Name: harvest of endothelial cells from the balloon tips of swan-ganz catheters after right heart catheterization
Uploaded: 2019-01-23T14:30:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke legene og støtte ansatte i tjenesten avansert hjertesvikt og pulmonal hypertensjon Allegheny General Hospital for levering av hundrevis av kateter prøver over flere år som lettet det optimalisering av denne metoden.

Alle studiene beskrevet i denne artikkelen ble godkjent av institusjonelle gjennomgang styret Allegheny helse nettverket. Alle pasienter gitt samtykke før administrasjonen av beroligende midler og de ble identifisert av tildeles en studere antallet.
1. sengen samling
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Det er viktig å indusere kaldt stasis i cellene å bevare deres i situ biologiske fenotypen. Denne protokollen innebærer håndtering av blod og celler fra mennesker og derfor universell forholdsregler bør overholdes.
<ol><li>Etter tilbaketrekning av kateter av skjeden, umiddelbart fordype kateter i et 50 mL sentrifuge rør som inneholder 40 mL kjølt sterilt saltvann. Swirl kateter flere ganger å fjerne blod og tømme linjen om nødvendig å fjerne blod beholdt i linjen.</li>
	<li>Klipp av den distale 5 cm cath tips og la den falle i 50 mL sentrifuge røret som inneholder kjølt saltvann. Umiddelbart fjerne cath spissen med tang og overføre den til en 15 mL sentrifuge rør som inneholder 15 mL av endothelial celle (EC) vekst medium.</li>
	<li>Seal røret, plassere den på is og overføre til laboratoriet for å klargjøre for behandling eller frakt. Det er viktig at ballongen forblir midt i middels, så sørg for at det er minimal headspace i 15 mL tube av fylle den helt med EF oppblomstringen medium.</li>
	<li>Prosessen prøven umiddelbart ved fortsetter til trinn 2.1 eller segl og skipet prøven på våt is over natten for behandling i et laboratorium dyktig i denne protokollen. Hvis cellene til slutt skal brukes for cellekultur, er det anbefaler at cath spissen behandles umiddelbart på samme sted som den ble samlet inn.</li>
</ol>2. celle Harvest
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Cellene er i kalde stasis, og det er viktig å unngå oppvåkning dem før de er klare til å være fast eller kulturperler. Denne hele protokollen skal utføres i laminær strømning hette, bruker sterilt instrumenter, hvis ultimate hensikten er høstet PAECs kultur. Hvis kulturen ikke er planlagt (f.eks flow cytometri analyse), er det ikke nødvendig å observere sterilt forholdsregler.
<ol><li>Legge til 5 mL av cellen avdeling løsning slik 15 mL sentrifuge; Plasser på isen.</li>
	<li>Trekke 1 mL av EC media fra den gjenværende i sengen samling røret i 1 mL sprøyte.</li>
	<li>Fullføre trinnene 2.3 gjennom 2.5. Grep det kutte slutten av kateter spissen med hemostats.</li>
	<li>Nøye inn nålen av 1 mL "hvit" hullet overfor guidekabelen ("black hole"). Ta stor forsiktighet for å unngå skade med nålen.</li>
	<li>Overføre cath spissen til 15 mL sentrifuge røret som inneholder cellen avdeling løsningen.</li>
	<li>Økning av ballongen, være forsiktig med å briste. blåse ballongen med ca 200 µL av medier fungerer bra.</li>
	<li>Tillate kateter å sitte i cellen avdeling løsning på is 5 min med ballongen oppblåst. Hvis boblen deflates på egen hånd under 5 min incubation, er akseptabel.</li>
	<li>Hell innholdet i 15 mL sentrifuge røret i 100 mm parabolen. Plass ballongen i cellen avdeling løsningen "Dam".</li>
	<li>Skrap oppblåst ballong med cellen skraper. Celle-skraper kan trekkes rundt boblen i en sirkulær bevegelse eller en børsting bevegelse. Fokus på "polakker" på ballongen, der den møter kateter. Kontroller at celle skrapen kontakter hele overflaten av ballongen minst to ganger. Skyll celle skrapen i cellen avdeling løsningen "Dam" regelmessig.</li>
	<li>Deflate ballongen og skrape den med en børsting bevegelse. Skyll celle skrapen i cellen avdeling løsningen "Dam".</li>
	<li>Kast cath tips, nål og celle skrapen i riktig avfallsbeholderen.</li>
	<li>Hell celle avdeling løsningen inneholder cellen høsting inn i et 50 mL sentrifuge rør. Riste den samling rør og hell gjenværende media fra samlingen røret i samlet prøven også.</li>
	<li>Sentrifuge prøven på 650 x g ved 4 ° C i 10 min. Det er viktig å merke seg at ofte pellets ikke vil bli sett. Det kan være nyttig å markere stedet der pellets ville bli sett, hvis synlig, å unngå aspirating av pellets i tilfelle det er for liten til å bli sett. Merk: Normalt er pellets bare sett når prøven er forurenset av blod. Blod forurensning er uvesentlig for ultimate harvest produktet fordi blod ikke binde CD146 perler og vasker gjennom kolonnen. Omfattende tester har vist at bestemt merke 1,5 mL microcentrifuge rør i Tabellen for materiale minimerer celle tap i forhold til andre rør brukes under protokollen optimalisering.</li>
