Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

Wij erkennen Dr. Jesse Kwiek (The Ohio State University) voor kandidatuur waardoor wij zijn multi-mode detectie-platform te gebruiken voor enkele voorbereidende experimenten. Onderzoek gemeld in dit artikel werd gesteund door de National Institute of Allergy and Infectious Diseases van de National Institutes of Health award onder nummer RO1AI107250 om Stephanie Seveau. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

1. voorbereiding
<ol><li>Cel Plating Opmerking: Menselijke cervicale epitheliale cellen, HeLa en HeLa uiten Histone 2B-GFP (H2B-GFP), werden gebruikt in dit protocol, maar deze bepaling kan worden aangepast aan andere zoogdiercellen19.<ol>
<li>Loskoppelen Adherente cellen uit een 75 cm2 cel cultuur kolf door het wassen van de cellen met 2 mL trypsine-EDTA-0,25%. De gebruikte trypsine vervangen door 2 mL verse trypsine-EDTA 0,25%.</li>
		<li>Incubeer de cellen bij 37 ˚C gedurende 5...

Deze test meet de efficiëntie van het membraan opnieuw verzegelen op celniveau bevolking met hoge gegevensdoorvoer capaciteit. Het kan worden gebruikt aan het scherm voor cellulaire componenten of drug-bibliotheken die invloed kunnen hebben op de membraan reparatie. De beschreven test gebruikt een 96-wells-plaat-indeling, maar het kan worden aangepast aan 384-Wells-platen voor hogere doorvoer. Een voordeel van deze test is de mogelijkheid om het verkrijgen van de fluorescentie metingen van aanhangend levende cellen in r...

