Name: harvest of endothelial cells from the balloon tips of swan-ganz catheters after right heart catheterization
Uploaded: 2019-01-23T14:30:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить врачей и вспомогательного персонала службы Advanced сердечной недостаточности и легочной гипертензии Аллеени Генеральной больницы для предоставления сотни образцов катетер в течение нескольких лет, которые способствовали оптимизации этой методологии.

Все исследования, описанного в этой статье были утверждены Советом по рассмотрению институциональных Аллеени сети здравоохранения. Все пациенты условии информированного согласия перед администрацией седативное агентов и исключения были определены назначаемое ряду исследование.
1. Тумба коллекции
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Важно побудить холодной застой в клетках для сохранения их на месте биологических фенотип. Этот протокол включает обработки крови и клетки, полученные от людей, и поэтому должны соблюдаться универсальных мер предосторожности.
<ol><li>После вывода катетера из ножен немедленно погрузиться катетер в центрифуге Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл охлажденного стерильного физиологического раствора. Вихрем катетер несколько раз для удаления крови и промойте линии при необходимости для удаления крови сохраняется в пределах линии.</li>
	<li>Отрезать дистальной 5 см кончик Кэт и позволить ему попасть в пластиковых пробирок 50 мл, содержащие охлажденные физиологического раствора. Немедленно удалите верхушку Кэт с щипцами и перенести его на пластиковых пробирок 15мл, содержащих 15 мл средний рост эндотелиальных клеток (EC).</li>
	<li>Уплотнение трубки, поместите его на льду и передачи в лабораторию подготовить для переработки или транспортировки. Важно, что шар остается погруженным в среде, поэтому убедитесь, что есть минимальный headspace в 15 мл, заполнив его полностью с ЕС среднего роста.</li>
	<li>Процесс выборки сразу перейти к шагу 2.1 или печать и корабль образца на мокрый лед на ночь для обработки в лаборатории, квалифицированных в этом протоколе. Если клетки в конечном счете будет использоваться для культуры клеток, это настоятельно рекомендуем, что кончик cath обрабатывается немедленно на том же сайте, на котором она была собрана.</li>
</ol>2. ячейка урожай
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Клетки находятся в холодной застой, и важно избежать пробуждения их, пока они не готовы быть фиксированной или искусственного. Этот весь протокол должен выполняться в Ламинарный шкаф, используя стерильные инструменты, если конечной целью является культура собранного PAECs. Если культура не планируется (например, cytometry анализ потока), это не обязательно для стерильных предосторожности.
<ol><li>Добавить 5 мл раствора отряд клеток в 15 мл пластиковых пробирок; место на льду.</li>
	<li>Заимствовать что оставшихся в постели коллекции трубки в 1 мл шприц 1 мл EC СМИ.</li>
	<li>Быстро завершить шаги 2.3 через 2.5. Сцепление отрезока концу катетера с hemostats.</li>
	<li>Осторожно вставьте иглу шприца 1 мл в «белый» отверстие напротив проволочный направитель («черная дыра»). Проявлять большую осторожность, чтобы избежать травм с иглой.</li>
	<li>Перевести кончик катода в 15 мл пластиковых пробирок, содержащая ячейку отряд решение.</li>
	<li>Надуть шар, стараясь не лопнул раздувания баллона с приблизительно 200 мкл СМИ работает хорошо.</li>
	<li>Разрешить катетер сидеть в ячейке отряд решения на льду за 5 мин с завышенным воздушный шар. Если шар сдувается на свой собственный в течение 5 минут инкубации, это приемлемо.</li>
	<li>Залейте содержимое пластиковых пробирок 15мл в блюдо 100 мм. Поместите шар в решении клетки отряда «волшебные».</li>
	<li>Скрип завышенных шар с скребок ячейки. Скребок ячейки можно обращается вокруг шар в круговом движении или чистки движения. Сосредоточиться на «поляки» шара, где он встречает катетера. Убедитесь, что ячейки скребок контакты всю поверхность шара по крайней мере дважды. Промойте скребковых ячейка в решении клетки отряда «волшебные» периодически.</li>
	<li>Дефлирования шар и скрип чистки движением. Промойте скребковых ячейка в решении клетки отряда «волшебные».</li>
	<li>Выбросите cath кончика, иглы и клеточной скребок в соответствующий контейнер для отходов.</li>
	<li>Залейте раствор отряд ячейки, содержащие ячейки урожай в 50 мл пластиковых пробирок. Shake коллекции трубки и залейте остальные СМИ из коллекции трубки собранных образцов также.</li>
	<li>Центрифугуйте образцы на 650 x g на 4 ° C на 10 мин. Важно отметить, что зачастую Пелле будет не видно. Это может быть полезно отметить место, где будет рассматриваться Пелле, если она видна, чтобы избежать аспирационных гранулы в случае, если он слишком мал, чтобы увидеть. Примечание: Как правило Пелле виден только когда образца были загрязнены кровью. Заражение крови нематериального продукции конечной урожай, потому что кровь не удается привязать бисер CD146 и моет через колонку. Обширные испытания показал, что конкретные марки 1,5 мл microcentrifuge трубки ссылки в Таблице материалов минимизирует потери ячейки относительно других труб, используются во время оптимизации протокола.</li>
	<li>Тщательно аспирационная СМИ и избежать беспокойства или аспирационных гранулы.</li>
</ol>3. клетки очистки
Примечание: Все в этом протоколе должно быть сделано на льду, используя предварительно охлажденные решения. Клетки находятся в холодной застой, и важно избежать пробуждения их, пока они не готовы быть фиксированной или искусственного.
<ol><li>Ресуспензируйте гранулы в 1 мл раствора лизис охлажденные красных кровяных клеток и передать его на трубку отцентрифугировать 1,5 мл; мягко рок 10 мин при 4 ° C.</li>
