Name: determination of reproductive competence by confirming pubertal onset and performing a fertility assay in mice and rats
Uploaded: 2018-10-13T15:00:00
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Agradezco a los autores que contribuyen a la labor inicial que es la base de esta publicación. Gracias a Aitor Aguirre, Genevieve E. Ryan y Erica L. Schoeller ayuda a preparar el manuscrito. Gracias a Jessica Sora Lee y barbilla de Austin para asistencia técnica con el manuscrito. H.M.H. fue apoyado por Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número R00HD084759.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de uso de Michigan State University y realizadas de conformidad con la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
1. determinar el inicio puberal
<ol><li>Siga las directrices para la ropa, como mínimo, es necesario usar una bata limpia y guantes limpios. Siempre manejar ratones con guantes limpios.</li>
	<li>Preparar el área de trabajo colocando una almohadilla en la mesa.<ol...

<ol>
	<li>Schneider, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+balance+and+reproduction.">Energy balance and reproduction.</a> Physiology and Behavior. 81 (2), 289-317 (2004).</li><li>Walton, J. C., Weil, Z. M., Nelson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+photoperiod+on+hormones,+behavior,+and+immune+function.">Influence of photoperiod on hormones, behavior, and immune function.</a> Frontiers Neuroendocrinology. 32 (3), 303-319 (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility:+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance.">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, (2016).</li><li>Kauffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sexual+differentiation+and+the+Kiss1+system:+Hormonal+and+developmental+considerations.">Sexual differentiation and the Kiss1 system: Hormonal and developmental considerations.</a> Peptides. , (2009).</li><li>Bronson, F. H., Dagg, C. P., Snell, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Reproduction. , (1966).</li><li>Chehab, F. F., Mounzih, K., Lu, R., Lim, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+onset+of+reproductive+function+in+normal+female+mice+treated+with+leptin.">Early onset of reproductive function in normal female mice treated with leptin.</a> Science. , (1997).</li><li>Yoshimura, S., Yamaguchi, H., Konno, K., Ohsawa, N., Noguchi, S., Chisaka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+Preputial+Separation+is+a+Useful+Tool+for+Evaluating+Endocrine+Active+Chemicals.">Observation of Preputial Separation is a Useful Tool for Evaluating Endocrine Active Chemicals.</a> J Toxicologic Pathology. 18, 141-157 (2005).</li><li>Ahima, R. S., Dushay, J., Flier, S. N., Prabakaran, D., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leptin+accelerates+the+onset+of+puberty+in+normal+female+mice.">Leptin accelerates the onset of puberty in normal female mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 99 (3), 391-395 (1997).</li><li>Bohlen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short-day+photoperiod+delays+the+timing+of+puberty+in+female+mice+via+changes+in+the+kisspeptin+system.">A short-day photoperiod delays the timing of puberty in female mice via changes in the kisspeptin system.</a> Frontiers in Endocrinology. 9 (FEB), 1-9 (2018).</li><li>Shahab, M., Mastronardi, C., Seminara, S. B., Crowley, W. F., Ojeda, S. R., Plant, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypothalamic+GPR54+signaling:+A+potential+mechanism+for+initiation+of+puberty+in+primates.">Increased hypothalamic GPR54 signaling: A potential mechanism for initiation of puberty in primates.