	<li>Nøye Sug opp media, og unngå forstyrre eller aspirating pellet.</li>
</ol>3. celle rensing
Merk: Alt i denne protokollen bør gjøres på is, med pre kjølt løsninger. Cellene er i kalde stasis, og det er viktig å unngå oppvåkning dem før de er klare til å være fast eller kulturperler.
<ol><li>Resuspend pellet i 1 mL av kjølt røde blodlegemer lysis løsning, og overføre den til en 1,5 mL microfuge rør; forsiktig rock i 10 min på 4 ° C.</li>
	<li>Sentrifuge for 5 min på 500 x g og 4 ° C. Sug opp RBC lysis løsningen.</li>
	<li>Resuspend pellet i 60 μL PBS, 20 μL FcR blokkering og 20 μL av anti-CD146 microbeads. Inkuber i 15 min på 4 ° C.</li>
	<li>Legg 1 mL av kjølt PBS. Sentrifuge for 5 min på 500 x g og 4 ° C. Sug opp nedbryting og resuspend pellet i 1 mL av kjølt PBS.</li>
	<li>Plassere en magnetisk LS-kolonne på en magnetisk rack (se Tabell for materiale for bestemte kommersielle identiteten til disse elementene) i romtemperatur. Prime kolonne ved å legge til 1 mL av PBS og la hele volumet å strømme gjennom. Kast gjennomflytsenhet.</li>
	<li>Plass prøven i kolonnen magnetisk. Kast gjennomflytsenhet.</li>
	<li>Vask kolonnen med 3 mL kjølt PBS tre ganger. Kast gjennomflytsenhet fra hver vask.</li>
	<li>Legge 3 mL kjølt PBS slik 15 mL sentrifuge. Fjerne kolonnen magnetiske fra magnet, hell i 3 mL PBS fra 15 mL sentrifuge røret i kolonnen og raskt plassere kolonnen i sentrifuge røret å fange gjennomflytsenhet. Umiddelbart stupe med stempelet leveres med kolonnen. Prøven er nå renset, klar for fiksering/flekker eller kultur.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2015+ESC/ERS+Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+hypertension:+The+Joint+Task+Force+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Pulmonary+Hypertension+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+and+the+European+Respiratory+Society+(ERS):+Endorsed+by:+Association+for+European+Paediatric+and+Congenital+Cardiology+(AEPC),+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation+(ISHLT).">2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT).</a> European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).</li><li>Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvest+of+pulmonary+artery+endothelial+cells+from+patients+undergoing+right+heart+catheterization.">Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization.</a> Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).</li><li>Benza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+expression+of+Bcl-2+in+pulmonary+artery+endothelial+cells+associates+with+pulmonary+arterial+hypertension+relative+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction.</a> Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).</li><li>Bull, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+endothelial+cells+in+pulmonary+hypertension.">Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).</li><li>Kaneko, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+reaction+products+of+nitric+oxide+as+quantitative+markers+of+primary+pulmonary+hypertension.">Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).</li><li>Rothman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvenous+procurement+of+pulmonary+artery+smooth+muscle+and+endothelial+cells+using+a+novel+endoarterial+biopsy+catheter+in+a+canine+model.">Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).</li><li>Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+medicine+and+personalising+therapy+in+pulmonary+hypertension:+seeing+the+light+from+the+dawn+of+a+new+era.">Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era.</a> European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).</li><li>Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+Pulmonary+Arterial+Hypertension:+Evolving+Therapeutic+Strategies.">Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).</li><li>Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+(Mel-CAM),+an+adhesion+marker+of+endothelial+cells,+is+a+novel+marker+of+lymphocyte+subset+activation+in+normal+peripheral+blood.">CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood.</a> Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).</li><li>Elshal, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+effector+memory+lymphocytes+identified+by+CD146+having+a+distinct+immunophenotypic+and+genomic+profile.">A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile.</a> BMC Immunolology. 8, 29 (2007).</li><li>Newman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1+(CD31)+cloning+and+relation+to+adhesion+molecules+of+the+immunoglobulin+gene+superfamily.">PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily.</a> Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).</li></ol>

