Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Nous reconnaissons le Dr Jesse Kwiek (The Ohio State University) pour bien vouloir ce qui nous permet d’utiliser sa plate-forme de détection multimode pour quelques expériences préliminaires. Recherche rapporté dans cet article a été financée par le National Institute of Allergy et des maladies infectieuses de la National Institutes of Health, sous le numéro de prix RO1AI107250 à Stephanie Seveau. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement l’opinion officielle de la National Institutes of Health.

1. préparation
<ol><li>Placage de cellule Remarque : Donner naissance à des cellules épithéliales humaines du col utérin, HeLa et HeLa exprimant Histone 2 b-GFP (H2B-GFP), ont été utilisés dans le présent protocole, mais ce test peut être adapté aux autres cellules mammaliennes19.<ol>
<li>Détacher les cellules adhérentes d’un flacon de culture cellulaire 75 cm2 de laver les cellules avec 2 mL de trypsine-EDTA 0,25 %. Remplacez la trypsine utilisée par 2 mL de 0,25 ...

Ce test mesure l’efficacité de la membrane rescellage au niveau des populations de cellules avec une capacité de haut débit. Il peut être utilisé pour dépister les composants cellulaires ou des bibliothèques de drogues qui pourraient affecter la réparation de la membrane. Le test décrit utilisée un format de plaque à 96 puits, mais il peut être adapté pour les plaques 384 puits pour un débit plus élevé. Un avantage de ce test est sa capacité à obtenir des mesures de fluorescence des cellules vivantes ...

