Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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हम डॉ यिशै Kwiek स्वीकार करते है (ओहियो राज्य विश्वविद्यालय) के लिए कृपया हमें अपनी बहु कुछ प्रारंभिक प्रयोगों के लिए मोड का पता लगाने के मंच का उपयोग करने की अनुमति । इस लेख में बताया गया अनुसंधान स्टेफ़नी Seveau को पुरस्कार संख्या RO1AI107250 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के राष्ट्रीय एलर्जी और संक्रामक रोगों के संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

1. तैयारी
<ol><li>सेल चढ़ाना नोट: मानव ग्रीवा उपकला कोशिकाओं, हेला और हेला व्यक्त हिस्टोन बी-GFP (H2B-GFP), इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया, लेकिन इस परख अन्य स्तनधारी कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है<sup class...

यह परख उच्च प्रवाह क्षमता के साथ कोशिका जनसंख्या के स्तर पर फिर से सील झिल्ली की दक्षता उपाय । यह सेलुलर घटकों या झिल्ली की मरंमत को प्रभावित कर सकता है कि दवा पुस्तकालयों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्?...

स्तनधारी कोशिकाओं यांत्रिक, आसमाटिक, और जैव रासायनिक तनाव, प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप के अधीन हैं । तेजी से और कुशल फिर से सील के बिना, क्षतिग्रस्त कोशिकाओं को जल्दी से क्रमादेशित या मौत का शिकार हो जाएगा । 1960 के दशक के बाद से, प्लाज्मा झिल्ली को फिर से सील करने की प्रक्रिया को समझने के प्रयासों को अपने शिथिलताओं के साथ जुड़े विनाशकारी परिणामों से प्रेरित किया गया है । दरअसल, इस तरह के अंग के रूप में रोग-करधनी पेशी Dystrophy, मधुमेह, और Chediak-हिगाशी सिंड्रोम की कमी प्लाज्मा झिल्ली जीन एंकोडिंग dysferlin में उत्परिवर्तनों के कारण मरंमत, उंनत glycation अंत उत्पादों के उत्पादन से जोड़ा गया है, और दोषों में lysosomal ्े नियामक CHS1, क्रमशः1,2,3,4,5,6। हालांकि, तारीख करने के लिए, झिल्ली resealing की हमारी समझ अभी भी सीमित है7। प्रारंभिक अध्ययनों से यह प्रदर्शित किया है कि झिल्ली resealing extracellular Ca की आमद द्वारा शुरू की है2 + क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से8,9,10। तब से, कई गैर पारस्परिक रूप से अनंय Ca2 +-निर्भर तंत्र को कोशिकाओं को फिर से सील करने का प्रस्ताव किया गया है । पैच परिकल्पना का प्रस्ताव है कि घाव करने के लिए निकटता में, intracellular बुलबुले एक दूसरे के साथ फ्यूज और क्षतिग्रस्त प्लाज्मा झिल्ली एक पैच के रूप में कार्य करने के लिए11,12,13,14. एक दूसरे मॉडल का प्रस्ताव है कि कैल्शियम पर निर्भर exocytosis lysosomes के घाव स्थल पर lysosomal एंजाइम एसिड sphingomyelinase, जो प्लाज्मा झिल्ली के बाहरी पत्रक में sphingomyelin ceramide धर्मांतरित विज्ञप्ति । ceramide में लिपिड संरचना के परिणाम में यह अचानक परिवर्तन-चालित endocytosis के क्षतिग्रस्त क्षेत्र15,16,17. अंत में, तीसरे प्रस्तावित तंत्र endosomal छँटाई परिवहन (ESCRT) के लिए आवश्यक जावक के गठन को बढ़ावा देने के लिए एक भूमिका शामिल है-बुलबुले का सामना करना पड़ रहा है कि प्लाज्मा झिल्ली18से बंद कली । इन मॉडलों में केवल प्रोटीन के सीमित सेट की पहचान की गई थी और उनकी मशीनरी का आगे आविर्भाव होना आवश्यक है ।
यहां हम एक उच्च-प्रवाह परख का वर्णन है कि प्लाज्मा अनुयाई स्तनधारी कोशिकाओं में दक्षता सील रिकॉमबिनेंट listeriolysin ओ (LLO)19द्वारा मध्यस्थता नुकसान के अधीन झिल्ली के उपाय । LLO एक ताकना बनाने वाला विष (PFT) facultative intracellular रोगज़नक़ लिस्टिरिया monocytogenes20,21,22 से स्रावित है और MACPF/सीडीसी (झिल्ली हमला परिसर, perforin के अंतर्गत आता है, और कोलेस्ट्रॉल पर निर्भर cytolysin) superfamily. MACPF स्तनधारी ताकना-प्रतिरक्षा सुरक्षा में शामिल प्रोटीन बनाने हैं, जबकि CDCs बैक्टीरियल विषाक्त पदार्थों को मुख्य रूप से ग्राम द्वारा उत्पादित-सकारात्मक रोगजनकों कि क्षति मेजबान कोशिकाओं को अपने रोगजनक जीवन शैली को बढ़ावा देने के लिए23। CDCs पानी में घुलनशील मोनोमर या dimers के रूप में संश्लेषित कर रहे है कि प्लाज्मा झिल्ली और oligomerize में ५० उपइकाईयों के एक परिसर में ताकना में मौजूद कोलेस्ट्रॉल को बांध । फिर से बनाना परिसर में β-किस्में लिपिड bilayer भर में डालने के लिए पुनर्व्यवस्थित, एक β-बैरल ताकना है कि व्यास24,25,26,27में 30-50 एनएम spans के गठन.  