Name: high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

Lütfen bazı ön deneyler için onun çok modlu algılama platformu kullanmak izin verdiğiniz için Dr Jesse Kwiek (Ohio Devlet Üniversitesi) anıyoruz. Bu makalesinde bildirilen araştırma Ulusal Enstitüsü alerji ve enfeksiyon hastalıkları Ulusal Sağlık Enstitüleri Stephanie Seveau için ödül numarası RO1AI107250 altında tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.

1. hazırlık
<ol><li>Hücre kaplama Not: İnsan servikal epitel hücreleri, HeLa ve histon 2B-GFP (H2B-GFP), ifade HeLa Bu protokol için kullanılan, ancak bu tahlil için diğer memeli hücreleri19adapte edilebilir.<ol>
<li>Yapisan bir 75 cm2 hücre kültür şişesi hücrelerinden % 0.25 tripsin-EDTA 2 mL hücrelerle yıkayarak bağlantısını kesin. Kullanılan tripsin taze tripsin-EDTA %0.25 2 mL ile değiştirin.</li>
		<li>Hücreleri yuvarlak ve balonun müstakil kadar 5 m...

Bu tahlil membran hücre nüfus düzeyinde yüksek üretilen iş kapasitesi ile yeniden mühürlemeden etkinliğini ölçer. O-ebilmek var kullanılmış için hücresel bileşenleri veya membran onarım etkileyebilecek uyuşturucu kitaplıkları ekran. 96-şey plaka açıklanan tahlil kullanılan ama 384-şey plakalar için daha yüksek üretilen iş için uyarlanabilir. Floresans ölçümleri yapisan canlı hücreler aşırı hücre hücre dekolmanı, fiksasyon veya sonrası fiksasyon etiketleme floresans gibi işleme ...