Les cellules de mammifères sont soumis à un stress mécanique, osmotique et biochimique, entraînant la perte d’intégrité de la membrane plasmique. Sans rescellement de rapide et efficace, les cellules endommagées succomberait rapidement à mort programmée ou nécrotique. Depuis les années 1960, les efforts pour comprendre la membrane plasmique rescellage processus ont été motivées par les conséquences dévastatrices, associés à ses dysfonctionnements. En effet, des maladies telles que la branche-Girdle Muscular Dystrophy, le diabète et le Syndrome de Chediak-Higashi ont été liés à déficient membrane plasmique réparation due à des mutations dans le gène codant dysferline, la production de produits de glycation avancée ainsi que les anomalies dans le régulateur de trafic lysosomal CHS1, respectivement1,2,3,4,5,6. Toutefois, à ce jour, notre compréhension de la membrane rescellage est encore limitée7. Les premières études ont démontré que la membrane rescellage est initiée par l’influx d’extracellulaire Ca2 + par le biais de la plasmalemme endommagés8,9,10. Depuis lors, plusieurs ne s’excluent Ca2 +-mécanismes dépendants ont été proposées pour refermer les cellules. L’hypothèse de patch propose que, à proximité de la plaie, vésicules intracellulaires fusionnent entre eux et la membrane plasmique endommagée d’agir comme un patch11,12,13,14. Un second modèle propose cette exocytose calcium-dépendante des lysosomes à la plaie site libère la Sphingomyélinase acide enzyme lysosomale, qui convertit la sphingomyéline en céramide dans le feuillet externe de la membrane plasmique. Ce changement soudain dans la composition lipidique entraîne axée sur le céramide endocytose de la région endommagée15,16,17. Enfin, le troisième mécanisme proposé implique un rôle pour l’endosomale tri complexes nécessaires au transport (ESCRT) promouvoir la formation de vésicules donnant sur l’extérieur qui bourgeonnent hors de la membrane plasmique18. Uniquement un ensemble limité de protéines a été identifié dans ces modèles, et leurs machines doit être davantage élucidé.
Nous décrivons ici un test haut débit qui la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères adhérentes soumise à endommager des mesures médiées par recombinaison listériolysine O (LLO)19. LLO est une toxine en formant des pores (PFT) sécrétée par le pathogène intracellulaire facultatif Listeria monocytogenes20,21,22 et appartient à la MACPF/CDC (complexe d’attaque membranaire, la perforine, et super-famille cytolysine cholestérol-dépendante). MACPF sont formant des pores mammifères protéines impliquées dans les défenses immunitaires, tandis que les CDC est des toxines bactériennes principalement produites par des agents pathogènes Gram-positifs qui endommagent les cellules de l’hôte pour promouvoir leurs modes de vie pathogènes23. CDCs sont synthétisées sous forme de monomères solubles dans l’eau ou les dimères qui se lient au cholestérol présent dans la membrane plasmique et oligomerize en un complexe prepore des sous-unités jusqu'à 50. Le complexe prepore réarrange ensuite pour insérer les brins β à travers la bicouche lipidique, formant un pore de β-canon qui s’étend sur 30-50 nm de diamètre24,25,26,27.  Ces grands pores permettent un flux d’ions et de petites composantes cellulaires dans et hors de la cellule ; Cependant, certaines études ont proposé que les pores de plus petites tailles sont également formé28,29,30. Entre les CDC, LLO affiche des propriétés uniques, y compris l’agrégation irréversible et température-dépendante du pH, qui est propice à des analyses de haut débit31,32. LLO peut être ajouté au milieu de culture cellulaire à 4 ° c, une température permissive à sa liaison à des cellules, mais pas à la formation du pore complexe. Ouverture de la formation de pores est synchronisable puis en augmentant la température à 37 ° c, permettant la diffusion efficace des molécules de la toxine dans le plan de la membrane d’oligomères de forme et pour le remodelage conformationnelle impliqués dans la génération de pore. C’est pourquoi, suite à l’interrupteur de température, la cinétique des dommages cellulaires dépendra de la quantité de toxine liée à la membrane plasmique. Ce qui est important, LLO soluble (non lié à la membrane plasmique) rapidement et irréversiblement agrégats lorsque la température atteint 37 ° c, ce qui diminue le besoin d’évacuer les molécules de la toxine non lié et limite l’étendue des dégâts de la membrane au fil du temps. Enfin, parce que LLO se lie au cholestérol et forme des pores dans les membranes riches en cholestérol, ce dosage est favorable à une large gamme de cellules de mammifères. Il est important de garder à l’esprit que LLO affecte la cellule hôte signalisation principalement via la formation de pores, à quelques exceptions près dans quelle cellule indépendante du pore de signalisation peut se produire33,34,35,36 ,37,38,,39. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que LLO activités peuvent influer sur le processus de réparation de membrane de signalisation.
Ce test évalue directement l’étendue de la cellule blessant en mesurant l’incorporation d’un fluorochrome imperméants cellulaire (p. ex., l’iodure de propidium) qui pénètre les cellules blessées passivement et qui devient très fluorescent une fois qu’il associe à des acides nucléiques . Par conséquent, le fluorochrome peut être maintenu dans le milieu de culture cellulaire pendant toute l’expérience, ce qui permet des analyses en temps réel des cellules blessant. L’intensité de la fluorescence du colorant acide nucléique-liaison augmente avec la concentration de la toxine et, pour une concentration donnée de toxine, augmentera au fil du temps jusqu'à ce que tous les pores sont formés, et les cellules sont entièrement réparés ou jusqu'à ce que la saturation est atteinte. L’afflux d’extracellulaire Ca2 + à travers les pores de la membrane est un événement de la condition sine qua non pour refermer. Par conséquent, l’efficacité de fermeture peut être indirectement attestée en comparant la cellule blessant dans le milieu de culture contenant du Ca2 + (condition permissive de réparation) à blessant d’un Ca2 +-milieu dépourvu (condition restrictive de réparation). Parce que l’intensité de la fluorescence de la teinture de liaison de l’acide nucléique est directement proportionnelle à la concentration cellulaire dans chaque puits, il est important de cellules des graines à la même concentration dans tous les puits. Il est également important d’énumérer des cellules dans chaque puits avant et après le test pour s’assurer que le détachement de cellules ne se produit pas, comme flottant, cellules agrégées peuvent masquer des lectures de fluorescence qui peuvent compliquer l’interprétation des données. Pour énumérer des cellules, les cellules exprimant l’histone nucléaire localisé 2 b-GFP (H2B-GFP) ont été utilisées dans ce test. Température contrôlée, multimode, lecteurs de microplaques allient des mesures rapides et à haut débit (à l’aide d’un format de plaque 96 ou 384 puits) d’intensités de fluorescence avec imagerie microscopie des cellules vivantes à 37 ° C. Ce dernier peut être utilisé pour énumérer le nombre de cellules et observer la formation éventuelle de populations cellulaires distincts.
En fin de compte, ce test offre aux utilisateurs la possibilité d’approfondir leur connaissance de la complexité des mécanismes de réparation de membrane de dépistage pour les molécules de l’hôte ou réparer des composés exogène qui peuvent contrôler la membrane. Le protocole suivant décrit les étapes expérimentales afin de mesurer l’efficacité de fermeture des cellules exposées à la LLO et évaluer les effets d’un médicament ou un traitement cellulaire sur l’efficacité de fermeture.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