	<li>Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Аспирационная решение лизис РБК.</li>
	<li>Ресуспензируйте гранулы в 60 мкл PBS, 20 мкл блокатор FcR и 20 мкл микрошарики CD146 против человека. Инкубируйте 15 мин при 4 ° C.</li>
	<li>Добавьте 1 мл охлажденного PBS. Центрифуги для 5 мин на 500 x g и 4 ° C. Аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 1 мл охлажденного PBS.</li>
	<li>Разместите магнитные LS столбца на магнитные стойки (см. Таблицу материалы для конкретных коммерческих самобытности этих предметов) при комнатной температуре. Премьер столбца путем добавления 1 мл PBS и разрешить весь объем потока через. Отказаться от потока через.</li>
	<li>Поместите образец в столбце магнитные. Отказаться от потока через.</li>
	<li>Промойте колонку с 3 мл охлажденного PBS три раза. Отказаться от потока через от каждой стирки.</li>
	<li>Добавьте 3 мл охлажденной PBS для пластиковых пробирок 15мл. Удалите магнитные столбец из магнита, налейте в столбце 3 мл PBS из пластиковых пробирок 15мл и быстро поместить столбец в пластиковых пробирок поймать поток через. Сразу же окунуться с плунжера, поставляемые с колонной. Образец является теперь очищенный, готовы к фиксации/пятнать или культуры.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Galie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2015+ESC/ERS+Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+hypertension:+The+Joint+Task+Force+for+the+Diagnosis+and+Treatment+of+Pulmonary+Hypertension+of+the+European+Society+of+Cardiology+(ESC)+and+the+European+Respiratory+Society+(ERS):+Endorsed+by:+Association+for+European+Paediatric+and+Congenital+Cardiology+(AEPC),+International+Society+for+Heart+and+Lung+Transplantation+(ISHLT).">2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT).</a> European Respiratory Journal. 46 (4), 903-975 (2015).</li><li>Pollett, J. B., Benza, R. L., Murali, S., Shields, K. J., Passineau, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvest+of+pulmonary+artery+endothelial+cells+from+patients+undergoing+right+heart+catheterization.">Harvest of pulmonary artery endothelial cells from patients undergoing right heart catheterization.</a> Journal of Heart Lung Transplantation. 32 (7), 746-749 (2013).</li><li>Benza, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+expression+of+Bcl-2+in+pulmonary+artery+endothelial+cells+associates+with+pulmonary+arterial+hypertension+relative+to+heart+failure+with+preserved+ejection+fraction.">In situ expression of Bcl-2 in pulmonary artery endothelial cells associates with pulmonary arterial hypertension relative to heart failure with preserved ejection fraction.</a> Pulmonary Circulation. 6 (4), 551-556 (2016).</li><li>Bull, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+endothelial+cells+in+pulmonary+hypertension.">Circulating endothelial cells in pulmonary hypertension.</a> Thrombosis and Haemostasis. 90 (4), 698-703 (2003).</li><li>Kaneko, F. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+reaction+products+of+nitric+oxide+as+quantitative+markers+of+primary+pulmonary+hypertension.">Biochemical reaction products of nitric oxide as quantitative markers of primary pulmonary hypertension.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 158 (3), 917-923 (1998).</li><li>Rothman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transvenous+procurement+of+pulmonary+artery+smooth+muscle+and+endothelial+cells+using+a+novel+endoarterial+biopsy+catheter+in+a+canine+model.">Transvenous procurement of pulmonary artery smooth muscle and endothelial cells using a novel endoarterial biopsy catheter in a canine model.</a> Journal of the American College of Cardiology. 27 (1), 218-224 (1996).</li><li>Savale, L., Guignabert, C., Weatherald, J., Humbert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+medicine+and+personalising+therapy+in+pulmonary+hypertension:+seeing+the+light+from+the+dawn+of+a+new+era.">Precision medicine and personalising therapy in pulmonary hypertension: seeing the light from the dawn of a new era.</a> European Respiratory Reviews. 27 (148), (2018).</li><li>Kanwar, M., Raina, A., Passineau, M., Benza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Idiopathic+Pulmonary+Arterial+Hypertension:+Evolving+Therapeutic+Strategies.">Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension: Evolving Therapeutic Strategies.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 38 (5), 606-618 (2017).</li><li>Elshal, M. F., Khan, S. S., Takahashi, Y., Solomon, M. A., McCoy, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD146+(Mel-CAM),+an+adhesion+marker+of+endothelial+cells,+is+a+novel+marker+of+lymphocyte+subset+activation+in+normal+peripheral+blood.">CD146 (Mel-CAM), an adhesion marker of endothelial cells, is a novel marker of lymphocyte subset activation in normal peripheral blood.</a> Blood. 106 (8), 2923-2924 (2005).</li><li>Elshal, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+population+of+effector+memory+lymphocytes+identified+by+CD146+having+a+distinct+immunophenotypic+and+genomic+profile.">A unique population of effector memory lymphocytes identified by CD146 having a distinct immunophenotypic and genomic profile.</a> BMC Immunolology. 8, 29 (2007).</li><li>Newman, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PECAM-1+(CD31)+cloning+and+relation+to+adhesion+molecules+of+the+immunoglobulin+gene+superfamily.">PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily.</a> Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).</li></ol>