इन बड़े में और सेल से बाहर आयनों और छोटे सेलुलर घटकों के प्रवाह की अनुमति है; हालांकि, कुछ अध्ययनों का प्रस्ताव किया है कि छोटे आकार के pores भी28,29,30का गठन कर रहे हैं । CDCs के अलावा, LLO अपरिवर्तनीय पीएच सहित अद्वितीय गुण प्रदर्शित करता है-और तापमान पर निर्भर एकत्रीकरण, जो उच्च-प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुकूल है31,३२। LLO 4 ˚ सी पर सेल संस्कृति माध्यम में जोड़ा जा सकता है, एक तापमान स्वतंत्र कोशिकाओं को अपनी बाध्यकारी है, लेकिन नहीं ताकना परिसर के गठन के लिए । ताकना गठन की दीक्षा तो ३७ ˚ सी के लिए तापमान बढ़ाने के द्वारा सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है, झिल्ली के विमान में विष अणुओं के कुशल प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए oligomers फार्म और के गठन के लिए ताकना पीढ़ी में शामिल remodeling । इसलिए, तापमान में स्विच के बाद, कोशिका क्षति के काइनेटिक प्लाज्मा झिल्ली को बाध्य विष की मात्रा पर निर्भर करेगा । महत्वपूर्ण बात, घुलनशील LLO (प्लाज्मा झिल्ली के लिए बाध्य नहीं) तेजी से और अचल समुच्चय जब तापमान ३७ ˚ सी है, जो दूर असीम विष अणुओं को धोने और समय के साथ झिल्ली क्षति की हद तक सीमित करने की आवश्यकता को दूर करने के लिए पहुंचता है । अंत में, क्योंकि LLO कोलेस्ट्रॉल और रूपों को बांध कोलेस्ट्रॉल युक्त झिल्ली में pores, इस परख स्तनधारी कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उत्तरदाई है । यह ध्यान में रखना महत्वपूर्ण है कि LLO मेजबान सेल ताकना गठन के माध्यम से मुख्य रूप से संकेतन प्रभावित करता है, कुछ अपवाद है जो में ताकना-स्वतंत्र सेल संकेत हो सकता है के साथ३३,३४,३५,३६ ,३७,३८,३९. इसलिए, यह LLO संकेतन गतिविधियों झिल्ली की मरंमत की प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते है कि बाहर रखा जा सकता है ।
यह परख सीधे एक सेल impermeant fluorochrome (जैसे, propidium आयोडाइड) कि निष्क्रिय घायल कोशिकाओं में प्रवेश करती है और अत्यधिक फ्लोरोसेंट हो जाता है एक बार यह न्यूक्लिक एसिड के साथ सहयोगियों के शामिल मापने के द्वारा घायल सेल की हद तक का आकलन . इसलिए, fluorochrome प्रयोग भर में सेल संस्कृति माध्यम में बनाए रखा जा सकता है, सेल के वास्तविक समय विश्लेषण की अनुमति घायल । न्यूक्लिक एसिड बाध्यकारी डाई की प्रतिदीप्ति तीव्रता विष की एकाग्रता के साथ वृद्धि होगी और, विष की एक दी एकाग्रता के लिए, समय के साथ वृद्धि होगी जब तक सभी pores का गठन कर रहे हैं, और कोशिकाओं को पूरी तरह से मरम्मत कर रहे हैं या जब तक संतृप्ति तक पहुँच गया है. extracellular Ca की आमद2 + झिल्ली pores के माध्यम से एक साइन शर्त गैर घटना को फिर से सील करने के लिए है । इसलिए, प्रतिसील दक्षता परोक्ष रूप से एक सीए2+-मुक्त मध्यम (मरंमत प्रतिबंधात्मक शर्त) में घायल करने के लिए (मरंमत स्वतंत्र हालत) सीए2 युक्त संस्कृति मध्यम में घायल सेल की तुलना द्वारा सबूत हो सकता है । क्योंकि न्यूक्लिक एसिड की प्रतिदीप्ति तीव्रता-बाध्यकारी डाई सीधे प्रत्येक कुआं में कोशिका एकाग्रता के लिए आनुपातिक है, यह सभी कुओं में एक ही एकाग्रता में बीज कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी एक अच्छी तरह से पहले और परख के बाद कि कोशिका टुकड़ी नहीं होती है सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में चल, एकत्रित कोशिकाओं अस्पष्ट कर सकते है प्रतिदीप्ति रीडिंग जो डेटा व्याख्या जटिल हो सकता है । कोशिकाओं की गणना करने के लिए, परमाणु-स्थानीयकृत हिस्टोन बी-GFP (H2B-GFP) व्यक्त कोशिकाओं इस परख में इस्तेमाल किया गया । तापमान नियंत्रित, बहु-मोड, microplate पाठकों ३७ डिग्री सेल्सियस पर रहने वाले कोशिकाओं की सूक्ष्म इमेजिंग के साथ प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रयोग तेजी से, उच्च प्रवाह मापन (एक ९६ या ३८४-well प्लेट प्रारूप का उपयोग) । बाद के लिए सेल संख्या की गणना और विशिष्ट कोशिका आबादी के अंतिम गठन का निरीक्षण किया जा सकता है ।
अंत में, इस परख उपयोगकर्ताओं को मेजबान अणुओं या exogenously जोड़ा यौगिकों कि झिल्ली की मरंमत नियंत्रण कर सकते है के लिए स्क्रीनिंग द्वारा झिल्ली की मरंमत तंत्र की जटिलता के अपने ज्ञान का विस्तार करने की क्षमता प्रदान करता है । निम्न प्रोटोकॉल LLO करने के लिए उजागर कोशिकाओं की सील दक्षता को मापने के लिए प्रयोगात्मक चरणों का वर्णन करता है और एक दी दवा या सेलुलर उपचार के प्रभाव को फिर से सील करने पर दक्षता का मूल्यांकन.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

