Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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我々 は、私たちはいくつかの予備的な実験のため彼のマルチモード検出プラットフォームを使用する許可していただいた博士ジェシー Kwiek (オハイオ州立大学) を認めます。この記事で報告された研究は、国立研究所のアレルギーとステファニー Seveau を受賞番号 RO1AI107250 の下で健康の国民の協会の感染症によって支持されました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

1. 準備
<ol><li>電池めっき 注: ひと子宮頸の上皮細胞、hela 細胞、hela 細胞のヒストン 2B GFP (H2B GFP) を表現するがこのプロトコルで使用されていたが、この試金は他の哺乳類細胞19に合わせることができます。<ol>
<li>0.25% トリプシン-EDTA の 2 mL で細胞を洗浄することにより付着性のセル 75 cm2細胞培養用フラスコからをデタッチします。新鮮なトリプシン-EDTA 0.25 %2 mL ...

この試金は高スループット容量を持つセルの人口レベルで再封止膜の効率を測定します。使用できる細胞成分や細胞膜修復に影響を与える薬物ライブラリの画面に。説明アッセイは 96-well 版のフォーマットを使用、高いスループット 384 ウェル プレートに合わせることができます。このアッセイの利点は、過剰な細胞など細胞の剥離、固定、または蛍光標識後固定処理を必要とせずリアルタ?...