ДСМ и RLB являются изобретателей по патентам, утверждая части описанных методов.

Метод, описанный в этой статье лучше всего ценится в контексте предыдущих экспериментальных парадигм для изучения легочного эндотелия. Предыдущие попытки получить PAECs от людей были ограничены описаны трупной легкие5 и недолго попытка разработать катетер, способных легочной артерии биопсии6. Как отмечается в недавно обзор7, настоящий техника отличается от легких тканей урожая по ее способности для получения PAECs от жизни человека и сделать это в нескольких точках время прогрессирования заболевания и/или терапии. Следует, однако, отметить, что метод компаньон недавно сообщалось whereby индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) может быть transdifferentiated в PAECs4,5. Этот метод производит обильные культур PAECs конкретного пациента и позволяет исследование воздействия конкретного пациента генетический фон на биологии паек. Несмотря на эти преимущества эти IPSC-производные PAECs не может предложить любую информацию о взаимодействии между местными микроокружения и генетический фон конкретного пациента. Наш собственный группа представила считает, что «Кэт наконечник» и методы IPSC, скорее всего будет синергетический в продвижении поле8.
В рамках этой настоящей и историческом контексте следует отметить ограничения этой техники. Во-первых важно отметить, что урожайность PAECs, производные от данного метода может существенно различаться. Предположительно пациент-, болезни государства - и врач специфические факторы способствуют этой изменчивости, как протокол не содержит шаги, которые будут, как ожидается, привести к крупным потерям исходного материала. Таблица 1 показывает представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов. Во-вторых клеток дает общий низкий, и их жизнеспособности культуры оказался ниже, но в наших руках. В то время как ранее мы выросли культур PAECs, используя этот метод1, мы себя эти результаты представляют собой спасение подмножество прогениторных клеток после отмирания большинства образца и периодически успешна только в наших руках. Например это не редкость найти только несколько десятков сторонник PAECs в культуре на следующее утро после покрытием урожай. Часто эти микро культуры не доживает до расширения. Чтобы оптимизировать этот протокол в манере, которая будет поддерживать жизнеспособность PAECs и их условий в культуре для достижения желаемой цели распространения конкретного пациента паек урожаи необходима дальнейшая работа. Наконец положительный выбор CD146, которую мы адаптировали нельзя исключить загрязнение с другими CD146 + клеток, таких как циркулирующих эндотелиальные клетки4, pericytes, гладких мышечных клеток и редких CD146 + T клетки9,10. Тем не менее предполагается, что эти клетки являются очень малочисленны в пробах, собранных таким образом, и CD146 является значительно более конкретным, для этого протокола чем другие ячейки маркеры эндотелиальных клеток, таких как CD31 (которая также присутствует на различных кровь клетки, включая тромбоциты11). Любых будущих улучшений, направленных на улучшение специфики должны быть сбалансированы против их потенциально негативное влияние на урожайность.