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2005).</li><li>Hoffmann, H. M., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+population+of+hypothalamic+neurons+govern+fertility:+the+critical+role+of+VAX1+in+GnRH+neuron+development+and+fertility+maintenance.">A small population of hypothalamic neurons govern fertility: the critical role of VAX1 in GnRH neuron development and fertility maintenance.</a> Neuroscience communications. 2, 5-9 (2016).</li><li>Navarro, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Neurokinin+B+in+the+Control+of+Female+Puberty+and+Its+Modulation+by+Metabolic+Status.">Role of Neurokinin B in the Control of Female Puberty and Its Modulation by Metabolic Status.</a> Journal of Neuroscience. 32 (7), 2388-2397 (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Tamrazian, A., Xie, H., P&#233;rez-Mill&#225;n, M. I., Kauffman, A. S., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygous+deletion+of+ventral+anterior+homeobox+(Vax1)+causes+subfertility+in+mice.">Heterozygous deletion of ventral anterior homeobox (Vax1) causes subfertility in mice.</a> Endocrinology. 155 (10), 4043-4053 (2014).</li><li>Kauffman, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kisspeptin+Receptor+GPR54+Is+Required+for+Sexual+Differentiation+of+the+Brain+and+Behavior.">The Kisspeptin Receptor GPR54 Is Required for Sexual Differentiation of the Brain and Behavior.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8826-8835 (2007).</li><li>Teles, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+A+GPR54-activating+mutation+in+a+patient+with+central+precocious+puberty.">Brief report: A GPR54-activating mutation in a patient with central precocious puberty.</a> New England Journal of Medicine. , (2008).</li><li>Korenbrot, C. C., Huhtaniemi, I. T., Weiner, R. 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C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performing+Vaginal+Lavage,+Crystal+Violet+Staining,+and+Vaginal+Cytological+Evaluation+for+Mouse+Estrous+Cycle+Staging+Identification.">Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), 4-9 (2012).</li><li>Hedrich, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , (2012).</li><li>Hoffmann, H. M., Trang, C., Gong, P., Kimura, I., Pandolfi, E. C., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+Vax1+from+Gonadotropin-Releasing+Hormone+(GnRH)+Neurons+Abolishes+GnRH+Expression+and+Leads+to+Hypogonadism+and+Infertility.">Deletion of Vax1 from Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) Neurons Abolishes GnRH Expression and Leads to Hypogonadism and Infertility.</a> Journal of Neuroscience. 36 (12), 3506-3518 (2016).</li><li>Sloboda, D. M., Howie, G. J., Pleasants, A., Gluckman, P. D., Vickers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-+and+postnatal+nutritional+histories+influence+reproductive+maturation+and+ovarian+function+in+the+rat.">Pre- and postnatal nutritional histories influence reproductive maturation and ovarian function in the rat.</a> PLoS ONE. , (2009).</li><li>Manual, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breeding+Strategies+for+Maintaining+Colonies+of+Laboratory+Mice.">Breeding Strategies for Maintaining Colonies of Laboratory Mice.</a> Management. , (2007).</li><li>Kennedy, G. C., Mitra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body+weight+and+food+intake+as+initiating+factors+for+puberty+in+the+rat.">Body weight and food intake as initiating factors for puberty in the rat.</a> The Journal of Physiology. , (1963).</li><li>Sisk, C. L., Foster, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+basis+of+puberty+and+adolescence.">The neural basis of puberty and adolescence.