MJP og RLB er oppfinnere på patenter hevde deler av metodene som er beskrevet.

Teknikken er beskrevet i denne artikkelen er best verdsatt i sammenheng med tidligere eksperimentelle paradigmene for å studere lunge vaskulære endotelet. Tidligere forsøk på å hente PAECs fra mennesker har vært begrenset til explanted/cadaveric lungene5 og en kortvarig forsøk på å utvikle et kateter kan lungearterien biopsi6. Som nevnt i en fersk gjennomgang7, kjennetegnes stede teknikken fra lunge vev harvest av dens evne til å hente PAECs fra en levende menneske, og å gjøre det på flere tidspunkt i progresjon av sykdommen eller terapi. Det bør imidlertid bemerkes at en følgesvenn teknikk er nylig rapportert der indusert pluripotent stamceller (IPSCs) kan transdifferentiated i PAECs4,5. Denne teknikken gir rike kulturer av pasient-spesifikke PAECs og lar studie av virkningene av pasient-spesifikke genetisk bakgrunn på PAEC biologi. Til tross for disse fordelene gi disse IPSC-avledet PAECs ikke opplysninger om samspillet mellom lokale microenvironment og pasient-spesifikke genetisk bakgrunn. Vår egen gruppe har presentert den oppfatning at de "cath tips" og IPSC teknikker er vil være synergistisk fremme feltet8.
I denne nåværende og historiske sammenheng bemerkes begrensninger av denne teknikken. Først er det viktig å merke seg at rentene av PAECs fra denne metoden kan variere betraktelig. Antagelig pasient-, sykdom state - og lege-spesifikke faktorer bidrar til denne variasjon, som protokollen inneholder trinn som forventes å medføre store kildematerialet. Tabell 1 viser representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører. Andre cellen rentene er generelt lav, og sin levedyktighet for kultur har vist seg for å være lavere, men i våre hender. Mens tidligere har vi vokst kulturer av PAECs ved hjelp av denne metoden1, vi antar de resultatene representerer redningen av et delsett av progenitor celler etter die-off over det meste av prøven og er bare midlertidig vellykket i våre hender. For eksempel er det ikke uvanlig å finne bare noen få dusin tilhenger PAECs i kultur morgenen etter en avling er belagt. Ofte overleve disse mikro-kulturer ikke til utvidelse. Videre arbeid er nødvendig for å optimalisere denne protokollen på en måte som vil tåle levedyktigheten til PAECs og deres forhold i kultur å oppnå ønsket sikte på overføring av pasient-spesifikke PAEC avlinger. Til slutt, CD146 positive utvalget vi har tilpasset kan ikke utelate forurensning med andre CD146 + celler, som sirkulerer endotelceller4, pericytes, glatte muskelcellene og sjeldne CD146 + T celler9,10. Likevel, disse cellene antas å være svært få i prøver samlet på denne måten, og CD146 er betydelig mer spesifikt for denne protokollen enn andre cellen markører av endotelceller som CD31 (som er også til stede på en rekke blodbårne celler inkludert blodplater11). Alle fremtidige forbedringer å bedre spesifisitet bør balanseres mot deres potensielt negative innvirkning på avkastning.