Текущий США и европейские руководящие принципы требуют катетеризация правых отделов сердца для диагностики легочной гипертензии1. Врачи и ученые пытаются понять это заболевание желание биологических образцов от легких сосудистую дополнить гемодинамических данных, собранных во время RHC. К сожалению риск, связанный с легочной сосудистой биопсии очень высока, и поэтому биологических образцов легких сосудистую, редко, если когда-либо получить от жизни пациентов, перенесших RHC. Хотя много проницательность получил от сосудистой легочной ткани, полученные из трупной или описаны легких, эти примеры не могут отразить биологии процесс болезни рН, как она разворачивается в жизни пациента. В 2013 году мы впервые сообщили, что эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) являются зачищенное от ветвей легочной артерии, физический контакт с всплывающую подсказку катетера Swan-Ganz во время RHC и могут быть восстановлены в небольших количествах от катетер советы После процедуры2.
Эта статья показывает нашу технику для удаления и очистки легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs) от всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, после катетеризации правых отделов сердца. До сих пор методологии для выполнения этот метод урожая были описаны недостаточно подробно описаны в литературе для обеспечения единообразных результатов между лабораториями, выполнение метода. Эта статья предназначена для преодоления этого недостатка, предлагая визуализированных демонстрации техники, от постели сборник советов катетер для конечного продукта очищенный CD146 + эндотелиальных клеток. Этот метод должен помощь в продвижении исследований в pathobiology различных этиологий PH и привести к разработке новых диагностических анализов для дополнения гемодинамических данных, собранных в ходе RHC.
Важность этой техники к полю легочной сосудистой медицины и исследований, что он обеспечивает доступ к снимку биологии легочного эндотелия in situ и в отличие от предыдущих исследований на описаны или трупной легких, не представляют Конечная точка для субъекта легких. Недавно, мы показали, что анти apoptotic биомаркера в эти клетки могут иметь полезность в более точно фенотипирование связанных сортов легочная гипертензия3. Выход из клеток, полученных относительно мал, ~ 5, 000-25 000 PAECs на сэмпл и эти клетки являются сложным (но не невозможно) культуры. Мы считаем, что умные врачи и исследователи будут найти синергизма между этими методами компаньон выдвинуться легочной сосудистой исследования, диагностика и прогнозирование.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:659px;" width="659">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">100mm culture dish</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">NC9385690</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">15 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:145px;">Midsci</td>
			<td style="width:123px;">C15R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">16% Formaldehyde</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">PI28908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:145px;">Midsci</td>
			<td style="width:123px;">C50R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Accutase</td>
			<td style="width:145px;">Thermo</td>
			<td style="width:123px;">A1110501</td>
			<td>cell detachment solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Cell Scraper</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">08-100-241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Endothelial Cell Growth media</td>
			<td style="width:145px;">Cell Applications</td>
			<td style="width:123px;">211-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Forceps</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Hemostat</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">LoBind microfuge tube</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">13-698-794&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi CD146 beads</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-093-596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi FCR blocker</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi LS columns</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi magnet</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td>MidiMACS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Miltenyi RBC lysis buffer</td>
			<td style="width:145px;">Miltenyi</td>
			<td style="width:123px;">130-094-183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">PBS</td>
			<td style="width:145px;">Fisher</td>
			<td style="width:123px;">BP2438-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Scissors</td>
			<td style="width:145px;">any</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:222px;">Syringes</td>
			<td style="width:145px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309597</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvest of endothelial cells from the balloon tips of swan-ganz catheters after right heart catheterization