Dans leur environnement physiologique, les cellules de mammifères souvent soumises à des contraintes mécaniques et biochimiques qui donnent lieu à des dommages de la membrane plasmique. En réponse à ces dommages-intérêts, les mécanismes moléculaires complexes refermer rapidement la membrane plasmique pour rétablir sa fonction de barrière et de maintenir la survie des cellules. Malgré les 60 ans de recherche dans ce domaine, il nous manque encore une compréhension approfondie de la cellule réapposition de sceau sur machines. Dans le but d’identifier les composants cellulaires que contrôle rescellement de membrane plasmique ou des médicaments qui peuvent améliorer la réapposition de sceau, nous avons développé un test haut débit basés sur la fluorescence qui mesure la membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères cultivé en microplaques. Comme système modèle pour les dommages de la membrane plasmique, les cellules sont exposées à la listériolysine toxine bactérienne formant des pores O (LLO), qui forme la grande 30-50 nm de diamètre protéique pores en cholestérol contenant les membranes. L’utilisation d’un lecteur de microplaques de multimode thermorégulées permettant la spectrofluorométrie rapide et sensible des mesures en combinaison avec fond clair et imagerie de la microscopie de fluorescence des cellules vivantes. L’analyse cinétique de l’intensité de la fluorescence émise par un fluorochrome de l’acide nucléique-liaison imperméants membrane reflète l’étendue de la membrane blessant et refermer au niveau de la population des cellules, permettant le calcul de la cellule réapposition de sceau sur l’efficacité . Imagerie de la microscopie de fluorescence permet pour le dénombrement des cellules, qui constitutivement expriment une chimère fluorescente de la protéine nucléaire histone 2 b, dans chaque puits de la microplaque pour tenir compte des variations potentielles de leur nombre et permet éventuellement identification des populations cellulaires distincts. Ce test haut débit est un outil puissant devrait s’accroître notre compréhension des mécanismes de réparation de membrane par l’intermédiaire de dépistage des gènes hôtes ou exogène ajouté des rescellement de membrane plasmique ce contrôle.

Précision de comptage de cellules : les cellules HeLa sont fréquemment utilisés comme une ligne de cellules de mammifère modèle explorer les mécanismes de réparation de membrane. Lors de l’évaluation de réparation de la membrane au niveau de la population des cellules, il est important de cellules de la plaque à la même concentration dans tous les puits pour l’interprétation des données appropriées. Il est également important de vérifier au moment de l’essai que nom...

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High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Nous décrivons ici un test haut débit fluorescence qui mesure la membrane plasmique rescellage d’efficacité grâce à des analyses fluorimétrique et imageries de cellules vivantes. Ce test peut être utilisé pour le dépistage des drogues ou des gènes de cible qui régulent la membrane plasmique réapposition de sceau sur des cellules mammaliennes.