Memeli hücre mekanik, ozmotik ve biyokimyasal stres plazma membran bütünlüğü kaybı sonuçlanan, tabidir. Hızlı ve verimli yeniden mühürlemeden olmadan, hasarlı hücreleri hızlı bir şekilde programlanmış veya nekrotik ölüme yenik. 1960'lardan beri çabaları işlem yeniden mühürlemeden plazma zarı anlamak için onun işlev bozuklukları ile ilişkili yıkıcı sonuçları tarafından motive edilmiş. Nitekim, bacak-korse kas distrofisi, diyabet ve Chediak-Higashi sendromu gibi hastalıkların mutasyonlar gen kodlama dysferlin, gelişmiş glikasyondan son ürünleri imalatı ve kusurları nedeniyle eksik plazma zarı onarım için bağlantılı olmuştur lizozomal ticareti düzenleyici CHS1, sırasıyla1,2,3,4,5,6. Ancak, bugüne kadar membran anlayışımızı yeniden mühürlemeden hala sınırlı7var. İlk çalışmalar membran yeniden mühürlemeden ekstraselüler Ca2 + ile hasarlı plazma zarı8,9,10akını tarafından başlatılır gösterdi. O zamandan beri birkaç ayrı ayrı Ca2 +-hücreleri yeniden mühürlemek için önerilen bağımlı mekanizmaları. Yama hipotez yara yakınlık içinde birbirleriyle ve bir yama11,12,13,14davranmaya hasarlı plazma zarı ile hücre içi veziküller sigorta öneriyor. İkinci bir model o kalsiyum-bağımlı ekzositozu öneriyor organellerin yara adlı bir site sphingomyelin plazma zarı dış kitapcıktaki ceramide dönüştürür lizozomal enzim asit sphingomyelinase bültenleri. Bu ani değişiklik lipid bileşiminde hasarlı bölge15,16,17endositoz ceramide tahrik sonuçlanır. Son olarak, üçüncü önerilen mekanizma endosomal kapalı18plazma zarı bud dışa dönük vezikül oluşumu tanıtmak taşıma (ESCRT) için gerekli karmaşık sıralama için bir rol içerir. Proteinler, sadece sınırlı sayıda bu modelleri tespit edildi ve onların makine daha fazla aydınlatılmamıştır gerekir.
Burada biz verimliliği yapisan memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı zarar tabi önlemler rekombinant listeriolysin O (LLO)19aracılı bir yüksek-den geçerek tahlil tanımlamak. LLO fakültatif intraselüler patojen Listeria Monositogenez20,21,22 tarafından salgılanan gözenek oluşturan bir toksin (SFT) ve MACPF/CDC aittir (membran atak kompleksi, perforin, ve kolesterol bağımlı cytolysin) süper. MACPF çoğu memeli gözenek oluşturan proteinleri ise KGK özellikle bakteriyel toksinler bağışıklık savunma dahil kendi patojenik yaşam23tanıtmak için ana bilgisayar hücrelerine de zarar gram-pozitif patojenler tarafından üretilen. KGK suda çözünen monomer sentez veya kolesterol için bağlama dimer plazma zarı sunmak ve en fazla 50 alt birimleri prepore bir kompleks oligomerize. Karmaşık prepore sonra 30-50 nm çapı24,25,26,27' deki yayılan bir β-varil gözenek oluşturan lipid bilayer genelinde β-iplikçikleri eklemek için yeniden düzenler.  Bu iri gözenekli hücre içinde ve dışında Cerayanlar iyonları ve küçük hücresel bileşenleri izin; Yine de, bazı çalışmalar daha küçük boyutları gözeneklerin de kurulan28,29,30olduğunu önerdi. KGK arasında LLO yüksek üretilen iş analizleri31,32için elverişli geri dönüşü olmayan pH ve sıcaklık bağımlı toplama dahil benzersiz özelliklerini görüntüler. LLO 4 ˚C, onun bağlayıcı hücreleri, ancak karmaşık gözenek oluşumu için izin veren bir sıcaklık hücre kültür orta eklenebilir. Gözenek oluşumu inisiyasyon sonra toksin moleküllerin membran için formu reaksiyonlar, düzlemde verimli difüzyon ve konformasyon remodeling gözenek üretimi dahil izin 37 ˚C sıcaklığa yükselterek eşitlenebilir. Bu nedenle, sıcaklık, hücre hasarı kinetik anahtarı izleyen plazma zarı bağlı toksin miktarına bağlıdır. Önemlisi, çözünür LLO (plazma zarı bağlı değildir) sıcaklık ilişkisiz toksin molekülleri silsin gereğini azaltır ve zaman içinde membran hasar ölçüde sınırlar 37 ˚C ulaştığında hızla ve geri dönüşümsüz toplar. LLO kolesterol için bağlar ve gözenekleri kolesterol açısından zengin membranlar oluşturur, son olarak, bu tahlil memeli hücreleri geniş bir mükellef olduğundan. LLO esas olarak gözenek oluşumu ile sinyal konak hücre etkiler akılda tutmak önemlidir birkaç istisna dışında hangi gözenek bağımsız hücre sinyallemesi33,34,35,36 oluşabilir ,37,38,39. Bu nedenle, olamaz faaliyetleri membran onarım sürecini etkileyebilir sinyal o LLO hariç.
Bu tahlil doğrudan hücre pasif yaralı hücreleri girer ve nükleik asitler ile ilişkilendiren bir kez son derece floresan olur bir hücre impermeant fluorochrome (Örneğin, propidium iyodür) birleşme ölçerek yaralama ölçüde değerlendiriyor . Bu nedenle, fluorochrome hücre yaralama, gerçek zamanlı analiz izin deney boyunca hücre kültür ortamında muhafaza edilebilir. Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu toksin konsantrasyon ile artacak ve toksin verilen konsantrasyona kadar tüm gözenekleri kurulur ve hücreleri tamamen tamir veya doygunluk ulaşılıncaya kadar zamanla artacaktır. Hücre dışı Ca2 + membran gözenekler yoluyla akını yeniden mühürleme için olmazsa olmaz bir olaydır. Bu nedenle, resealing verimliliği dolaylı olarak hücre kültür Ca2 + (onarım izin veren koşul) içeren bir Ca2 +' yaralama için orta yaralama karşılaştırarak kanıtı-ücretsiz Orta (onarım kısıtlayıcı durumu). Nükleik asit bağlama boya floresan yoğunluğu hücre konsantrasyonu her iyi doğru orantılı olduğundan, aynı toplama bütün Wells, tohum hücrelere önemlidir. Her şey hücrelerde önce ve sonra hücre dekolmanı, yüzen olarak, toplanan hücre veri yorumu karmaşık hale floresans okuma belirsiz oluşmaz emin olmak için tahlil numaralandırmak önemlidir. Hücreleri numaralandırmak için lokalize nükleer histon 2B-GFP (H2B-GFP) ifade hücreleri bu tahlil kullanılmıştır. Isı kontrollü, çok modlu, 37 ° C'de yaşam hücrelerinin mikroskopisi görüntüleme (96 veya 384-şey plaka biçimini kullanarak) hızlı, yüksek üretilen iş ölçümler floresans yoğunluklarını Mikroplaka Okuyucular birleştirmek İkinci hücre sayı saymak ve farklı hücre popülasyonlarının nihai oluşumu gözlemlemek için kullanılabilir.
Sonuçta, bu tahlil kullanıcılar tarafından tarama için ana bilgisayar molekülleri onların bilgi membran tamir mekanizmaları karmaşıklığı genişletme yeteneğini sağlar veya membran denetleyebilen exogenously eklenen bileşikler onarın. Aşağıdaki protokol için LLO maruz hücreleri resealing verimliliğini ölçmek için deneysel adımları açıklar ve verilen ilaç ya da yeniden mühürlemeden verimliliği hücresel tedavi etkilerini değerlendirmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="610">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">SpectraMax i3x Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">i3x</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">MiniMax 300 Imaging cytometer</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;">5024062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">TO-PRO-3</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">T3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium Iodide</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa H2B-GFP</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SCC117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA 0.25%</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td align="left" height="63" style="height:63px;width:216px;">96-well Corning flat bottom black polystyrene tissue culture treated plate</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">Hanks&#39; balanced Salts</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H4891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td align="left" style="width:108px;">ISC BioExpress</td>
			<td style="width:119px;">0732-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td align="left" height="42" style="height:42px;width:216px;">HEPES</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:216px;">D-(+)-Glucose, HybriMax</td>
			<td align="left" style="width:108px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G5146-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput measurement of plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells

Fizyolojik çalışma ortamlarında memeli hücreleri kez plazma zarı zarar görmesine neden mekanik ve biyokimyasal gerilmeler tabi. Bu zarardan karşılık olarak, karmaşık moleküler makineleri hızla bariyer fonksiyonu geri yüklemek ve hücre yaşam sürdürmek için plazma zarı yeniden mühürleyin. Bu alanda araştırma, 60 yaşında olmasına rağmen hala makine yeniden mühürlemeden hücre kapsamlı bir anlayış eksikliği. Hücresel bileşenleri belirlenmesi amacı ile bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme veya yeniden mühürleme, artırabilir uyuşturucu biz verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer floresans tabanlı yüksek üretilen iş tahlil geliştirdik Mikroplaka içinde kültürlü. Plazma zarı zarar için bir model sistem olarak bakteriyel gözenek oluşturan toksin listeriolysin O (LLO), büyük 30-50 nm çapında proteinaceous gözenekleri kolesterol içeren formlar hücreleri maruz membranlar. Isı kontrollü çok modlu Mikroplaka Okuyucu kullanımı hızlı ve hassas spectrofluorometric ölçümleri, aydınlık alan ve floresan mikroskopi görüntüleme yaşayan hücrelerin birlikte sağlar. Bir membran impermeant nükleik asit bağlama fluorochrome tarafından yayılan floresan yoğunluğu kinetik Analizi yaralama ve verimliliği yeniden mühürlemeden hücre hesaplama için izin hücre nüfus düzeyinde yeniden mühürlemeden membran kapsamını yansıtır . Yapısal nükleer protein histon 2B, mikroplaka hesap numarasına olası değişimler için her şey bir floresan chimera hızlı ve için nihai sağlayan hücreleri numaralandırma için floresans mikroskobu görüntüleme sağlar farklı hücre popülasyonlarının tanımlaması. Bu yüksek üretilen iş tahlil ana bilgisayar genler için tarama yoluyla membran tamir mekanizmaları anlayışımızı genişletmek için beklenen veya exogenously eklendi güçlü bir araç bu denetim plazma zarı yeniden mühürleme bileşikleri olduğunu.