Cellen van zoogdieren zijn onderworpen aan mechanische, osmotische en biochemische stress, wat resulteert in het verlies van plasma membraan integriteit. Zonder snelle en doeltreffende nieuwe sluiting, zou de beschadigde cellen snel bezwijken voor geprogrammeerde of necrotic dood. Sinds de jaren 1960, inspanningen te begrijpen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen proces voort uit de verwoestende gevolgen die verband houden met haar functioneringsproblemen. Inderdaad, ziekten zoals Limb-Girdle spierdystrofie, diabetes en Chediak-Higashi syndroom zijn gekoppeld aan gebrekkige plasmamembraan reparatie als gevolg van mutaties in het gen coderen dysferlin, productie van advanced glycation end producten en gebreken in de lysosomale mensenhandel regulator CHS1, respectievelijk1,2,3,4,5,6. Tot op heden heeft ons begrip van membraan is opnieuw verzegelen echter nog beperkt7. Eerste studies hebben aangetoond dat membraan opnieuw verzegelen wordt geïnitieerd door de toestroom van extracellulaire Ca2 + via de beschadigde plasmamembraan8,9,10. Sindsdien verschillende niet-wederzijds exclusieve Ca2 +-afhankelijke mechanismen zijn voorgesteld om het verzegelen van de cellen. De patch-hypothese stelt dat in de nabijheid van de wond, intracellulaire vesikels zekering met elkaar en de beschadigde plasmamembraan om op te treden als een patch11,12,13,14. Een tweede model stelt dat calcium-afhankelijke exocytose van lysosomen op de wond site releases de lysosomale enzym zure sphingomyelinase, die sphingomyelinase naar ceramide in de buitenste bijsluiter van het plasma-membraan converteert. Deze plotselinge verandering in de samenstelling van lipide resultaten in ceramide gestuurde endocytose van de beschadigde regio15,16,17. Tot slot betreft het derde voorgestelde mechanisme een rol voor de endosomal sorteren complexe vereist voor transport (ESCRT) ter bevordering van de vorming van naar buiten gerichte blaasjes die bud af van het plasmamembraan18. Slechts een beperkt aantal proteïnen werd geïdentificeerd in deze modellen, en hun machines moet verder worden opgehelderd.
Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer assay die maatregelen het plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie in aanhangend zoogdiercellen onderworpen aan schade gemedieerd door recombinant listeriolysin O (LLO)19. LLO is een porie-vormende toxine (PFT) uitgescheiden door de facultatief intracellulaire pathogenen Listeria monocytogenes20,21,22 en behoort tot de MACPF/CDC (membraan aanval complex, Perforine, en cholesterol-afhankelijke cytolyse) superfamilie. MACPF zijn zoogdieren porie-vormende eiwitten die betrokken zijn in de immuun afweer, overwegende dat de CDCs zijn voornamelijk bacteriële toxines geproduceerd door gram-positieve ziekteverwekkers die gastheer cellen beschadigen ter bevordering van hun pathogene levensstijlen23. CDCs worden gesynthetiseerd als wateroplosbare monomeren of Dimeren die zich aan cholesterol binden presenteren in het plasma-membraan en oligomerize in een prepore complex van maximaal 50 subeenheden. De prepore complexe herschikt vervolgens als u wilt invoegen van β-strengen in de lipide dubbelgelaagde, vorming van een β-vat porie dat 30-50 nm in diameter24,25,26,27 omvat.  Deze grote poriën toestaan fluxen van ionen en kleine cellulaire componenten binnen en buiten de cel; Sommige studies hebben echter voorgesteld dat de poriën van kleinere maten ook gevormde28,29,30 zijn. LLO weergegeven onder de CDCs, unieke eigenschappen met inbegrip van bundeling van de onomkeerbare pH - en temperatuur-afhankelijke, die bevorderlijk is voor high-throughput analyses31,32. LLO kan worden toegevoegd aan het kweekmedium cel op 4 ˚C, een temperatuur tolerant te zijn binding naar cellen, maar niet tot de vorming van de complexe porie. Inleiding van porie vorming kan vervolgens worden gesynchroniseerd door het verhogen van de temperatuur naar 37 ˚C, waardoor voor de efficiënte verspreiding van toxine moleculen in het vlak van het membraan te formulier oligomeren en de conformationele remodelleren die betrokken zijn bij de porie generatie. Dus, na de schakelaar in de temperatuur, de kinetische van celbeschadiging zal afhangen van de hoeveelheid toxine gebonden aan het plasma-membraan. Belangrijker, oplosbare LLO (niet gebonden aan het plasma-membraan) snel en onherroepelijk aggregaten wanneer de temperatuur 37 ˚C, die verlicht de noodzaak bereikt om het wegwassen van niet-afhankelijke toxine moleculen en beperkt de omvang van membraan schade na verloop van tijd. Tot slot, omdat LLO aan cholesterol bindt en poriën in cholesterol-rijke membranen vormt, deze test is vatbaar voor een breed scala van zoogdiercellen. Het is belangrijk om in gedachten houden dat LLO beïnvloedt gastheercel signalering hoofdzakelijk via de porie vorming, met een paar uitzonderingen na in welke cel porie-onafhankelijke signalering kan optreden33,34,35,36 ,37,38,39. Daarom kunnen zij niet worden uitgesloten dat LLO signalering activiteiten invloed kunnen hebben op het proces van het membraan reparatie.
Deze test beoordeelt direct de mate van cel verwonding door het meten van de opneming van een cel impermeant fluorescerende (b.v., propidium jodide) dat passief gewonde cellen invoert en wordt sterk fluorescerende zodra gekoppeld aan nucleïnezuren . Vandaar, de fluorescerende kan worden gehandhaafd in het kweekmedium cel gedurende het gehele experiment, waardoor real-time analyses van cel verwonden. De intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof zal toenemen met de concentratie van toxine en, voor een bepaalde concentratie van toxine, zal toenemen in de tijd totdat alle poriën worden gevormd, en cellen volledig worden gerepareerd of verzadiging is bereikt. De toestroom van extracellulaire Ca2 + via de poriën van het membraan is een conditio sine qua non -evenement voor opnieuw verzegelen. Daarom de resealing efficiëntie kan niet indirect worden aangetoond door het vergelijken van cel verwonding in kweekmedium dat Ca2 + (reparatie tolerante voorwaarde) te verwonden in a Ca2 +-gratis medium (reparatie beperkende voorwaarde). Omdat de intensiteit van de fluorescentie van de nucleic zuur-bindende kleurstof recht evenredig met de concentratie van de cel in elk putje is, is het belangrijk om zaad cellen op dezelfde concentratie in alle putjes. Het is ook belangrijk bij het inventariseren van de cellen in elk putje vóór en na de bepaling om ervoor te zorgen dat mobiele-detachement niet optreedt, als zwevende, geaggregeerde cellen kunnen verdoezelen fluorescentie lezingen die data interpretatie kunnen bemoeilijken. Om te inventariseren cellen, werden cellen uiten van nucleaire-gelokaliseerde Histon 2B-GFP (H2B-GFP) gebruikt in deze test. Temperatuurregeling, multi-mode, microplate lezers combineren snelle, hoge-doorvoer metingen (met behulp van een indeling van 96 of 384-well plaat) de intensiteit van de fluorescentie van met microscopie beeldvorming van levende cellen bij 37 ° C. De laatste kan worden gebruikt voor het opsommen van celaantal en observeren van de uiteindelijke vorming van afzonderlijke cel populaties.
Uiteindelijk, deze bepaling biedt gebruikers de mogelijkheid uit te breiden hun kennis van de complexiteit van membraan herstelmechanismes door screening voor gastheer moleculen of exogenously toegevoegde stoffen waarmee membraan kunnen repareren. Het volgende protocol worden de experimentele stappen beschreven voor het meten van de resealing efficiëntie van cellen die zijn blootgesteld aan LLO en de effecten van een bepaalde drug of cellulaire behandeling op opnieuw verzegelen efficiëntie evalueren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