Gjeldende amerikanske og europeiske retningslinjer krever riktig hjerte catheterization for diagnostisering av pulmonal hypertensjon1. Leger og forskere søker å forstå denne sykdommen ønsker biologiske prøver fra er lunge blodkar å utfylle hemodynamic dataene som er samlet under RHC. Dessverre risikoen forbundet med lunge vaskulær biopsi er svært høy, og derfor biologiske prøver av lunge blodkar er sjelden hvis noen gang fått fra levende pasienter som gjennomgår RHC. Mens mye innsikt har fått fra lunge vaskulær vev hentes fra cadaveric eller explanted lungene, disse prøvene er ikke reflektere biologi PH sykdommen prosessen som den utfolder seg i en levende pasient. I 2013 rapportert vi først at lungearterien endotelceller (PAECs) er blottet fra greinene av lungearterien fysisk kontakt med tipsboblen av Swan-Ganz kateter under RHC og kan gjenopprettes i små tall fra kateter tips etter prosedyren2.
Denne artikkelen illustrerer vår teknikk for fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter høyre hjerte catheterization. Hittil, har metodikk for å utføre denne harvest teknikken blitt beskrevet i tilstrekkelig detalj i litteraturen å sikre ensartet resultater mellom laboratorier utføre teknikken. Denne artikkelen er ment å overvinne denne mangel, tilbyr visualisert demonstrasjon av teknikken, fra sengen samling av kateter tips til det endelige produktet av renset CD146 + endotelceller. Denne teknikken bør hjelpe fremme forskning i pathobiology av ulike etiologies av PH, og muligens resultere i utviklingen av nye diagnostiske analyser å utfylle hemodynamic data samlet under RHC.
Betydningen av denne teknikken til lunge vaskulær medisin og forskning er at det gir tilgang til et øyeblikksbilde av biologi lunge endotelet i situ og i motsetning til tidligere studier på explanted eller cadaveric lungene, representerer ikke et sluttpunkt for emnet lunge. Nylig vi har vist at en anti-apoptotisk biomarkør i disse cellene kan ha nytte i mer presist phenotyping relaterte varianter av pulmonal hypertensjon3. Avkastningen av celler innhentet er relativt liten, ~ 5, 000-25,000 PAECs per prøve, og disse cellene er vanskelig (men ikke umulig) å kultur. Vi mener at smarte leger og forskere vil finne synergier mellom disse følgesvenn teknikker for å fremme lunge vaskulær forskning, diagnostikk og prognostics.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">100mm culture dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">NC9385690</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:145px;">Midsci</td>
			<td style="width:123px;">C15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">16% Formaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">PI28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:145px;">Midsci</td>
			<td style="width:123px;">C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Accutase</td>
			<td style="width:145px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Endothelial Cell Growth media</td>
			<td style="width:145px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Forceps</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Hemostat</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">LoBind microfuge tube</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-698-794&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi CD146 beads</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-093-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi FCR blocker</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi LS columns</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi magnet</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td>MidiMACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">PBS</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">BP2438-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Scissors</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Syringes</td>
			<td style="width:145px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest of endothelial cells from the balloon tips of swan-ganz catheters after right heart catheterization

En rekke patologi føre til pulmonal hypertensjon (PH), som er definert som mener lungearterien presset overstiger 25 mmHg på resten. Videre diagnostisere og behandle PH, gjennomgår pasienter gjentatte høyre hjertet catheterizations (RHC) der en svane-Ganz kateter er rykket inn i en gren av lungearterien og en ballongen er oppblåst for å kile kateter spissen. Denne artikkelen beskriver en protokoll der lungearterien endotelceller (PAECs) kan være høstet fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter RHC og renset med en anti-CD146 affinitet kolonnen teknikk å rense antatte PAECs. Disse cellene kan brukes til å gi en i situ øyeblikksbilde av biologiske lunge blodkar endotelet å utfylle hemodynamic mål oppnås under RHC. Høstes og renset PAECs kan brukes for enten cellekultur eller etterfølgende analytisk analyser som flyt cytometery.