Различных патологий привести к легочной гипертензии (рН), который определяется как среднее легочной артерии давление превышает 25 мм рт ст, в состоянии покоя. Для дальнейшей диагностики и управления PH, пациенты проходят неоднократные правых отделов сердца catheterizations (РЦГ) которой Swan-Ganz катетер продвигается в филиал легочной артерии и воздушный шар надувается клин катетера. Эта статья показывает протокол которой эндотелиальные клетки легочной артерии (PAECs) могут быть найденным всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров после RHC и очищенный с методом столбец сходства анти CD146 для очистки предполагаемый PAECs. Эти клетки могут использоваться для обеспечения на местах снимок биологического состояния эндотелия легочных сосудистую дополнить гемодинамики измерений, полученных в ходе RHC. Собирают и очищенный PAECs может использоваться для любой культуры клеток или последующее аналитических анализов например потока cytometery.

Этот протокол приводит к очищению клеток, из советы катетера Swan-Ganz после катетеризации правых отделов сердца, которые привязать к столбцу выбор CD146 и вперед сбоку разброс профили, которые неотличимы от искусственного человека первичной легочной артерии эндотелиальных клеток (рис. 1). Учитывая, что катетер шар находится в физический контакт с только интродьюсер ножны (материал клетки свободный), легочной артерии стенки сосуда, и кровь, данных предоставляется здесь продемонстрировать, что эти клетки не являются производными от крови (рис. 2) , и поэтому предполагается, что они действительно являются производными от стенки сосуда легочной артерии. Читателю следует отметить, что анти CD146 магнитные шарики, которые используются для очистки клетки остаются приверженцем клеточной поверхности после процедуры и, таким образом, это неоптимальной пытаться анализировать урожаи ячейки для CD146 как маркер эндотелиальных клеток. CD31 или других маркеров эндотелиальной предположительно будут доступны для маркировки и могут рассматриваться как альтернативы.
Были определены ключевые элементы настоящего Протокола, может повлиять на результаты. Во-первых это важно для промывания катетера в постели с целью удаления крови. Рисунок 3 показывает сторона точечной (SSC) / профили вперед точечной (FSC) потока через из столбца анти CD146 за один образец, который был надлежащим образом промыть и одно которое не было. Столбец, по-видимому, исключает клетки крови производные от урожаев (рис. 2), но полоща шаг обеспечит минимально возможное загрязнение от циркулирующих эндотелиальные клетки (которые обычно присутствуют в < 50 клеток/мл крови4). Мы заметили что элюата от CD146, столбец является полностью ясно, даже в случае очень Кровавая катетер кончик образцы. Это предполагает, что столбец является возможность обрабатывать значительные количества крови без забивания или сохранения номера-CD146 + передающиеся через кровь клетки.
Во-вторых важно раздувать всплывающая подсказка по крайней мере один раз на этапе клетки отряд решение/ячейку скребок. Учитывая, что предполагаемый PAECs на всплывающей подсказке остаются сторонником несмотря солевые полоскания шаг, вполне вероятно, они могут быть частично захваченных складки в виниловый шар как она дефлированный в рамках подготовки к удалению от пациента. Предположительно шаг инфляции освобождает PAECs, позволяя им быть аккуратно царапины прочь. Это не сразу понятно, одно может проверить эту гипотезу, но было отмечено снижения урожайности клеток, когда шар не является завышенным (данные не показаны).