哺乳類細胞膜の完全性の損失で、その結果機械、浸透、および生化学的ストレス予告があります。迅速かつ効率的な再封止、なし損傷した細胞プログラムまたは壊死死にすぐに屈する。プロセスを再封止膜を理解する努力は、1960 年代以降、その機能障害に関連付けられている壊滅的な結果によってが動機になっています。確かに、ベイジュ症候群、糖尿病、肢帯型筋ジストロフィーなどの病気は、突然変異遺伝子符号化ジスフェリン、高度の glycation の最終製品の生産や欠陥による欠損細胞膜修復にリンクされています。ライソゾーム人身売買レギュレータ CHS1、それぞれ1,2,3,4,5,6。しかし、まで、膜の私達の理解を再シールはまだ限られた7です。初期の研究は、細胞外 Ca2 +膜破損した8,9,10までの流入によって膜を再シールを開始することを示しています。その後、いくつか非相互に排他的な Ca2 +の細胞を再シールするのに依存のメカニズムが提案されています。パッチの仮説は、傷口に近接、細胞内小胞がお互いとパッチ11,12,13,14として破損した細胞膜融合を提案します。2 番目のモデルは、カルシウム依存性の開口放出を提案する傷をリソソームのサイト リリース ライソゾーム酵素酸性スフィンゴミエリナーゼは、スフィンゴミエリンをセラミド細胞膜の外側のリーフレットに変換します。脂質組成の変化は、損傷領域15,16,17のセラミド駆動エンドサイトーシスの結果します。最後に、3 つめの提案されたメカニズムには、エンドソーム並べ替えを複雑なトランスポート (ESCRT) 膜18から発芽する外向きの小胞の形成を促進するために必要な役割が含まれます。蛋白質の限定セットのみがこれらのモデルで識別され、その機械をさらに解明する必要があります。
ここ付着性哺乳類細胞における効率を再封止膜が損傷を受けた措置を介する遺伝子組換えリステリオリジン O (LLO)19高スループット試金を記述します。LLO リステリア菌20,21,22通性細胞内病原体によって分泌される孔形成毒素 (PFT) を MACPF/CDC に属する (膜の攻撃の複合体、パーフォリンとコレステロール依存性 cytolysin) スーパーファミリー。MACPF は、哺乳類の気孔形成グラム陽性の病原体の病原性ライフ スタイル23を促進するために宿主細胞に損傷を与えるプロデュース CDCs 主に細菌毒素に対し免疫防御に関与するタンパク質。CDCs は水溶性モノマーとして合成される化や細胞膜に存在コレステロールに結合する二量体まで 50 サブユニットの孔形成前の複合体に oligomerize複雑な prepore は、直径24,25,,262730-50 nm にわたる β バレル型細孔を形成脂質全体の β ストランドを挿入するのには、再配置します。 これらの大きな毛穴がセルのうちイオンと小型携帯電話部品のフラックスを許可します。しかし、いくつかの研究は、小さいサイズの細孔が形成された28,29,30も提案しています。CDCs、間 LLO ハイスループット解析31,32を助長している不可逆的な pH と温度依存性の集計を含む固有のプロパティが表示されます。LLO は 4 ° C、孔複合体の形成ではなく、細胞への結合に許容温度で細胞培養液に追加できます。ポア形成の開始は、細孔生成に関与するフォーム オリゴマーに膜面での毒素分子の効率的な拡散と構造改造を許可する、37 ° C に温度を上げることによって、同期できます。したがって、細胞の損傷の運動、温度スイッチ、次は、細胞膜にバインド毒素の量に依存します。重要なは、水溶性 LLO (細胞膜にはバインドされていない) 迅速かつ不可逆的集約温度 37 ° C、非連結の毒素分子を離れて洗浄する必要性を軽減し、時間をかけて膜損傷の程度を制限に達したとき。最後に、LLO コレステロール バインド コレステロール豊富な膜で毛穴を形作るため、この試金は哺乳類細胞の広い範囲に従う。おいて LLO ホスト細胞の気孔の形成を介して主にシグナル伝達に影響を与えることが重要です間隙に依存しないセルのいくつかの例外を持つシグナルが発生する33,34,35,36 ,37,38,39。したがって、ことはできませんその LLO 活動は細胞膜修復のプロセスに影響を及ぼす信号を除外します。
この試金は直接セル、セル非透過性螢光色素 (例えば、ヨウ化 propidium) 受動的負傷者の細胞に入ると核酸に関連付けられると、高輝度になります定款を測定することにより負傷の程度を評価します。.したがって、螢光色素は細胞を傷つけるのリアルタイム解析をできるように、実験を通して細胞培養培地で維持できます。核酸結合色素の蛍光強度は毒素の濃度が増えるし、毒素の濃度が増加時間をかけてすべての細孔が形成され、細胞は完全に修復されか、飽和に達するまで。細胞外 Ca2 +膜の気孔を通して流入は、再封止かやりイベントです。したがって、resealing の効率が直接判明しない細胞 Ca2 +で負傷する Ca2 + (修理寛容な条件) を含む培地の負傷を比較して-無料媒体 (修理制限条件)。核酸結合色素の蛍光強度は直接各ウェルの細胞濃度に比例しているので、すべての井戸で同じ濃度でシード セルに重要です。また、細胞の剥離が発生しないこと、フローティングとして集計されるセルは、データの解釈を複雑にするかもしれない蛍光測定値を隠すことができるように試験の前後に、各ウェルの細胞を列挙することが重要です。細胞を列挙するには、ローカライズされた核ヒストン 2B GFP (H2B GFP) を発現する細胞は、この試金で使用されました。温度制御、マルチモード マイクロ プレート リーダー迅速、高スループット計測計測を組み合わせる (96 または 384 ウェル プレート フォーマットを使用して) 蛍光強度の 37 ° c. で生きている細胞の顕微鏡イメージングの後者は細胞数を列挙し、異なる細胞集団の最終的な形成を観察に使用できます。
最終的には、この試金はホスト分子のスクリーニングによって膜修復機構の複雑さの彼らの知識を拡大する機能をユーザーに提供または外追加化合物膜を制御する修理します。次のプロトコル LLO 細胞の resealing の効率を測定する実験の手順を説明し、ある薬剤または再シール効率で細胞治療の効果を評価します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

彼らの生理学的環境で哺乳類細胞はしばしば細胞膜損傷力学的および生化学的ストレスにさらされます。これらの損害に対し、複雑な分子機械は急速にそのバリア機能を回復し、細胞の生存を維持する細胞膜を再シールします。にもかかわらず、この分野の研究の 60 年間、我々 はまだ機械を再シールする細胞の完全に理解を欠いています。細胞成分の同定の目的とその制御膜を再シールまたは、再シールを改善できる薬開発した哺乳類細胞における効率を再封止膜を測定する蛍光ベースの高スループット試金マイクロ プレートで培養しました。細菌の孔形成毒素リステリオリジン O (LLO) は、大規模な 30-50 nm 径のタンパク質はコレステロールを含むの細孔を形成するのにさらされている細胞膜損傷のためのモデル システムとして膜。温度制御マルチモード マイクロ プレート リーダーは、明視野観察と細胞の蛍光顕微鏡との組み合わせで迅速・高感度カルバゾール測定に使用します。膜非透過性核酸結合の螢光によって放射される蛍光強度の速度論的解析および効率を再シールするセルの計算を可能にするセルの人口レベルで再封止膜の範囲を反映します。.蛍光顕微鏡イメージング恒常蛍光核蛋白質ヒストン 2 の b の数の潜在的な変化を考慮するマイクロ プレートの各ウェルに、キメラを表現でき、最終的な細胞の列挙が可能します。異なる細胞集団の同定。この高スループット試金は、宿主遺伝子のスクリーニングを介して膜修復メカニズムの私達の理解を拡大するまたは追加外因の強力なツールは、その制御膜を再シール化合物です。