Doğruluk sayma hücre: HeLa hücreleri sık sık bir modeli memeli hücre satır olarak membran tamir mekanizmaları keşfetmek için kullanılır. Membran onarım hücre nüfus düzeyinde değerlendirirken, aynı toplama için uygun verileri yorumlama bütün Wells, plaka hücrelere önemlidir. Tahlil zamanda cep numaraları kuyular arasında eşdeğer olduğunu doğrulamak önemlidir. Yapısal GFP (H2B-GFP) erimiş histon 2B hızlı HeLa hücreleri floresan onların çekirdekleri tespi...

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells at JoVE.com

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

Bu test, plazma membran biyolojisi alanındaki önemli soruları ele almak ve hasarlı hücrelerin plazma zarLarını ne kadar verimli bir şekilde yeniden mühürleyebildiğini belirlemek için geliştirilmiştir. Bu teknik, plazma zarının yüksek verim kapasitesinde yeniden sızdırmazlık verimliliğini ölçmek ve plazma membranının yeniden mühürlemeye aracılık eden belirli proteinleri ve buna karşılık gelen yolları belirlemek için kullanılabilir. Steril bir pipet havzasıiçine büyüme orta süspansiyon mililitre başına beşinci HeLa hücrelerine 20 mililitre 2.5 kat 10 ekleyerek başlayın ve hücreleri iyice karıştırmak için 10 mililitre serolojik pipet kullanın.Daha sonra, 96-iyi düz, net alt, siyah polistiren doku kültürü tedavi plaka triplicate iyi başına hücrelerin 100 mikrolitre tohum için çok kanallı mikropipet kullanın. Tüm deneysel koşullar arasındaki karşılaştırmalar eşdeğer hücre sayılarını gerektirdiğinden, homojen bir hücre dağılımının başarılı bir deneyin anahtarı olduğunu unutmayın. 37 santigrat derece ve %5 CO2'de nemlendirilmiş hücre kültürü kuluçka makinesinde 24 saat kaldıktan sonra, plaka okuyucuyu 37 santigrat dereceye ısıtın ve optik konfigürasyonu monokromatöre, okuma modunu floresana ve okuma türünü kinetik olarak ayarlayın.Dalga boyu ayarlarının altında, dokuz nanometre uyarma ve 15 nanometre emisyon bandpass'ı seçin. Propidium iyodür kullanarak yapılan tahliller için uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 535 nanometre ve 617 nanometreye ayarlayın. Plaka türü altında, plaka biçimi için 96-wells seçin ve siyah duvar berrakalt plakası karşılık gelen önceden ayarlanmış bir plaka yapılandırması seçin.Okuma alanı altında, kinetik test boyunca analiz edilecek kuyuları vurgulayın. PMT ve optik altında, okuma başına yanıp söner önceden altı ayarlayın ve alttan okumak için kutuyu işaretleyin. Zamanlama altında, 30 dakikalık kinetik bir çalışma için toplam çalışma süresine sıfır saat 30 dakika ve sıfır saniye girin ve aralık için sıfır saat beş dakika sıfır saniye girin.Ayarlar bilgilerinde belirtilen ayarları onaylayın ve Tamam'ı tıklatın. Ardından kinetik çalıştırmayı başlatmak için oku'yu tıklatın. Görüntüleme parametrelerini ayarlar modu içinde ayarlamak için, optik yapılandırma için MiniMax'ı, okuma modu için görüntülemeyi ve okuma türü için bitiş noktasını ayarlayın. Dalga boylarının altında, iletilen ışığı ve deneysel uyarma ve emisyon dalga boylarına karşılık gelen uygun floresan kutularını seçin.Plaka türünü ve okuma alanını sadece gösterildiği gibi ayarlayın ve kuyu alanı ayarı altında, görüntülenecek bir kuyu içindeki site sayısını ayarlayın. GFP için görüntü edinme ayarları altında, görüntü başına 20 milisaniye lik pozlama süresiyle aygıtın tamamını iyi görüntüye göre ayarlayın. İletilen ışık için, sekiz milisaniyelik pozlama süresiyle her kuyunun merkezinin tek bir görüntüsünü elde edin.Propidium iyodür için, 20 milisaniyelik pozlama süresi ile her kuyunun merkezinde tek bir görüntü elde edin. Ardından ayarlar bilgilerindeki ayarları onaylayın ve Görüntülemeyi başlatmak için Tamam'ı tıklatın ve okuyun. Onarım izin koşulları için yüksek iş lenme floresan bazlı bir test kurmak için, hücreleri her kuyuda 200 mikrolitre 37 derece Santigrat M1 orta ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamayı attıktan sonra 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye edilmiş 100 mikrolitre taze 37 derece Santigrat M1 ortamı ekleyin.Onarım kısıtlayıcı koşullar için, hücreleri bir kez 37 derece Santigrat M2 orta 200 mikrolitre ile iyi