Наконец важно отметить, что урожайность PAECs, производные от данного метода может существенно различаться. Предположительно пациент-, болезни государства - и врач специфические факторы способствуют этой изменчивости, как протокол не содержит шаги, которые будут, как ожидается, привести к крупным потерям исходного материала. Таблица 1 показывает представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig1.jpg"> Рисунок 1 : SSC/FSC профили типичных катетер шар отзыв урожая от больного легочной гипертензии (A) и такое же количество клеток от коммерчески приобретенного основного человеческого паек культуры (B). Обе образцы были очищены с анти CD146 колонка, фиксированной и permeablized как описано в протоколе, до анализ СУИМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig2.jpg"> Рисунок 2 : SSC/FSC профили типичных катетер шар подсказка урожай от легочной гипертензии пациента (A) и последовательный 1:10 разрежения Ficoll градиент очищенная человека Баффи пальто (B, C, D). (A) был очищен с столбце анти CD146, тогда как (B-D) не были. Все образцы клетки были исправлены и permeablized как описано в протоколе, до анализ СУИМ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58353/58353fig3.jpg"> Рисунок 3 : SSC/FSC профили урожая кончик катетера шар от больного легочной гипертензии, в которой кровь была видна на кончик катетера до обработки. До шаг 3.1 протокола образец был разбит и буфера lysis был добавлен один Алиготе и удерживаются от другого. (A) и (C) Показать профили SSC/FSC лизированных образца, как клетки сохранили столбец (A) и потока через из столбца. (B) и (D) показывают SSC/FSC профили unlysed образца, как клетки сохранили столбец (B) и потока через из столбца (D). Мы заключаем, что лизис удаляет некоторые, но не все из лейкоцитов, но что лейкоциты не сохраняются в столбце и таким образом исключены из окончательного сбора урожая, независимо от lysis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58353/58353fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Пример</td>
			<td>Дата</td>
			<td>Урожайность ячейки</td>
			<td>Диагностика</td>
		</tr>
<tr>
<td>433</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7364</td>
			<td>PH-интерстициальная легочных заболеваний</td>
		</tr>
<tr>
<td>279</td>
			<td>4/17/2018</td>
			<td>7130</td>
			<td>PH-склеродермия</td>
		</tr>
<tr>
<td>432</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3976</td>
			<td>PH-многофакторного</td>
		</tr>
<tr>
<td>431</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>3634</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>390</td>
			<td>4/13/2018</td>
			<td>5666</td>
			<td>ПАУ</td>
		</tr>
<tr>
<td>423</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>9024</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>272</td>
			<td>3/23/2018</td>
			<td>7098</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>408</td>
			<td>2/27/2018</td>
			<td>4784</td>
			<td>HFrEF</td>
		</tr>
<tr>
<td>403</td>
			<td>2/14/2018</td>
			<td>10376</td>
			<td>PH-ASD + болезни митрального клапана</td>
		</tr>
<tr>
<td>396</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>4890</td>
			<td>HFpEF-IPCPH</td>
		</tr>
<tr>
<td>397</td>
			<td>1/26/2018</td>
			<td>7672</td>
			<td>Нормальный гемодинамики</td>
		</tr>
<tr>
<td>318</td>
			<td>1/4/2018</td>
			<td>7002</td>
			<td>HFrEF-LVAD настоящего</td>
		</tr>
</tbody></table>Таблица 1: CD146 + дает от различных паек урожаи. Представитель CD146 + дает от различных паек урожаи, используя советы катетер, полученные из целого ряда больных с различными заболеваниями государствами легочной гипертензии и ряд врач операторов.

Watch this Scientific Journal Video about Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization at JoVE.com

Harvest of Endothelial Cells from the Balloon Tips of Swan-Ganz Catheters after Right Heart Catheterization

Урожай эндотелиальных клеток от всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров после катетеризации правых отделов сердца

Этот протокол описывает удаление и очистка легочной артерии эндотелиальных клеток (PAECs), которые придерживаться всплывающие подсказки Swan-Ganz катетеров, хотя они являются вклинивается в легочной артерии при катетеризации правых отделов сердца и остаются приверженцами дефлированный шар после удаления от тела пациента.

A variety of pathologies lead to pulmonary hypertension (PH), which is defined as a mean pulmonary artery pressure exceeding 25 mmHg at rest. To further ...