Haut débit mesure de Membrane plasmique réapposition de sceau sur l’efficacité des cellules de mammifères

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Cet essai a été développé pour répondre aux questions clés dans le domaine de la biologie de membrane de plasma et pour établir comment les cellules efficacement endommagées peuvent réséaliser leur membrane plasmatique. Cette technique peut être utilisée pour mesurer l’efficacité de la membrane plasmatique resealing dans une capacité de haut débit et pour identifier les protéines spécifiques et les voies correspondantes qui médiation de la membrane plasmatique resealing. Commencez par ajouter 20 millilitres d’un 2,5 fois 10 à la cinquième cellules HeLa par millilitre de suspension moyenne de croissance dans un bassin stérile pipette et utiliser une pipette sérologique de 10 millilitres pour bien mélanger les cellules.Ensuite, utilisez une micropipette multicanal pour ensemencer 100 microlitres de cellules par puits en triplicate dans une plaque traitée à fond plat et clair de 96 puits. Rappelez-vous qu’une distribution homogène de cellules est la clé d’une expérience réussie car les comparaisons entre toutes les conditions expérimentales nécessitent des nombres de cellules équivalents. Après 24 heures dans l’incubateur humidifié de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5% de CO2, préchauffer le lecteur de plaque à 37 degrés Celsius et définir la configuration optique au monochromateur, le mode de lecture à la fluorescence, et le type de lecture à cinétique.Dans les réglages de longueur d’onde, sélectionnez une excitation de neuf nanomètres et un bandpass d’émission de 15 nanomètres. Pour les analyses utilisant l’iodure de propidium, réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission à 535 nanomètres et 617 nanomètres, respectivement. Sous le type de plaque, sélectionnez 96 puits pour le format de plaque, et sélectionnez une configuration prédéfini de plaque correspondant à une plaque inférieure claire de mur noir.Sous la zone de lecture, mettre en évidence les puits qui seront analysés tout au long de l’analyse cinétique. Sous PMT et optique, prédéfinis les flashs par lecture à six et cochez la case pour lire en bas. Dans le cadre du chronométrage, entrez zéro heure 30 minutes et zéro seconde dans le temps de course total pour un test cinétique de 30 minutes et entrez zéro heure cinq minutes et zéro seconde pour l’intervalle.Confirmez les paramètres spécifiés dans les informations de paramètres et cliquez sur OK. Cliquez ensuite sur lire pour lancer la course cinétique. Pour définir les paramètres d’imagerie dans le mode paramètres, définissez MiniMax pour la configuration optique, l’imagerie pour le mode lecture et le point de terminaison pour le type de lecture. Sous les longueurs d’onde, sélectionnez la lumière transmise et les boîtes de fluorescence appropriées correspondant aux longueurs d’onde expérimentales d’excitation et d’émission.Définissez le type de plaque et la zone de lecture comme vous venez de le démontrer et sous le réglage de la zone du puits, définissez le nombre de sites à l’intérieur d’un puits à imager. Dans les paramètres d’acquisition d’images de GFP, réglez l’appareil pour l’image de l’ensemble du puits avec un temps d’exposition de 20 millisecondes par image. Pour la lumière transmise, acquérir une seule image du centre de chaque puits avec un temps d’exposition de huit millisecondes.Pour l’iodure de propidium, acquérir une seule image au centre de chaque puits avec un temps d’exposition de 20 millisecondes. Ensuite, confirmez les paramètres dans les paramètres d’information et cliquez sur OK et lire pour lancer l’imagerie. Pour configurer un essai à base de fluorescence à haut débit pour les conditions permissives de réparation, lavez les cellules deux fois avec 200 microlitres de 37 degrés Celsius M1 moyen par puits et ajoutez 100 microlitres de milieu M1 frais de 37 degrés Celsius complété par 30 iodure de propidium micromolaire après avoir jeté le deuxième lavage.Pour des conditions restrictives de réparation, lavez les cellules une fois avec 200 microlitres de 37 degrés Celsius M2 moyen complété par egta millimolar par puits suivi d’un lavage avec 200 microlitres de M2 seul moyen. Après avoir jeté le deuxième lavage, ajouter 100 microlitres de milieu M2 frais de 37 degrés Celsius complété par 30 iodure de propidium micromolaire par puits. Puis l’image de la plaque sous la lumière transmise, GFP, et PI comme vient de le démontrer.Pendant que la plaque est en cours d’image, placez une microplaque de polypropylène fond rond de 96 puits sur la glace et configurez