Denne protokollen gir rensing av celler, svane-Ganz kateter tips etter høyre hjerte catheterization, som binder seg til en CD146 utvalg kolonne og forover/side scatter profiler som er utvisket fra kulturperler primære menneske lunge arterie endotelceller (figur 1). Gitt at kateter ballongen er i fysisk kontakt med bare introducer skjede (en celle-fritt materiale), lungearterien fartøyet veggen, og blodet, data er tilgjengelig her for å demonstrere at disse cellene ikke er utledet fra blodet (figur 2) , og derfor er det antatt at de er faktisk utledet fra lungearterien fartøyet veggen. Leseren bør merke seg at de anti-CD146 magnetiske perlene som brukes til å rense cellene forblir tilhenger til celleoverflaten etter prosedyren, og dermed det er suboptimal å forsøke å analysere cellen høsting for CD146 som en markør av endotelceller. CD31 eller andre endothelial markører ville antagelig være tilgjengelig for merking og kan anses som alternativer.
Nøkkelelementer i denne protokollen har blitt identifisert som kan påvirke resultatene. Først er det viktig å skylle kateter spissen på sengen for å fjerne blod. Figur 3 viser siden xy (SSC) / fremover xy (FSC) profiler av gjennomflytsenhet anti-CD146-kolonnen for en prøve som var riktig skylt og en som ikke var. Kolonnen vises blod-avledet celler hindre høsting (figur 2), men det skyllingsprosess trinnet sikrer minimal mulig smitte sirkulere endotelceller (som er normalt finnes på < 50 celler/mL blod4). Vi har observert at eluate fra CD146 kolonnen er helt klart, selv i svært blodig kateter tips prøver. Dette tyder på at kolonnen er kjøpedyktig hånd betydelige mengder blod uten tilstopping eller beholde ikke-CD146 + bloodborne celler.
Det andre er det viktig å blåse tipsboblen minst en gang i cellen avdeling løsning/mobiltelefon skraper trinn. Gitt at de antatte PAECs på tipsboblen være tilhenger tross saltvann skylling steg, det synes kan de være delvis fanget av folder i vinyl boble som det er deflatert i forberedelse til fjerning av pasienten. Antagelig frigjør inflasjon trinnet PAECs, la dem forsiktig skrapes bort. Det er ikke umiddelbart klart man kan teste denne hypotesen, men lavere avkastning av celler er observert når boblen er ikke oppblåst (data ikke vist).
Endelig, er det viktig å merke seg at rentene av PAECs fra denne metoden kan variere betraktelig. Antagelig pasient-, sykdom state - og lege-spesifikke faktorer bidrar til denne variasjon, som protokollen inneholder trinn som forventes å medføre store kildematerialet. Tabell 1 viser representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig1.jpg"> Figur 1 : SSC/FSC profiler av en typisk kateter ballong tips høst fra en lunge hypertensjon pasient (A) og et tilsvarende antall celler fra et kommersielt ervervet primære menneskelige PAEC kultur (B). Begge eksemplene var renset med kolonnen anti-CD146, fast og permeablized som beskrevet i protokollen, før FACS analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig2.jpg"> Figur 2 : SSC/FSC profiler av en typisk kateter ballong tips høst fra en lunge hypertensjon pasienten (A) og føljetong 1:10 fortynning av Ficoll forløpning-renset menneskelige buffy pels (B, C, D). (A) var renset med anti-CD146 kolonnen mens (B-D) var ikke. Alle cellen prøver ble fast og permeablized som beskrevet i protokollen, før FACS analyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig3.jpg"> Figur 3 : SSC/FSC profiler av et kateter ballong tips harvest fra en lunge hypertensjon pasient i blodet som var synlig på kateter spissen før behandling. Før trinnet 3.1 av protokollen prøven ble delt og lyseringsbuffer ble lagt til en aliquot og trukket fra den andre. (A) og (C) viser SSC/FSC profiler av lysed prøven, begge cellene beholdes av kolonnen (A) og gjennomflytsenhet kolonnen. (B) og (D) Vis SSC/FSC profiler av unlysed prøven, begge cellene beholdes av kolonnen (B) og gjennomflytsenhet fra kolonnen (D). Vi konkludere med at lysis fjerner noen, men ikke alle av leukocytter men at leukocytter beholdes ikke i kolonnen og er derfor utelukket fra siste innhøstingen, uansett lysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Eksempel</td>
			<td>Dato</td>
			<td>Cellen avkastning</td>
			<td>Diagnose</td>
		</tr>
<tr>
<td>433</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7364</td>
			<td>PH-interstitiell lungesykdom</td>
		</tr>
<tr>
<td>279</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7130</td>
			<td>PH-sklerodermi</td>
		</tr>
<tr>
<td>432</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3976</td>
			<td>PH-multifaktoriell</td>
		</tr>
<tr>
<td>431</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3634</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>390</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>5666</td>
			<td>PAH</td>
		</tr>
<tr>
<td>423</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>9024</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>272</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>7098</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>408</td>
			<td>2/27/2018</td>
			<td>4784</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>403</td>
			<td>2/14/2018</td>
			<td>10376</td>
			<td>PH-ASD + mitral sykdom</td>
		</tr>
<tr>
<td>396</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>4890</td>
			<td>HFpEF-IPCPH</td>
		</tr>
<tr>
<td>397</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>7672</td>
			<td>Normal hemodynamics</td>
		</tr>
<tr>
<td>318</td>
			<td>1/4/2018</td>
			<td>7002</td>
			<td>HFrEF-LVAD finnes</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: CD146 + gir fra en rekke PAEC avlinger. Representant CD146 + gir en rekke PAEC avlinger utnytte kateter tips fra en rekke pasienter med ulike sykdom stater pulmonal hypertensjon og en rekke lege operatører.