Этот метод обеспечивает новый подход к решению ключевых вопросов в области легочных сосудистых исследований, таких как молекулярный путь механизмов интимального пролиферации при легочной гипертензии. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает минутную клеточную биопсию легочного сосудистого эндотелия без дополнительного риска для пациента. Демонстрация процедуры будет мисс Рейна Перес, наш клинический координатор, и д-р Филипп Галло, менеджер моей лаборатории.После того, как катетер снимается с оболочки, немедленно погрузите его в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую 40 миллилитров охлажденного стерильного солевого раствора. Закружить катетер несколько раз, чтобы удалить кровь, и промыть линию, если это необходимо, чтобы удалить кровь сохраняется в нем. Отрежьте дистальные пять сантиметров кончика катетера и дайте ему упасть в центрифугу.Используйте типсы, чтобы немедленно удалить кончик, и передать его в 15 миллилитровую центрифугу трубку, содержащую 15 миллилитров эндотелиальной среды роста клеток. Затем запечатай трубку. Поместите трубку на лед и перенесите в лабораторию.Либо обработать образец немедленно или упаковать образец на мокром льду для ночной доставки в лабораторию, где обработка будет происходить. Очень важно, чтобы воздушный шар оставался погруженным в среду. Поэтому убедитесь, что есть минимальное пространство головы в 15 мл трубки, заполнив его полностью с эндотелиальной клеточной среды роста.Во-первых, добавьте пять миллилитров раствора клеточного отслоения в чистую 15-миллилитровую центрифугу. Поместите эту трубку на лед. Используя один миллилитровый шприц, нарисуйте один миллилитр эндотелиальных клеточных средств массовой информации из того, что осталось в трубке для сбора прикроватных кроватей.Аккуратно вставьте иглу одного миллилитрового шприца в белое отверстие напротив направляющий проволоки. Поместите наконечник катетера в 15-миллилитровую центрифугу, которая содержит раствор клеточного отслоения. Надуть воздушный шар примерно 200 микролитров мультимедиа, будьте осторожны, чтобы не лопнуть его.Поместите трубку на лед, и пусть катетер сидеть в клеточном растворе отряда в течение пяти минут с воздушным шаром надуты. После этого, залить содержимое трубки в 100 миллиметров блюдо, убедившись, что воздушный шар находится в этой луже клеточного раствора отряда. Используя сотовый скребок, соскребать надутый воздушный шар, сосредоточиться на полюсах воздушного шара, где он отвечает катетер.Затем убедитесь, что сотовый скребок контактирует со всей поверхностью шарика по крайней мере дважды, и периодически прополощите сотовый скребок в растворе клеточного отряда. Сдуть воздушный шар и соскребать его с чисткой движения. Затем промыть клеточный скребок в луже раствора клеточного отслоения.Отбросьте кончик катетера, иглу и клеточный скребок в соответствующий контейнер для отходов. Налейте раствор клеточного отслоения, содержащий урожай клеток, в 50-миллилитровую центрифугу. Встряхните трубку сбора, и залить оставшиеся средства массовой информации из него в собранный образец, а также.Центрифуга образца в 650 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Аспирировать средства массовой информации, будьте осторожны, чтобы не беспокоить или аспирировать гранулы. Resuspend гранулы в один миллиитер охлажденной красной крови лиза решение, и передать эту подвеску в 1,5 микролитр центрифуги трубки, и осторожно рок трубки при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.Центрифуга трубки при 500 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем аспирировать раствор лиза красных кровяных телец. Повторное распределение гранул в растворе, содержащем блокатор PBS, FcR и анти-человеческие микробусы CD-146.Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. Добавьте один миллилитр охлажденного PBS. Центрифуга при 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в один миллилитр охлажденной PBS. Затем поместите магнитный столбец LS на магнитную стойку при комнатной температуре. Премьер столбца, добавив один миллилитр PBS, и позволяет весь объем течь через.Отбросьте поток через. Загрузите образец на магнитную колонку и отбросьте протеку. Вымойте колонку три раза с помощью трех миллилитров охлажденного PBS для каждой стирки.Откажитесь от всего этого потока через. Затем добавьте три миллилитров охлажденной PBS в 15 миллилитровую центрифугу трубки. Снимите столбец магнита со стойки и вылейте PBS из трубки в колонку.Быстро поместите столбец в трубку центрифуги, чтобы поймать протекаемый. Немедленно окунитесь с поршенем, снабженным колонной. Образец теперь очищен, и готов к фиксации, окрашиванию или культуре.В этом исследовании клетки очищаются от кончиков катетера Swan-Ganz после катетеризации сердца. Эти клетки связываются с колонкой выбора CD-146 и имеют профили перемотки вперед и сбоку, которые неотличимы от культурных первичных эндотелиальных клеток легочной артерии человека. Поскольку катетерный шар находится только в физическом контакте с оболочкой введения, стенка сосуда легочной артерии и кровь, и клетки, как по-продемонстрировано, не вытекают из крови, поэтому предполагается, что они получены из стенки сосуда легочной артерии.После процедуры собранные клетки могут быть проанализированы различными методами, такими как цитометрия потока, qPCR, секвенирование и протеомикс. Урожайность клеток слишком низка для обычных западных пятно, но низкий вход blotting методологии могут быть рассмотрены. Клетки могут быть культурны, но это очень трудно, и это не всегда удается в наших руках.Если культура должна быть предпринята, важно свести к минимуму интервал между сбором кончика кат от пациента, и окончательные шаги очистки и покрытия, и обеспечить, чтобы образец хранится холодной на протяжении всех этапов обработки метода. Не забывайте, что этот протокол включает в себя работу с человеческой кровью и тканями. Необходимо соблюдать всеобщие меры предосторожности.В частности, есть шаг в начале протокола, который включает вставки острой иглы в конце разреза кончика катетера, который загрязнен кровью пациента. Никогда не забывайте, что кончик катетера должен быть проведен с гемостатами во время этого шага, а не пальцами, чтобы избежать риска иглы палкой.