la plaque comme cela vient d’être démontré pour la plaque précédente. Pour réparer les conditions permissives, ajouter 100 microlitres de glace froide M1 moyenne complétée par 60 iodure propidium micromolaire par puits suivie de l’ajout de 100 microlitres de glace froide M1 avec ou sans 4X listeriolysin O par puits. Pour les conditions restrictives de réparation, ajouter 100 microlitres de glace froide M2 moyenne complétée par 60 iodure propidium micromolaire par puits suivie de l’ajout de 100 microlitres de glace froide M2 avec ou sans 4X listeriolysin O par puits.Il est impératif de préparer la listeriolysine O à la concentration expérimentale appropriée sur la glace environ cinq minutes avant le début de l’analyse cinétique lorsque la plaque 1 est sur la glace et que la plaque deux est en préparation. Lorsque la première plaque est terminée imagerie, transférer immédiatement la plaque sur une feuille de papier d’aluminium sur la glace. Après cinq minutes, transférer 100 microlitres de chaque puits de la deuxième plaque au puits correspondant approprié dans la première plaque refroidie, en insérant les pointes de pipette sous le ménisque de la solution dans chaque puits avant d’éjecter le volume sans mélanger pour une bonne distribution de la toxine.Laissez la toxine se lier aux cellules hôtes pendant une minute et transférez immédiatement la première plaque au lecteur de plaque pour l’analyse post-cinétique à l’aide du mode spectrofluoromètre. À la fin de l’essai cinétique, acquérir immédiatement une image post-cinétique de l’image de plaque telle que démontrée pour l’imagerie précinétique. Pour déterminer le nombre de cellules en fonction de la fluorescence nucléaire, dans le logiciel de énumération des cellules microplaquées dans les paramètres, sélectionnez la ré-analyse et, dans les paramètres d’analyse d’images, sélectionnez l’analyse discrète des objets en utilisant 541 comme longueur d’onde pour trouver des objets.Dans l’option trouver des objets, utilisez le tirage au sort sur la méthode de recherche d’images, sélectionnez les noyaux, et cliquez sur appliquer, puis cliquez sur OK et lire pour lancer l’algorithme de comptage cellulaire. L’expression de GFP n’interfère pas avec des mesures d’intensité d’iodure de propidium en présence ou en absence du traitement de listeriolysine O. L’expression de l’iodure de propidium peut saigner par fluorescence de GFP comme démontré par une augmentation de l’intensité de fluorescence de GFP dans les cellules de H2B-GFP d’HeLA dans l’essai post-cinétique de formation image comparée à l’analyse précinétique.Fait important cependant, ce croisement n’affecte pas le comptage cellulaire, car le processus de segmentation impliqué dans l’énumération des noyaux n’est pas affecté par une augmentation de la fluorescence GFP. En l’absence de listeriolysine O, l’intégrité de la membrane plasmatique reste constante en présence ou en l’absence de calcium extracellulaire, tandis que le traitement de listeriolysine O en présence de calcium complété moyen entraîne une augmentation constante de l’intensité de fluorescence iodée propidium. En l’absence de calcium extracellulaire cependant, il y a une augmentation sensiblement plus raide de fluorescence d’iodure de propidium, reflétant l’absence de résealing de membrane.Alternativement, un colorant liant d’acide nucléique de carbocyanine avec la fluorescence dans le rouge lointain peut être substitué à l’iodure de propidium pour réduire au minimum le chevauchement spectral avec GFP. En outre, le coefficient d’excitation plus élevé pour le colorant rouge lointain présente un rapport signal/bruit plus élevé et une meilleure résolution entre les conditions de réparation permissives et restrictives de réparation. Lors de la tentative de cette procédure, il est recommandé d’étiqueter tous les tubes un jour avant l’expérience, car cela vous préparera à toute la préparation du réaccente le jour de l’expérience.Après cette procédure, d’autres méthodes comme la cytométrie d’image peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires, telles qu’un pore formant la toxine endommage toutes les cellules uniformément ou certaines cellules sont plus sensibles que d’autres. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines des maladies infectieuses et de la réparation des membranes plasmatiques afin d’explorer les effets de la taille des pores sur l’efficacité de réparation des différents types de cellules.

Research

JoVE Journal

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High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

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