başına beş milimolar EGTA ile takviye ve sadece M2 orta 200 mikrolitre ile bir yıkama takip ile yıkayın. İkinci yıkama attıktan sonra, iyi başına 30 mikromolar propidium iyodür ile takviye taze 37 derece Santigrat M2 orta 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra plakayı aktarılan ışık, GFP ve PI'nin altında az önce gösterildiği gibi görüntüleyin.Plaka görüntülenirken, buz üzerine 96 iyi yuvarlak alt polipropilen mikroplaka yerleştirin ve sadece önceki plaka için gösterildiği gibi plaka yapılın. Onarım izin koşulları için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m1 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M1 100 mikrolitre eklenmesi izledi. Onarım kısıtlayıcı koşullar için, iyi başına 60 mikromolar propidium iyodür ile desteklenen buz gibi m2 orta 100 mikrolitre ekleyin ve iyi başına 4X listeriolysin O ile veya olmadan buz soğuk M2 100 mikrolitre eklenmesi izledi.Listeriolysin O'nun, birinci plaka buz üzerinde yken ve ikinci plaka hazırlanırken kinetik tözün başlamasından yaklaşık beş dakika önce buz üzerinde uygun deneysel konsantrasyonda hazırlanması zorunludur. İlk plaka görüntüleme bittiğinde, hemen buz üzerinde alüminyum folyo bir levha üzerine plaka aktarın. Beş dakika sonra, toksinin uygun dağılımı için karıştırmadan önce her kuyuda çözeltinin menisküs altına pipet uçlarını ekleyerek, ikinci plakanın her kuyudan 100 mikrolitreyi uygun şekilde soğutulmuş plakaya aktarın.Toksinin bir dakika lığına ana bilgisayar hücrelerine bağlanmasına izin verin ve spektroflorometre modunu kullanarak kinetik sonrası tetkik için ilk plakayı hemen plaka okuyucuya aktarın. Kinetik tararmanın sonunda, ön kinetik görüntülemede gösterildiği gibi plaka görüntüsünün kinetik sonrası görüntüsünü hemen elde edin. Çekirdek floresan dayalı hücre sayısını belirlemek için, ayarlar altında mikroplaka hücre numaralandırma yazılımı, yeniden analiz seçin ve görüntü analizi ayarlarında, nesneleri bulmak için bir dalga boyu olarak 541 kullanarak ayrık nesne analizi seçin.Nesneleri bul seçeneğinde, görüntüleri bulma yöntemindeki çizimi kullanın, çekirdekleri seçin ve uygula'yı tıklatın, ardından Tamam'ı tıklatın ve hücre sayma algoritmasını başlatmak için okuyun. GFP ekspresyonu, listeriolysin O tedavisinin varlığında veya yokluğunda propidium iyodür yoğunluğu ölçümlerini engellemez. Propidium iyodin ekspresyonu, kinetik öncesi analize kıyasla HeLA H2B-GFP hücrelerinde GFP floresan yoğunluğunda artış la kanıtlanan GFP floresans yoluyla kanayabilir.Daha da önemlisi, çekirdeklerin numaralandırmasında yer alan segmentasyon süreci GFP floresansındaki artıştan etkilenmediği için bu geçit hücre sayma işlemini etkilemez. Listeriolysin O yokluğunda, plazma membran bütünlüğü varlığı veya ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda sabit kalır, kalsiyum varlığında listeriolysin O tedavi propidium iyodür floresan yoğunluğunda sürekli bir artış ile orta sonuçlar takviye. Ancak ekstrasellüler kalsiyum yokluğunda, propidium iyodür floresansında, membran tekrarsızlığının yokluğunu yansıtan önemli ölçüde daha dik bir artış vardır.Alternatif olarak, uzak kırmızı floresan ile bir karbocyanin nükleik asit bağlayıcı boya GFP ile spektral örtüşme en aza indirmek için propidium iyodür ikame edilebilir. Buna ek olarak, uzak kırmızı boya için daha büyük uyarma katsayısı gürültü oranı ve onarım izin ve onarım kısıtlayıcı koşullar arasında daha iyi bir çözünürlük için daha yüksek bir sinyal sergiler. Bu yordamı denerken, tüm tüplerin denemeden bir gün önce etiketleilmesi önerilir, çünkü bu sizi deney günündeki tüm reaktif hazırlığına hazırlayacaktır.Bu yordamı takiben, görüntü sitometrisi gibi diğer yöntemler ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir, örneğin gözenek oluşturan bir gözenek tüm hücrelere eşit şekilde zarar verir veya bazı hücreler diğerlerinden daha duyarlıdır. Bu teknik, geliştirildikten sonra, gözenek boyutunun farklı hücre tiplerinin onarım verimliliği üzerindeki etkilerini araştırmak için bulaşıcı hastalık ve plazma zarı onarımı alanlarında ki araştırmacıların önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