In hun fysiologische omgeving, zijn zoogdiercellen vaak onderworpen aan mechanische en biochemische benadrukt dat leiden beschadiging van het plasma membraan tot. In reactie op deze schadevergoeding verzegelen complexe moleculaire machines snel het plasma-membraan om te herstellen van de barrièrefunctie en handhaven van de overleving van de cel. Ondanks 60 jaar van onderzoek op dit gebied, wij nog steeds gebrek aan een grondige kennis van de cel opnieuw verzegelen van machines. Met als doel het identificeren van cellulaire componenten die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen of medicijnen die kunnen verbeteren opnieuw verzegelen, hebben we een fluorescentie-gebaseerde high-throughput assay dat maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen gekweekt in microplates. Als een modelsysteem voor plasmamembraan schade, de cellen worden blootgesteld aan de bacteriële porie-vormende toxine listeriolysin O (LLO), die grote 30-50 nm diameter eiwithoudende poriën in het cholesterol-bevattende vormt membranen. Het gebruik van een temperatuurgevoelig multi-mode microplate-lezer zorgt voor snelle en gevoelige spectrofluorometric metingen in combinatie met helderveld en fluorescentie microscopie beeldvorming van levende cellen. Kinetische analyse van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgestraald door een membraan impermeant nucleic zuur-bindende fluorescerende weerspiegelt de mate van membraan verwonding en opnieuw verzegelen op het celniveau bevolking, waardoor voor de berekening van de cel opnieuw verzegelen van efficiëntie . Fluorescentie microscopie imaging voorziet in de opsomming van cellen, die constitutively express een fluorescerende hersenschim van de nucleaire eiwit Histon 2B, in elk putje van de microplate om potentiële meetvariaties in hun aantal en zorgt voor eventuele identificatie van afzonderlijke cel populaties. Deze high-throughput assay is een krachtig hulpmiddel verwacht uit te breiden ons begrip van membraan herstelmechanismes via screening voor host genen of exogenously toegevoegd verbindingen die controle plasmamembraan opnieuw verzegelen.

Cel tellen nauwkeurigheid: HeLa cellen worden vaak gebruikt als een Modelgroep zoogdiercellen membraan herstelmechanismes verkennen. Bij de beoordeling van membraan reparatie op celniveau bevolking, is het belangrijk op plaat cellen op dezelfde concentratie in alle putjes voor de juiste data interpretatie. Het is ook belangrijk om te controleren op het moment van de bepaling dat cel nummers over wells gelijkwaardig zijn. HeLa cellen die constitutively express Histon 2B gesmolten tot GFP (...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer fluorescentie gebaseerde bepaling dat de maatregelen van het plasma-membraan opnieuw verzegelen efficiëntie door fluorimetrische en imaging analyses in levende cellen. Deze test kan worden gebruikt voor het screenen van drugs of doelgenen die regelen plasmamembraan opnieuw verzegelen in zoogdiercellen.

High-throughput meting van plasmamembraan opnieuw verzegelen efficiëntie bij zoogdiercellen