उनके शारीरिक वातावरण में, स्तनधारी कोशिकाओं अक्सर यांत्रिक और जैव रासायनिक तनाव के अधीन है कि प्लाज्मा झिल्ली क्षति में परिणाम । इन नुकसान के जवाब में, जटिल आणविक मशीनरी तेजी से प्लाज्मा झिल्ली को फिर से सील करने के लिए अपनी बाधा समारोह बहाल करने और सेल अस्तित्व को बनाए रखने । इस क्षेत्र में अनुसंधान के ६० साल के बावजूद, हम अभी भी सेल सील मशीनरी की एक पूरी तरह से समझ की कमी है । सेलुलर घटकों की पहचान करने के लक्ष्य के साथ कि प्लाज्मा झिल्ली रिसील या दवाओं है कि सुधार कर सकते है resealing, हम एक प्रतिदीप्ति आधारित उच्च प्रवाह परख है कि प्लाज्मा झिल्ली स्तनधारी कोशिकाओं में दक्षता को फिर से सील करने के उपाय विकसित किया है microplates में कल्चर्ड । प्लाज्मा झिल्ली की क्षति के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में, कोशिकाओं जीवाणु ताकना करने के लिए उजागर कर रहे हैं-विष listeriolysin O (LLO), जो रूपों बड़े 30-50 एनएम व्यास proteinaceous कोलेस्ट्रॉल युक्त झिल्ली में pores । एक तापमान नियंत्रित बहु मोड microplate रीडर का उपयोग brightfield और जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग के साथ संयोजन में तेजी से और संवेदनशील spectrofluorometric माप के लिए अनुमति देता है । एक झिल्ली impermeant न्यूक्लिक अम्ल-बाध्यकारी fluorochrome द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति तीव्रता के काइनेटिक विश्लेषण कोशिका को सील करने की दक्षता की गणना के लिए अनुमति देता है, घाव भरने और कोशिका जनसंख्या स्तर पर पुन सील करने की हद तक दर्शाता है . प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इमेजिंग कोशिकाओं के गणन के लिए अनुमति देता है, जो परमाणु प्रोटीन हिस्टोन बी एक फ्लोरोसेंट कल्पना व्यक्त constitutively, microplate के प्रत्येक में अच्छी तरह से उनकी संख्या में संभावित रूपों के लिए खाते में और अंततः के लिए अनुमति देता है विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान । यह उच्च प्रवाह परख एक शक्तिशाली मेजबान जीन या exogenously के लिए स्क्रीनिंग के माध्यम से झिल्ली की मरंमत तंत्र की हमारी समझ का विस्तार करने की उंमीद उपकरण यौगिकों कि नियंत्रण प्लाज्मा झिल्ली को पुनः सील कर जोड़ा है ।