Research

JoVE Journal

Medicine

Basic Surgical Techniques in the G&ouml;ttingen Minipig: Intubation, Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion

Basic Surgical Techniques in the GÃƒÆ’Ã‚Â¶ttingen Minipig: Intubation, Bladder Catheterization, Femoral Vessel Catheterization, and Transcardial Perfusion

Основные Хирургические методы в Геттингене Minipig: интубация, катетеризация мочевого пузыря, бедренной катетеризации сосудов и перфузии Transcardial

The emergence of the G&ouml;ttingen minipig in research of topics such as neuroscience, toxicology, diabetes, obesity, and experimental surgery reflects ...

Echocardiographic Assessment of the Right Heart in Mice

Эхокардиографическое Оценка правых отделов сердца у мышей

Transgenic and toxic models of pulmonary arterial hypertension (PAH) are widely used to study the pathophysiology of PAH and to investigate potential ...

Cardiac Catheterization in Mice to Measure the Pressure Volume Relationship: Investigating the Bowditch Effect

Катетеризации сердца у мышей для измерения давления Громкость Отношения: Расследуя Bowditch эффект

Animal models that mimic human cardiac disorders have been created to test potential therapeutic strategies. A key component to evaluating these ...

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Выделение человека эндотелиальных клеток лимфатической от нескольких параметров флуоресценции активирован сортировки клеток

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Выделение и культура Расширение опухоли конкретных эндотелиальных клеток

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

Выделение и культуры первичных эндотелиальных клеток от клыка артериями и венами

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Shunt Surgery, Right Heart Catheterization, and Vascular Morphometry in a Rat Model for Flow-induced Pulmonary Arterial Hypertension

Шунтов, катетеризация правых отделов сердца, и сосудистому Морфометрия в крысиной модели для Flow-индуцированной легочной артериальной гипертензии

In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

Выделение эндотелиальных клеток-предшественников от здоровых добровольцев и их миграционном потенциал Под влиянием Образцы сыворотки после кардиохирургии

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...

The Inverted Heart Model for Interstitial Transudate Collection from the Isolated Rat Heart

Модель инвертированного сердца для междоузлийной коллекции трансмутаций из изолированного сердца крысы

The present protocol describes a unique approach that enables the collection of cardiac transudate (CT) from the isolated, saline-perfused rat heart. ...

Balloon-based Injury to Induce Myointimal Hyperplasia in the Mouse Abdominal Aorta

На основе шар травмы побудить Myointimal гиперплазии в мыши брюшной аорты

The use of animal models is essential for a better understanding of MH, one major cause for arterial stenosis.In this article, we demonstrate a murine ...