</a> Nature Neuroscience. 7 (10), 1040-1047 (2004).</li><li>Nelson, J. F., Karelus, K., Felicio, L. S., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+influences+on+the+timing+of+puberty+in+mice.">Genetic influences on the timing of puberty in mice.</a> Biology of reproduction. , (1990).</li><li>Nelson, J. F., Felicio, L. S., Randall, P. K., Sims, C., Finch, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+of+estrous+cyclicity+in+aging+C57BL/6J+mice:+I.+Cycle+frequency,+length+and+vaginal+cytology.">A longitudinal study of estrous cyclicity in aging C57BL/6J mice: I. Cycle frequency, length and vaginal cytology.</a> Biology of reproduction. , (1982).</li><li>Falconer, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weight+and+age+at+puberty+in+female+and+male+mice+of+strains+selected+for+large+and+small+body+size.">Weight and age at puberty in female and male mice of strains selected for large and small body size.</a> Genetical Research. , (1984).</li><li>Rodriguez, I., Araki, K., Khatib, K., Martinou, J. C., Vassalli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+vaginal+opening+is+an+apoptosis-dependent+process+which+can+be+prevented+by+the+overexpression+of+Bcl2.">Mouse vaginal opening is an apoptosis-dependent process which can be prevented by the overexpression of Bcl2.</a> Developmental Biology. , (1997).</li><li>Lomniczi, A., Wright, H., Ojeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+female+puberty.">Epigenetic regulation of female puberty.</a> Frontiers in Neuroendocrinology. 36, 90-107 (2015).</li><li>Selmanoff, M. K., Goldman, B. D., Ginsburg, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+serum+luteinizing+hormone,+follicle+stimulating+hormone+and+androgen+levels+in+males+of+two+inbred+mouse+strains.">Developmental changes in serum luteinizing hormone, follicle stimulating hormone and androgen levels in males of two inbred mouse strains.</a> Endocrinology. 100 (1), 122-127 (1977).</li><li>Larder, R., Clark, D. D., Miller, N. L. G., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothalamic+Dysregulation+and+Infertility+in+Mice+Lacking+the+Homeodomain+Protein+Six6.">Hypothalamic Dysregulation and Infertility in Mice Lacking the Homeodomain Protein Six6.</a> Journal of Neuroscience. 31 (2), 426-438 (2011).</li><li>Knight, C. H., Maltz, E., Docherty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+yield+and+composition+in+mice:+Effects+of+litter+size+and+lactation+number.">Milk yield and composition in mice: Effects of litter size and lactation number.</a> Comparative Biochemistry and Physiology -- Part A: Physiology. 84 (1), 127-133 (1986).</li><li>Chahoud, I., Paumgartten, F. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+litter+size+on+the+postnatal+growth+of+rat+pups:+is+there+a+rationale+for+litter-size+standardization+in+toxicity+studies.">Influence of litter size on the postnatal growth of rat pups: is there a rationale for litter-size standardization in toxicity studies.</a> Environmental research. 109 (8), 1021-1027 (2009).</li><li>Pandolfi, E. C., Hoffmann, H. M., Schoeller, E. L., Gorman, M. R., Mellon, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Haploinsufficiency+of+SIX3+Abolishes+Male+Reproductive+Behavior+Through+Disrupted+Olfactory+Development,+and+Impairs+Female+Fertility+Through+Disrupted+GnRH+Neuron+Migration.">Haploinsufficiency of SIX3 Abolishes Male Reproductive Behavior Through Disrupted Olfactory Development, and Impairs Female Fertility Through Disrupted GnRH Neuron Migration.</a> Molecular Neurobiology. , (2018).</li></ol>