Watch this Scientific Journal Video about Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization at JoVE.com

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

Høsting av endotelceller fra tipsballonger av Swan-Ganz katetre etter høyre hjerte Catheterization

Denne protokollen beskriver fjerning og rensing av lungearterien endotelceller (PAECs) som følger tipsballonger av Swan-Ganz katetre mens de er klemt fast i lungearterien under høyre hjerte catheterization og forbli tilhenger til den deflatert ballong etter fjerning fra pasientens kropp.

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

Denne metoden gir en ny tilnærming til å ta opp viktige spørsmål innen pulmonal vaskulær forskning, for eksempel den molekylære banen til mekanismer for intimal spredning i pulmonal hypertensjon. Den største fordelen med denne metoden er at den gir et minutt cellulær biopsi av lungevaskulær endotelet uten ekstra risiko for pasienten. Å demonstrere prosedyren vil være Miss Reina Perez, vår kliniske koordinator, og Dr.Phillip Gallo, lederen av laboratoriet mitt.Etter at kateteret er trukket ut av hylsen, dypp det umiddelbart i et 50 milliliter sentrifugerør som inneholder 40 milliliter kjølt steril saltvann. Virvle kateteret flere ganger for å fjerne blod, og skyll linjen om nødvendig for å fjerne blodet som er beholdt i den. Klipp av de distale fem centimeterne av kateterspissen, og la den falle inn i sentrifugerøret.Bruk tang til umiddelbart å fjerne spissen, og overføre den til en 15 milliliter sentrifuge rør som inneholder 15 milliliter endotelcellevekst medium. Deretter forsegler du røret. Plasser røret på is, og overfør det til laboratoriet.Enten behandle prøven umiddelbart eller pakke prøven på våt is for over natten frakt til laboratoriet der behandlingen vil skje. Det er avgjørende at ballongen forblir nedsenket i mediet. Så sørg for at det er minimal hodeplass i 15 ml-røret ved å fylle det helt med endotelcellevekstmedium.Først legger du til fem milliliter celleavløsningsløsning til et rent 15 milliliter sentrifugerør. Legg dette røret på is. Bruk en en milliliter sprøyte, tegn en milliliter endotelcellemedie fra det som forblir i nattbordet samlingsrør.Sett forsiktig nålen på den ene millilitersprøyten inn i det hvite hullet på motsatt side av føringsledningen. Plasser kateterspissen i det 15 milliliter sentrifugerøret som inneholder celleavløsningsløsningen. Blås ballongen med ca 200 mikroliter media, vær forsiktig så du ikke sprekker den.Plasser røret på is, og la kateteret sitte i celleavløsningen i fem minutter med ballongen oppblåst. Etter dette, hell innholdet i røret i en 100 millimeter tallerken, og pass på at ballongen er plassert i denne dammen av celleavløsning. Bruk en celleskraper til å skrape den oppblåste ballongen, fokusere på ballongpolene der den møter kateteret.Deretter må du sørge for at celleskraperen kontakter hele overflaten av ballongen minst to ganger, og skyll med jevne mellomrom celleskraperen i celleavløsningen. Tøm ballongen og skrap den med en børstebevegelse. Skyll deretter celleskraperen i dammen av celleavløsning.Kast kateterspissen, nålen og celleskraperen i en passende avfallsbeholder. Hell celleavløsningen som inneholder cellehøsten i et 50 milliliter sentrifugerør. Rist oppsamlingsrøret, og hell de resterende mediene fra det i den innsamlede prøven også.Sentrifuger prøven ved 650 ganger G, og fire grader Celsius i 10 minutter. Aspirer mediet, vær forsiktig med å ikke forstyrre eller aspirere pelleten. Resuspend pellet i en milliiter av kjølt røde blodlegemer lysis løsning, og overføre denne suspensjonen til en 1,5 mikroliter sentrifuge rør, og forsiktig rocke røret på fire grader celsius i 10 minutter.Sentrifuger røret ved 500 ganger G, og fire grader celsius i fem minutter. Deretter aspirerer du røde blodlegemer lysis løsning. Resuspend pellet i en løsning som inneholder PBS, FcR blokkering, og anti-menneskelige CD-146 mikroperler.Inkuber ved fire grader celsius i 15 minutter. Tilsett en milliliter kjølt PBS. Sentrifuge ved 500 ganger G og fire grader celsius i fem minutter.Aspirer den overnaturlige og resuspend pellet i en milliliter kjølt PBS. Deretter plasserer du en magnetisk LS-kolonne på et magnetisk stativ ved romtemperatur. Prime kolonnen ved å legge til en milliliter PBS, og la hele volumet strømme gjennom.Kast gjennomstrømningen. Legg prøven på den magnetiske kolonnen, og kast gjennomstrømningen. Vask kolonnen tre ganger ved hjelp av tre milliliter kjølt PBS for hver vask.Kast all denne gjennomstrømningen. Tilsett deretter tre milliliter kjølt PBS til et 15 milliliter sentrifugerør. Fjern magnetkolonnen fra stativet, og hell PBS fra røret inn i kolonnen.Plasser raskt kolonnen i sentrifugerøret for å fange gjennomstrømningen. Stup straks med stempelet som følger med kolonnen. Prøven er nå renset, og klar for fiksering, farging eller kultur.I denne studien renses celler fra Swan-Ganz katetertips etter høyre hjertekateterisering. Disse cellene binder seg til en CD-146 utvalgskolonne, og har fremover- og sidespøsprofiler som ikke kan skilles fra kultiverte primære menneskelige lungearterie endotelceller. Siden kateterballongen bare er i fysisk kontakt med innføringshylsen, lungearteriekarveggen og blodet, og cellene er demonstrert for ikke å komme fra blodet, antas det derfor at de stammer fra lungearteriekarveggen.Etter prosedyren høstet celler kan analyseres ved en rekke metoder, for eksempel flyt cytometri, qPCR, sekvensering, og proteomix. Celleavlinger er for lave for konvensjonelle vestlige blot, men lav input blotting metoder kan vurderes. Celler kan dyrkes, men dette er veldig vanskelig, og det lykkes ikke alltid i våre hender.Hvis kultur skal forsøkes, er det viktig å minimere intervallet mellom innsamling av cath spissen fra pasienten, og den endelige rensing og plating trinn, og for å sikre at prøven holdes kald gjennom alle håndteringstrinn av metoden. Ikke glem at denne protokollen innebærer å jobbe med menneskelig blod og vev. Universelle forholdsregler må overholdes.Spesielt er det et skritt tidlig i protokollen som innebærer å sette inn en skarp nål i den kuttede enden av kateterspissen som er forurenset med pasientens blod. Glem aldri at kateterspissen må holdes med hemostater i løpet av dette trinnet, ikke med fingrene, for å unngå risikoen for en nålepinne.