सेल सटीकता की गिनती: हेला कोशिकाओं अक्सर एक मॉडल स्तनधारी कोशिका लाइन के रूप में उपयोग किया जाता है झिल्ली की मरंमत तंत्र का पता लगाने । जब कोशिका जनसंख्या के स्तर पर झिल्ली की मरंमत का आकल?...

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High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

यहाँ हम एक उच्च प्रवाह प्रतिदीप्ति-आधारित परख का वर्णन है कि प्लाज्मा झिल्ली fluorometric और इमेजिंग विश्लेषण के माध्यम से रहने वाली कोशिकाओं में दक्षता को फिर से सील करने के उपाय । इस परख स्क्रीनिंग दवाओं या लक्ष्य जीन है कि प्लाज्मा स्तनधारी कोशिकाओं में सील झिल्ली को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

स्तनधारी कोशिकाओं में क्षमता को फिर से सील प्लाज्मा झिल्ली का उच्च प्रवाह माप

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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बैक्टीरियल आसंजन के स्तनधारी उपकला कोशिकाओं पर इन विट्रो परख

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

इन्फ्लुएंजा वायरस के लिए उच्च throughput जांच विधि

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

फैक्टर मानव प्लाज्मा में वी गतिविधि के मापन एक microplate जमावट परख का उपयोग

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

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Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

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कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन<em&gt; इन विट्रो</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

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Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

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उच्च throughput जीन टैगिंग में<em&gt; Trypanosoma ब्रुसे</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

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किडनी प्रतिरक्षा कोशिकाओं के विश्वसनीय और उच्च क्षमता निष्कर्षण

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

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High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

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Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...