El bienestar general de los ratones es crítico para una fertilidad exitoso ensayo21. Cuando se realiza un análisis de fertilidad, es importante controlar no físicamente en los ratones cada día ya que esto puede causar estrés. Además evitar cambios frecuentes de la jaula, ya que también son estresantes. Idealmente se realizará cambios de jaula no más de 1 - 2 veces por semana. Exposición a la luz durante la fase oscura afecta negativamente la reproducción en roedores nocturnos. No se enc...

La transición a través de la pubertad es necesaria para alcanzar la madurez sexual y capacidad reproductiva. La transición de la pubertad y el mantenimiento de la fertilidad en la edad adulta está regulada por el eje reproductivo, también se denomina el eje hipotalámico-pituitario-gonadal (figura 1). El momento del inicio puberal y mantenimiento de la fertilidad es estrictamente regulados por factores internos como ambientales para aumentar las posibilidades de supervivencia de crías y padres1,2. Este protocolo proporciona un enfoque no invasivo para determinar el inicio puberal en ratones y ratas para confirmar la madurez sexual antes de la creación de un estudio de fertilidad para evaluar competencia reproductiva.
Un estudio de fertilidad se realiza en animales sexualmente maduros y puede iniciarse después de que los animales han pasado por la pubertad. Antes del inicio puberal, el eje reproductivo está quieto, y el factor clave de la maduración sexual, hormona liberadora de gonadotropina (GnRH), se libera en la hipófisis en cantidades suficientes para iniciar la pubertad (figura 1). Inicio puberal es un proceso complejo que resulta en mayor liberación de GnRH en la eminencia media. Promueve la GnRH hormona luteinizante (LH) y folículo estimulante (FSH) hormona de la pituitaria, dos hormonas esenciales para la maduración gonadal y función reproductiva (figura 1)3,4,5 .
Insultos al eje reproductivo como resultado fertilidad reducida y pueden también avance o retardo de inicio puberal. Condiciones que influyen en el momento del inicio puberal y competencia reproductiva incluyen la exposición a la endocrina interrumpir productos químicos6,7, cuerpo de aumentar o disminuir peso1,8, cambios en día largo2,9 y mutaciones genéticas10,11,12,13,14,15.
El inicio de la madurez sexual es un paso crítico que necesita ser completada antes de la creación de un análisis de fertilidad. Las ventajas de determinar el inicio puberal, a través de separación prepucial, la abertura vaginal y el primer estro, son las características no-invasiva de estos procedimientos, ya que no requieren sangre o sacrificio de los animales16, 17.
Después se determina el inicio puberal, correctamente un estudio de fertilidad proporcionará información importante sobre la integridad del eje reproductivo y tiene generalmente la segunda ventaja de generar animales experimentales para estudios posteriores (refinamiento) 18. la configuración del estudio de fertilidad se describe en este protocolo puede detectar déficits mayores y menores en capacidad reproductiva en machos y hembras. Principales parámetros evaluados incluyen 1) vez a la primera camada, 2) el número de camadas que se generan en un determinado marco de tiempo y 3) camada tamaño. Por último, se incluyen recomendaciones para el tipo de seguimiento de los estudios que pueden realizarse para identificar la causa del deterioro de la fertilidad.
El protocolo descrito se refiere a los ratones y los datos representativos reflejan el trabajo realizado en ratones transgénicos. Sin embargo, todos los protocolos incluidos son igualmente válidos en ratas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1092">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sterile Cotton Balls</td>
			<td style="width:167px;">Fisher</td>
			<td style="width:280px;">22456885</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Surface protector</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>1420637</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21800-014</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methylene blue&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope Slides</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>29-101</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Optimouse rack with cages</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C89100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bottle Basket&#160;</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C61011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Filtered Cage Tops</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C78210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Optimice Standard Feeder</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C40100SG</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cage Card Holder</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C43251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cage Cards</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>M52010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bottle Assambley</td>
			<td>AnimalCare systems</td>
			<td>C79122P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bed R&#39;Nest Nesting</td>
			<td style="width:167px;">The Andersons</td>
			<td style="width:280px;">BRN4WSR</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1/8&#34; Corn Cob bedding&#160;</td>
			<td style="width:167px;">The Andersons</td>
			<td style="width:280px;">8B</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Standard mouse chow</td>
			<td>Teklad</td>
			<td style="width:280px;">7904 (7004)</td>
			<td style="width:429px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scale</td>
			<td>VWR</td>
			<td style="width:280px;">10205-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Polypropylene Beaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-955-111F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of reproductive competence by confirming pubertal onset and performing a fertility assay in mice and rats

Evaluación de la capacidad reproductiva es fundamental para entender el impacto de un tratamiento o manipulación genética en el eje reproductivo, que también se denomina el eje hipotalámico-pituitario-gonadal. El eje reproductivo es un integrador clave de entrada ambiental e interna adaptándose a las condiciones favorables para la reproducción de la fertilidad. Antes de embarcarse en un estudio de fertilidad en ratones y ratas, la madurez sexual se evalúa para excluir la posibilidad de que los fenotipos reproductivos observados son ocasionados por retraso o ausencia de inicio puberal. Este protocolo describe un enfoque no invasivo para determinar el inicio puberal en varones a través de la determinación de separación prepucial y en las hembras a través de la abertura vaginal y el primer estro. Después de la confirmación de la terminación de la pubertad y el logro de la madurez sexual, se puede iniciar un estudio de fertilidad. El procedimiento describe las condiciones de crianza óptimo para ratones y ratas, cómo montar un estudio de fertilidad y qué parámetros para evaluar y determinar si el tratamiento o la canceladura del gene tiene un impacto sobre la fertilidad.

