特的特性, 包括不可逆的 ph 和温度相关的聚合, 这有利于高吞吐量分析31,32。llo 可以在4°c 时添加到细胞培养培养基中, 温度允许其与细胞结合, 但不能添加到孔隙复合体的形成中。然后, 可以通过将温度提高到37°c 来同步孔隙形成的启动, 从而使毒素分子在膜平面上有效扩散, 形成低聚物, 并进行与孔隙生成有关的构象重塑。因此, 随着温度的变化, 细胞损伤的动力学将取决于与质膜结合的毒素量。重要的是, 当温度达到37°c 时, 可溶性 llo (不与质膜结合) 会迅速且不可逆转地聚集在一起, 从而缓解了冲洗未结合毒素分子的需要, 并随着时间的推移限制了膜的损伤程度。最后, 由于 llo 与胆固醇结合, 并在富含胆固醇的膜中形成毛孔, 这种检测方法适用于多种哺乳动物细胞。重要的是要记住, llo 主要通过孔隙形成影响宿主细胞信号, 除了少数例外, 在这些情况下, 与孔隙无关的细胞信号转导可能会发生33、34、35、36 ,37,38,39。因此, 不能排除 llo 信号活动可能会影响膜修复过程。
该检测方法通过测量被动进入损伤细胞并与核酸连接后成为高荧光细胞的小不含氟铬细胞 (例如碘化钠) 的含量, 直接评估细胞损伤的程度.因此, 在整个实验过程中, 荧光铬可以保存在细胞培养介质中, 从而能够实时分析细胞损伤。核酸结合染料的荧光强度会随着毒素的浓度而增加, 对于一定浓度的毒素, 随着时间的推移, 会随着时间的推移而增加, 直到所有毛孔形成, 细胞完全修复或达到饱和度。细胞外 ca2+通过膜孔的涌入是重新密封的必要条件。因此, 通过比较含有 ca2 + (修复允许条件) 的培养基中的细胞损伤与 ca2+ 无损伤 (修复限制性条件) 的损伤, 可以间接地证明细胞损伤的恢复效率。由于核酸结合染料的荧光强度与每口井的细胞浓度成正比, 因此所有油井中相同浓度的种子细胞都很重要。同样重要的是, 在检测前后的每口井中列举细胞, 以确保细胞分离不会发生, 因为漂浮的聚集细胞可能会掩盖荧光读数, 从而使数据解释复杂化。为了列举细胞, 本试验中使用了表达核局部组蛋白 2b-gfp (h2b-gfp) 的细胞。温度控制的多模微板读取器将荧光强度的快速、高吞吐量测量 (使用96或384个孔板格式) 与37°c 下活细胞的显微镜成像相结合。后者可用于列举细胞数量和观察不同细胞群的最终形成。
最终, 这种检测方法通过筛选宿主分子或可能控制膜修复的外源添加化合物, 为用户提供了扩大其对膜修复机制复杂性的了解的能力。下面的协议描述了测量暴露于 llo 的细胞的重密封效率的实验步骤, 并评估特定药物或细胞治疗对重密封效率的影响。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

在其生理环境中, 哺乳动物细胞经常受到机械和生化压力, 导致质膜损伤。为了应对这些损伤, 复杂的分子机械迅速重新密封质膜, 以恢复其屏障功能, 并保持细胞存活。尽管在这一领域进行了60年的研究, 但我们仍然缺乏对细胞重闭机械的透彻了解。为了识别控制质膜再密封的细胞成分或可以改善再密封的药物, 我们开发了一种基于荧光的高通量检测方法, 用于测量哺乳动物细胞中的质膜再密封效率在微板中培养。作为细胞膜损伤的模型系统, 细胞暴露在细菌形成毒素李斯特菌素 o (l低铁) 中, 在含胆固醇的膜中形成直径30-50 纳米的大型蛋白质孔。使用温度控制的多模微板读取器, 可以结合明亮场和荧光显微镜成像活细胞进行快速和灵敏的光谱测量。对膜不含核酸结合荧光铬发出的荧光强度进行动力学分析, 反映了细胞膜在细胞群体中的损伤和再密封程度, 从而可以计算细胞的保存效率.荧光显微镜成像允许细胞的计数, 这在宪法上表达了核蛋白组蛋白 2 b 的荧光嵌合体, 在微板的每口井, 以考虑其数量的潜在变化, 并允许最终识别不同的细胞群。这种高通量检测是一个强大的工具, 有望通过筛选宿主基因或控制质膜重新密封的外源添加化合物来扩大我们对膜修复机制的了解。

细胞计数的准确性: hela 细胞经常被用作哺乳动物细胞系的模型, 以探索膜修复机制。在评估细胞群体水平的膜修复时, 重要的是将所有油井中浓度相同的细胞进行平板, 以进行适当的数据解释。在检测时, 验证细胞数量在井间是否相等也很重要。本试验引入了本构表达组蛋白2b 融合到 gfp (h2b-gfp) 的平列细胞, 以便在检测其荧光核的基础上自动列举细胞。为了确定细胞计数的?...