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Deze test is ontwikkeld om belangrijke vragen op het gebied van plasmamembraanbiologie aan te pakken en vast te stellen hoe efficiënt beschadigde cellen hun plasmamembraan kunnen herssepen. Deze techniek kan worden gebruikt om de efficiëntie van plasmamembraanherseten in een hoge doorvoercapaciteit te meten en om specifieke eiwitten en overeenkomstige trajecten te identificeren die plasmamembraan hersluiten. Begin met het toevoegen van 20 milliliter van een 2,5 keer 10 aan de vijfde HeLa cellen per milliliter groeimedium suspensie in een steriel pipetbekken en gebruik een 10 milliliter serologische pipet om de cellen grondig te mengen.Gebruik vervolgens een multichannel micropipet om 100 microliter cellen per put in drievoud te zaaien in een 96-well platte, heldere bodem, zwarte polystyreen weefselkweek behandelde plaat. Vergeet niet dat een homogene celverdeling de sleutel is tot een succesvol experiment, omdat vergelijkingen tussen alle experimentele omstandigheden gelijkwaardige celtellingen vereisen. Na 24 uur in de bevochtigde celkweek incubator op 37 graden Celsius en 5% CO2, prewarm de plaatlezer op 37 graden Celsius en stel de optische configuratie op monochromator, de leesmodus op fluorescentie, en het leestype kinetisch.Selecteer onder de golflengte-instellingen een excitatie van negen nanometer en een 15 nanometer emissiebandpass. Voor tests met behulp van propidium jodide, stel de excitatie en emissie golflengten op 535 nanometer en 617 nanometer, respectievelijk. Selecteer onder het plaattype 96-putten voor het plaatformaat en selecteer een vooraf ingestelde plaatconfiguratie die overeenkomt met een zwarte wandheldere bodemplaat.Onder leesgebied, markeer de putten die zullen worden geanalyseerd in de kinetische test. Onder PMT en optica, vooraf ingestelde de flitsers per lezen tot zes en schakel het vakje voor lezen van onderen. Voer onder timing nul uur 30 minuten en nul seconden in de totale looptijd voor een kinetische test van 30 minuten in en voer nul uur vijf minuten en nul seconden in voor het interval.Bevestig de opgegeven instellingen in de instellingengegevens en klik op OK. Klik vervolgens op lezen om de kinetische run te starten. Als u de beeldparameters in de instellingenmodus wilt instellen, stelt u MiniMax in voor de optische configuratie, de weergave voor de leesmodus en het eindpunt voor het leestype. Selecteer onder golflengten het uitgezonden licht en de juiste fluorescentieboxen die overeenkomen met de experimentele opwinding en emissiegolflengten.Stel het plaattype en het leesgebied in zoals net is aangetoond en stel onder de putgebiedinstelling het aantal sites in binnen een put die moet worden weergegeven. Stel onder de instellingen voor het verkrijgen van afbeeldingen voor GFP het apparaat in op het geheel goed weergeven met een belichtingstijd van 20 milliseconden per afbeelding. Voor uitgezonden licht, het verwerven van een enkel beeld van het centrum van elke put met een acht milliseconde belichtingstijd.Voor propidium jodide, het verwerven van een enkel beeld in het midden van elke put met een 20 milliseconde belichtingstijd. Bevestig vervolgens de instellingen in de instellingen-informatie en klik op OK en lees om de beeldvorming te starten. Om een op hoge doorvoerfluorescentie gebaseerde test voor de reparatie tolerante omstandigheden, was de cellen twee keer met 200 microliters van 37 graden Celsius M1 medium per goed en voeg 100 microliters van verse 37 graden Celsius M1 medium aangevuld met 30 micromolar propidium jodide na het weggooien van de tweede wasbeurt.Voor reparatie beperkende voorwaarden, was de cellen een keer met 200 microliter van 37 graden Celsius M2 medium aangevuld met vijf millimolar EGTA per goed gevolgd door een wasbeurt met 200 microliter van M2 medium alleen. Voeg na het weggooien van de tweede was 100 microliter verse 37 graden Celsius M2 medium toe, aangevuld met 30 micromolar propidium jodide per put. Beeld vervolgens de plaat onder uitgezonden licht, GFP en PI zoals net aangetoond.Terwijl de plaat wordt afgebeeld, plaats een 96 goed ronde bodem polypropyleen microplate op ijs en configureren van de plaat zoals net aangetoond voor de vorige plaat. Voor reparatie tolerante omstandigheden, voeg 100 microliters van ijskoude M1 medium aangevuld met 60 micromolar propidium jodide per goed gevolgd door de toevoeging van 100 microliters van ijskoude M1 met of zonder 4X listeriolysine O per goed. Voor reparatie beperkende voorwaarden, voeg 100 microliters van ijskoude M2 medium aangevuld met 60 micromolar propidium jodide per goed gevolgd door de toevoeging van 100 microliters van ijskoude M2 met of zonder 4X listeriolysine O per goed.Het is absoluut noodzakelijk om listeriolysine