Los resultados presentados son de dos modelos de ratón transgénico diferente donde la transcripción factor Ventral anterior caja homeo 1 (Vax1) se ha eliminado en todo el cuerpo en un alelo, aquí conocido como heterocigoto ratones (HET)13o Vax1 ha sido borrado condicional dentro de GnRH neuronas22, aquí llamado KO condicional (cKO). Antes de establecer el estudio de fertilidad, es importante confirmar Inicio puberal en...

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Determination of Reproductive Competence by Confirming Pubertal Onset and Performing a Fertility Assay in Mice and Rats

Determinación de la capacidad reproductiva por confirmar Inicio puberal y de realizar un análisis de fertilidad en ratones y ratas

Muchos tratamientos y mutaciones genéticas influyen en la sincronización de la madurez sexual y la fertilidad. Este protocolo describe un método no invasivo para evaluar el inicio puberal en ratones y ratas antes de establecer un estudio de fertilidad en animales sexualmente maduros.

Assessment of reproductive competence is critical for understanding the impact of a treatment or genetic manipulation on the reproductive axis, also ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo reproductivo, como cómo determinar la aparición puberal en ratones y ratas a través de la separación preputial, la apertura vaginal y el establecimiento de la primera estrus antes de realizar un estudio de fertilidad. La principal ventaja de esta técnica es que al establecer el inicio puberal utilizando el enfoque no invasivo demostrado, es posible seguir y realizar un estudio de fertilidad en animales que son sexualmente maduros. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de déficits en la reproducción, causados por mutaciones genéticas o tratamientos susceptibles a afectar la competencia reproductiva, como los productos químicos disruptores endocrinos.Aunque este método puede proporcionar información sobre la competencia reproductiva en ratones, también se puede aplicar a otros sistemas modelo, como ratas y hámsters. La demostración visual de este método es crítica, ya que requiere buenas y delicadas habilidades de manejo animal. Es particularmente importante sostener los ratones correctamente para la siguiente identificación visual de la separación preputial y la abertura vaginal.Para preparar el área de trabajo, coloque una almohadilla sobre la mesa. A continuación, coloque una tapa limpia de la jaula del ratón con la rejilla hacia arriba, en la almohadilla. A continuación, configure una escala en el área de trabajo.Coloque un vaso limpio de 500 a 1000 mililitros en la báscula y tara. A continuación, coloque una hoja junto al área de trabajo para registrar los datos. Después de esto, coloque la jaula del ratón en el área de trabajo.Abra la jaula y retire la tapa, la botella de agua y el soporte de alimentos a la mesa. Mientras sostiene el ratón por la cola, colóquelo en la parte superior de la jaula del ratón. Mientras mantiene la sujeción de la cola, permita que el ratón explore la cuadrícula de la parte superior de la jaula.Tire suavemente de la cola hacia atrás y acérquese la otra mano a la piel cerca del cuello y las orejas. Sujete la piel suelta entre los hombros y el cuello con el pulgar y el dedo índice. A continuación, agarre la piel en la parte posterior con los dedos restantes y sostenga el ratón presionando suavemente contra la mano.Con la mano libre, empuje suavemente la piel alrededor del pene hacia atrás. En la separación preputial, la piel preputial se desliza hacia atrás, exponiendo el pene del glande. Después del examen, registre la presencia o ausencia de separación preputial.Después de esto, pesar el ratón y registrar su peso. A continuación, vuelva a introducir el ratón en la jaula de la carcasa sosteniendo el vaso de precipitados sobre el suelo de la jaula y permitiendo que el ratón salga por sí solo. Coloque una bola de algodón, un vaso de precipitados grande y una botella de agua estéril en el área de trabajo.Vierta agua