細胞数測定精度: HeLa 細胞は膜修復機構を探索、モデル哺乳類セルラインとして頻繁に。セルの人口レベルの細胞膜修復を評価し、適切なデータ解釈のすべての井戸で同じ濃度で細胞をプレートすることが重要です。また、井戸の間で、細胞数が同等である試金の時に確認することが重要です。恒常ヒストン 2B (H2B GFP) GFP の融合を表現する HeLa 細胞は、自動的にその蛍...

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High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

ここで細胞の蛍光イメージング解析による効率を再封止膜を測定する高スループット蛍光を用いた測定について述べる。この試金は、薬や哺乳類細胞における原形質膜を再シールするターゲット遺伝子をスクリーニングするために使用できます。

哺乳類細胞における効率を再封止膜の高スループット測定

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

このアッセイは、原形質膜生物学の分野における重要な問題に対処し、損傷を受けた細胞が原形膜を再シールする方法を確立するために開発されました。この技術は、高スループット容量における血漿膜再封入の効率を測定し、特定のタンパク質および血漿膜再封を媒介する対応する経路を同定するために使用することができる。まず、増殖培地懸濁液1ミリリットル当たり2.5倍の10倍のHeLa細胞を無菌ピペット盆地に20ミリリットルを加え、10ミリリットルの血清ピペットを使用して細胞を完全に混合します。次に、マルチチャネルマイクロピペットを使用して、96ウェル平らで透明な底、黒いポリスチレン組織培養処理プレートの三重でウェルあたり100マイクロリットルの細胞を播種する。すべての実験条件間の比較には同等の細胞数が必要であるため、均質な細胞分布が実験を成功させるための鍵となる点に注意してください。加湿した細胞培養インキュベーターで摂氏37度と5%CO2で24時間後、プレートリーダーを摂氏37度にプリウォームし、光学構成をモノクロメータに、読み取りモードを蛍光色に、読み取り型をキネティックに設定します。波長設定の下で、9ナノメートル励起と15ナノメートルの発光バンドパスを選択します。ヨウ化プロピジウムを用いたアッセイの場合は、励起波長と発光波長をそれぞれ535ナノメートルと617ナノメートルに設定します。プレートタイプで、プレートフォーマットに96-ウェルを選択し、黒壁クリアボトムプレートに対応するプリセットプレート構成を選択します。読み取り領域の下で、運動アッセイ全体で分析される井戸を強調します。PMT および光学の下で、読み取りごとの点滅を 6 に事前設定し、下から読み取るボックスをチェックします。タイミングの下で、30分の運動アッセイの合計実行時間に0時間30分0秒を入力し、間隔にゼロ時間5分0秒を入力します。設定情報で指定した設定を確認し、[OK]をクリックします。次に、「読み取り」をクリックして、キネティック・ランを開始します。設定モード内でイメージングパラメータを設定するには、光学式設定のMiniMax、読み取りモードのイメージング、読み取りタイプのエンドポイントを設定します。波長の下で、透過光と、実験励起波長と発光波長に対応する適切な蛍光ボックスを選択します。プレートタイプと読み取り領域をちょうど実証したように設定し、ウェルエリア設定の下で、画像化するウェル内のサイト数を設定します。GFP の画像取得設定で、イメージあたり 20 ミリ秒の露光時間でデバイス全体をイメージするように設定します。透過光の場合、8ミリ秒の露光時間で各ウェルの中心の単一の画像を取得します。ヨウ化プロピジウムの場合、20ミリ秒の露光時間で各ウェルの中心に単一の画像を取得します。次に、設定情報の設定を確認し、[OK]をクリックして読み取り、イメージングを開始します。修復許容条件に対して高スループット蛍光ベースのアッセイを設定するには、ウェルあたり37°CM1培地の200マイクロリットルで細胞を2回洗浄し、2回目の洗浄を廃棄した後に30マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した新鮮な37度のM1培地を100マイクロリットル加えます。修復制限条件の場合、ウェルあたり5ミリモルEGTAを添加した37°C M2培地の200マイクロリットルで細胞を1回洗浄し、続いて200マイクロリットルのM2培地単独で1回洗浄します。2回目の洗浄を廃棄した後、1ウェルあたり30マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した新鮮な37度摂氏M2培地100マイクロリットルを加えます。次に、光、GFP、PI の下でプレートをイメージします。