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High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

在这里, 我们描述了一种高通量荧光检测, 通过在活细胞中的荧光和成像分析测量质膜的重接受效率。该检测方法可用于筛选调节哺乳动物细胞质膜重密封的药物或靶向基因。

哺乳动物细胞血浆膜检测效率的高通量测量

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

该检测是为了解决等离子膜生物学领域关键问题，并确定受损细胞如何有效地重新密封其等离子膜。该技术可用于测量高通量容量的等离子膜再密封效率，并确定调节等离子膜再密封的特定蛋白质和相应通路。首先将20毫升的2.5倍10添加到每毫升生长介质悬浮液的第五个 HeLa 细胞，加入无菌移液器盆，并使用 10 毫升血清移液器将细胞彻底混合。接下来，使用多通道微移子在96孔平坦、清澈、黑色聚苯乙烯组织培养的培养板中，每孔中播种100微升细胞。请记住，同质细胞分布是成功实验的关键，因为所有实验条件之间的比较都需要等效的细胞计数。在37摄氏度和5%CO2的加湿细胞培养箱中24小时后，将板读卡器预热至37摄氏度，将光学配置设置为单色器，读取模式设置为荧光，读取类型设置为动力学。在波长设置下，选择 9 纳米激励和 15 纳米发射带通。对于使用碘化丙二的测定，将激发和发射波长分别设置为 535 纳米和 617 纳米。在板类型下，为板格式选择 96 孔，并选择与黑壁透明底板对应的预设板配置。在读取区域下，突出显示将在整个动力学分析过程中进行分析的井。在 PMT 和光学下，将每读的闪烁预设为 6，然后选中从底部读取的框。在计时下，在 30 分钟动力学测定的总运行时间中输入零小时 30 分钟和 0 秒，并在间隔内输入零小时 5 分钟和 0 秒。在设置信息中确认指定的设置，然后单击"确定"。然后单击"读取"以启动动能运行。若要在设置模式下设置映像参数，请为光学配置设置 MiniMax，为读取模式设置映像，为读取类型设置端点。在波长下，选择与实验激发和发射波长对应的透射光和相应的荧光盒。将板类型和读取区域设置为刚刚演示的，并在井区设置下设置要成像的井中的站点数。在 GFP 的图像采集设置下，将设备设置为对整个井进行映像，每个图像的曝光时间为 20 毫秒。对于透光，获取每口井中心的单张图像，曝光时间为 8 毫秒。对于碘化铀，在每口井的中心获取一个图像，曝光时间为 20 毫秒。然后确认设置信息中的设置，然后单击"确定"并读取以启动映像。为为修复允许条件设置高通量荧光检测，每井用200微升37摄氏度M1介质洗两次，在丢弃第二次洗涤后加入100微升新鲜37摄氏度M1介质，并辅以30微摩尔碘化。对于维修限制条件，用200微升37摄氏度M2介质清洗细胞，每井补充5毫摩尔EGTA，然后用200微升的M2介质清洗。摒弃第二次洗涤后，加入100微升新鲜37摄氏度M2介质，每井补充30微摩尔碘化物。然后在透光、GFP 和 PI 下成像板，正如刚才所示。在对板进行成像时，将 96 孔圆形底部聚丙烯微孔板放在冰上，并配置板，就像前一个板所演示的一样。为修复允许条件，添加100微升的冰冷M1介质，每井补充60微摩尔丙化碘化物，然后添加100微升的冰冷M1，或没有4X李斯特利辛O每井。对于维修限制条件，添加100微升的冰冷M2介质，每井补充60微摩尔丙二碘化物，然后添加100微升的冰冷M2，或没有4X李斯特利辛O每井。当第一板在冰上，第二板正在准备时，在动力学测定开始前大约五分钟，在冰上以适当的实验浓度准备李斯特利辛O。当第一个板完成成像后，立即将板转移到冰上的铝箔上。五分钟后，将第二板每个孔的100微升转移到第一个冷却板中的相应井中，将移液器尖端插入每个孔溶液半月板下方，然后弹出体积，无需混合即可正确分配毒素。让毒素与宿主细胞结合一分钟，并立即使用光谱荧光计模式将第一个板转移到板读卡器进行后动力学测定。在动力学分析结束时，立即获得板图像的后动力学成像，如动力学前成像所示。要根据核荧光确定细胞计数，在微孔板细胞枚举软件的设置下，选择重新分析，并在图像分析设置中，使用 541 选择离散对象分析作为寻找对象的波长。在"查找对象"选项中，使用图像查找方法绘制，选择"核"，然后单击"应用"，然后单击"确定"并读取以启动单元格计数算法。GFP表达不干扰碘化钠强度测量在存在或不存在李斯特利辛O治疗。与动力学前分析相比，在动力学后成像测定中，HeLA H2B-GFP细胞中GGFP荧光强度增加，表明碘化丙二丙胺的表达可以通过GP荧光出血。然而，重要的是，这种交叉不会影响细胞计数，因为在枚举核所涉及的分段过程不受GP荧光增加的影响。在没有李斯特利辛O的情况下，血浆膜的完整性在细胞外钙的存在或不存在时保持不变，而李斯特利辛O治疗在钙补充介质的存在下导致碘化荧光的丙酸荧光强度稳步增加。然而，在没有细胞外钙的情况下，碘化荧光的丙烯显著增加，这反映出膜重新密封的缺失。或者，在远红色荧光的碳黄氨酸核酸结合染料可以替代碘化丙二，以尽量减少与GP的光谱重叠。此外，远红色染料的激发系数越大，信噪比越高，维修允许性与维修限制条件之间的分辨率也越高。在尝试此过程时，建议在实验前一天给所有管进行标记，因为这将为您在实验当天的所有试剂制备做好准备。按照这个程序，其他方法，如图像细胞仪可以回答其他问题，如孔形成毒素损害所有细胞均匀或一些细胞比其他更容易。该技术开发后，为传染病和血浆膜修复领域的研究人员探索孔径对不同细胞类型的修复效率的影响铺平了道路。

Research

JoVE Journal

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到哺乳动物的上皮细胞在体外细菌粘附的含量

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科研

免疫与感染

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流感病毒的高通量检测方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

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Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

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Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

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Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

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Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

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高通量基因定位在<em&gt;布氏锥虫</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

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基于插入渗透膜感染系统的实现研究分泌细菌病毒对哺乳动物宿主细胞的作用

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