estéril en el vaso de precipitados. A continuación, humedúntale la bola de algodón con el agua estéril en el vaso de precipitados y colóquela junto a la parte superior de la jaula limpia. Coloque la jaula del ratón en el área de trabajo.A continuación, transfiera el ratón a la parte superior de la jaula sosteniéndolo por la base de su cola. Tire suavemente de la cola del ratón para fomentar un movimiento hacia adelante por el ratón. Después de esto, levante la cola mientras sostiene las caderas con tres dedos.Limpie suavemente la vulva con la bola de algodón humidificado, luego examine la vulva para determinar si la vagina está completamente abierta. Registre si se ha producido una abertura vaginal. A continuación, pesar el ratón y devolverlo a la jaula de casa.Prepare una jaula limpia de ratón con tapa, agua, alimentos, ropa de cama y material de anidación para cada par de ratones reproductores. A continuación, rellene las tarjetas de jaula con la información necesaria. Coloque la jaula de ropa de cama preparada en una mesa limpia, luego introduzca lentamente una mano enguanada en la jaula del ratón y déjela en la jaula durante un corto período de tiempo.Acérquese lentamente a los ratones con la mano enguanda. Cuando los ratones corran sobre la mano, agarre la cola de un ratón entre el pulgar y el dedo índice, luego levante el ratón por la cola. El ratón puede ser sostenido por la cola sin soporte del cuerpo durante un máximo de dos a tres segundos.Coloque el ratón en la jaula de cría preparada, luego cierre la jaula después de asegurarse de que los ratones machos y hembras tengan alimento, agua y material de anidación. Utilizando el método presentado, se estudiaron dos modelos de ratón transgénicos diferentes. La apertura vaginal y la separación preputial ocurrieron a la misma edad y peso tanto en los ratones heterocigotos como en los ratones de control.Por el contrario, la apertura vaginal y la separación preputial se retrasaron significativamente en las mujeres y los hombres noqueadores condicionales, y se asociaron con el aumento del peso corporal. A las 4,5 semanas de edad, los controles femeninos y los ratones noqueadores condicionales tenían un peso corporal comparable, mientras que los machos nocaut condicionales eran ligeramente más pesados que los controles. Esto indica que el retraso en la apertura vaginal y la separación preputial de los ratones noqueadores condicionales no se asoció con un retraso en el aumento de peso.Después de completar el inicio puberal, el estudio de fertilidad se inició a la edad de 10 a 16 semanas. Tanto los ratones heterocigoto machos como hembras eran sub-fértiles. Las hembras de heterocigoto generaron menos camadas en el estudio de tres meses, y tanto los ratones heterocigotos masculinos como hembras generaron camadas más pequeñas.Para ilustrar la importancia de confirmar el inicio puberal antes de establecer un ensayo de fertilidad, se evaluó la competencia reproductiva en ratones nocaut condicionales. Durante el estudio de fertilidad de 70 días, ni los nocauts condicionales ni las mujeres generaron camadas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar manejar a los ratones con cuidado y mantener la calma mientras se acerca y maneja a los animales.Después de este procedimiento, otros métodos como la medición de los niveles de hormonas sexuales circulantes se pueden realizar para responder preguntas adicionales, como si la infertilidad u otra subfertilidad fue causada por testosterona anormal, estrógeno, hormona estimulante del folículo, y los niveles de hormona luteinizante. No olvide que trabajar con ratones puede ser peligroso debido al riesgo de morder y desarrollar alergias. Para reducir la exposición, siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio, y un manejo cuidadoso de los ratones durante la realización de este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biology

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Investigación

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