Research

JoVE Journal

Medicine

Basic Surgical Techniques in the G&ouml;ttingen Minipig: Intubation, Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion

Basic Surgical Techniques in the GÃƒÆ’Ã‚Â¶ttingen Minipig: Intubation, Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion

The emergence of the G&ouml;ttingen minipig in research of topics such as neuroscience, toxicology, diabetes, obesity, and experimental surgery reflects ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Ekkokardiografivurdering av Høyre Heart in Mice

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Hjertekateterisering i Mus for å måle trykket Volume Forholdet: Gransker Bowditch Effect

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolering av human lymfatisk endotelceller ved Multi-parameter fluorescens-aktivert cellesortering

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolation and Culture Utvidelse av tumor-spesifikke endotelceller

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Isolasjon og Culture of Primary endotelceller fra Canine arterier og vener

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

Shunt Surgery, Høyre hjertekateterisering, og Vaskulær morfometri i en rottemodell for Flow-indusert pulmonal arteriell hypertensjon

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Isolering av endothelial stamceller fra friske frivillige og deres trekkende Potential påvirket av serumprøver etter hjerteoperasjon

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

Den inverterte hjertemodellen for interstitial transudatsamling fra det isolerte rottehjertet

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

Ballong-baserte skade å indusere Myointimal Hyperplasia i musen Abdominal Aorta

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...