Bakteriyel Yapışma Memeli Epitel Hücreleri üzerine In Vitro Testi

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Measurement of Factor V Activity in Human Plasma Using a Microplate Coagulation Assay

Bir Mikroplaka Pıhtılaşma Analiz Kullanarak İnsan Plazma Faktör V Aktivitenin Ölçümü

 In response to injury, blood coagulation is activated and results in generation of the clotting protease, thrombin. Thrombin cleaves fibrinogen to fibrin ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro

Ekstraselüler DNA Yayın Yüksek Verimli Ölçme ve İnsan Nötrofiller Kantitatif NET Oluşumu<em&gt; İn Vitro</em

Neutrophil granulocytes are the most abundant leukocytes in the human blood. Neutrophils are the first to arrive at the site of infection. Neutrophils ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Yer Alan Ana Faktörler yüksek verimli tarama mikroskopisi bazlı deneyler<em&gt; Brucella</em&gt; Hela Hücrelerinin Enfeksiyon

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Yüksek verimli Gen Etiketleme içinde<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

Reliable and High Efficiency Extraction of Kidney Immune Cells

Böbrek Bağışıklık Hücreleri Güvenilir ve Yüksek Verimlilik Ekstraksiyon

Immune system activation occurs in multiple kidney diseases and pathophysiological processes.  The immune system consists of both adaptive and innate ...

Implementation of a Permeable Membrane Insert-based Infection System to Study the Effects of Secreted Bacterial Toxins on Mammalian Host Cells

Bir Geçirgen Membran Ekle tabanlı Enfeksiyon Sisteminin Uygulanması memeli konakçı hücreleri üzerinde salgılanan Bakteriyel Toksinler Etkilerinin Eğitim için

Many bacterial pathogens secrete potent toxins to aid in the destruction of host tissue, to initiate signaling changes in host cells or to manipulate ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...