O ongeveer vijf minuten voor het begin van de kinetische test op de juiste experimentele concentratie op ijs te bereiden wanneer plaat één op ijs staat en plaat twee wordt voorbereid. Wanneer de eerste plaat klaar is met beeldvorming, breng de plaat onmiddellijk over op een vel aluminiumfolie op ijs. Na vijf minuten, breng 100 microliter van elke put van de tweede plaat naar de juiste overeenkomstige goed in de eerste gekoelde plaat, het invoegen van de pipet tips onder de meniscus van de oplossing in elke goed voor het uitwerpen van het volume zonder te mengen voor een goede verdeling van het toxine.Laat het toxine gedurende één minuut aan de gastheercellen binden en breng de eerste plaat onmiddellijk over naar de plaatlezer voor de post-kinetische test met behulp van de spectrofluorometermodus. Aan het einde van de kinetische test, onmiddellijk verwerven van een post-kinetische beeldvorming van de plaat beeld zoals aangetoond voor de pre-kinetische beeldvorming. Als u het aantal cellen wilt bepalen op basis van de nucleaire fluorescentie, selecteert u in de opsomkingssoftware microplatecel onder instellingen re-analyse en selecteert u in de instellingen van de beeldanalyse discrete objectanalyse met 541 als golflengte voor het vinden van objecten.Gebruik in de optie Objecten zoeken de methode tekenen op afbeeldingen, selecteer nuclei's en klik op toepassen en klik vervolgens op OK en lees om het celtelalgoritme te starten. GFP-expressie interfereert niet met propidium jodide intensiteitsmetingen bij de aanwezigheid of afwezigheid van listeriolysine O-behandeling. De expressie van propidium jodide kan bloeden door middel van GFP fluorescentie zoals blijkt uit een toename van de GFP fluorescentie intensiteit in HeLA H2B-GFP cellen in de post-kinetische beeldvorming test in vergelijking met de pre-kinetische analyse.Belangrijk is echter dat deze cross-over niet van invloed is op het tellen van cellen, omdat het segmentatieproces dat betrokken is bij de opsomring van de kernen niet wordt beïnvloed door een toename van de GFP-fluorescentie. Bij afwezigheid van listeriolysine O blijft de plasmamembraanintegriteit constant in de aanwezigheid of afwezigheid van extracellulair calcium, terwijl de listeriolysine O-behandeling in aanwezigheid van calciumgevulde medium resulteert in een gestage toename van de propidium jodidefluorescentieintensiteit. Bij afwezigheid van extracellulair calcium is er echter een aanzienlijk steilere toename van propidium jodidefluorescentie, als gevolg van de afwezigheid van membraanherseving.Als alternatief kan een carbocyanine nucleïnezuurbindingskleurstof met fluorescentie in het verre rood worden vervangen door propidiumjodide om de spectrale overlap met GFP te minimaliseren. Bovendien vertoont de grotere opwindingscoëfficiënt voor de verre rode kleurstof een hogere signaal-ruisverhouding en een betere resolutie tussen de reparatie tolerante en reparatiebeperkende voorwaarden. Tijdens een poging tot deze procedure wordt aanbevolen om alle buizen een dag voor het experiment te labelen, omdat dit u voorbereidt op alle reagensvoorbereiding op de dag van het experiment.Na deze procedure kunnen andere methoden zoals beeldcytometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals een porievormend toxine, alle cellen gelijkmatig beschadigt of zijn sommige cellen vatbaarder dan andere. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van infectieziekten en plasmamembraanreparatie om de effecten van poriegrootte op de reparatie-efficiëntie van verschillende celtypen te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In vitro assay van bacteriële hechting op zoogdieren epitheelcellen

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

High-throughput Detection Methode voor Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Meting van Factor V activiteit in humaan plasma met een Microplate coagulatietest

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Quantitative High-throughput Eencellige cytotoxiciteit T cellen

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Meting van extracellulaire DNA los en Kwantitatieve NET Formation in menselijke neutrofielen<em&gt; In Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

-Microscopie gebaseerde testen voor high-throughput screening van Host factoren die betrokken zijn in<em&gt; Brucella</em&gt; Infectie van Hela cellen

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Betrouwbaar en High Efficiency Winning van Kidney immuuncellen

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Implementatie van een permeabel membraan Insert-gebaseerde infectiesysteem: Effecten van uitgescheiden bacteriële toxinen op zoogdiergastheercellen Studie

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...