プレートがイメージされている間、氷の上に96ウェルラウンドボトムポリプロピレンマイクロプレートを置き、前のプレートのためにちょうど示したようにプレートを構成します。修復の許容条件については、1ウェルあたり60マイクロモルモルプロピジウムヨウ化物を添加した氷冷M1培地の100マイクロリットルを加え、その後、4XリステリアリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M1を添加する。修理制限条件の場合、1ウェルあたり60マイクロモルプロピジウムヨウ化物を添加した氷冷M2培地100マイクロリットルを加え、その後、4XリステリアリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M2を添加する。プレート1が氷上にあり、プレート2が準備されている場合、運動アッセイの開始の約5分前に氷上の適切な実験濃度でリステリアリシンOを調製することが不可欠です。最初のプレートがイメージングを終了したら、すぐに氷上のアルミ箔のシートにプレートを移します。5分後、第2プレートの各ウェルから1番目の冷却プレートの適切な対応ウェルに100マイクロリットルを移し、毒素の適切な分配のために混合することなく体積を排出する前に、各ウェルに溶液の半月板の下にピペットチップを挿入する。毒素を宿主細胞に1分間結合させ、分光フルオロメーターモードを用いて第1プレートをプレートリーダーに直ちに移して、後動態アッセイに移します。キネティックアッセイの終わりに、プレキネティックイメージングのために示されるように、プレート画像のポストキネティックイメージングを直ちに取得する。核蛍光に基づいて細胞数を決定するには、設定下のマイクロプレート細胞列挙体ソフトウェアで再分析を選択し、画像解析設定で、オブジェクトを見つけるための波長として541を使用して離散オブジェクト分析を選択します。[オブジェクトの検索] オプションで、[画像の描画] 検索方法を使用し、[核] を選択して [適用] をクリックし、[OK] をクリックして読み取り、セルカウント アルゴリズムを開始します。GFP発現は、リステリアリシンO処理の有無においてヨウ化プロピジウム強度測定を妨げない。ヨウ化プロピジウムの発現は、運動前分析と比較して、ヒラ・H2B-GFP細胞におけるヒラ・H2B-GFP細胞におけるGFP蛍光強度の増加によって証明されるように、GFP蛍光を通して出血することができる。しかし重要なのは、このクロスオーバーは、核の列挙に関与するセグメンテーションプロセスがGFP蛍光の増加の影響を受けないため、細胞数に影響を与えない。リステリアライシンOがない場合、細胞外カルシウムの存在下または存在しない限り、原形質膜の完全性は一定であり、カルシウム補充培地の存在下でのリステリアリシンO治療はヨウ化プロピジウム蛍光強度の着実な増加をもたらす。しかし、細胞外カルシウムがない場合、膜再密封の欠如を反映して、ヨウ化プロピジウム蛍光の有意に急激な増加がある。あるいは、遠赤色の蛍光を有するカルボシアニン核酸結合色素を、ヨウ化プロピジウムに置換して、GFPとのスペクトル重複を最小限に抑えることができる。さらに、遠赤色色素の励起係数が大きいほど、信号対雑音比が高くなり、修復の許容条件と修復制限条件の間の解像度が向上します。この手順を試みている間、実験の日にすべての試薬の準備をするので、実験の1日前にすべてのチューブにラベルを付けることをお勧めします。この手順に従うと、画像サイトメトリーのような他の方法は、すべての細胞を均一に損傷する細孔形成毒素を行う、または他のものよりも一部の細胞が感受性であるなどの追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、感染症や原形質膜修復の分野の研究者が、異なる細胞タイプの修復効率に及ぼす孔径の影響を探求する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

哺乳類上皮細胞上に細菌付着のインビトロアッセイ

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

マイクロ波凝固アッセイを用いたヒト血漿中の第V因子活性の測定

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

ヒト好中球における細胞外DNAのリリースおよび定量NET形成のハイスループット測定<em&gt;インビトロ</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

腎、免疫細胞の信頼性と高効率抽出

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

哺乳動物宿主細胞に分泌された細菌毒素の影響を研究するために、透過膜を挿入ベースの感染システムの実現

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...