Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

هذا العمل كان تدعمها وزارة الاقتصاد والقدرة التنافسية من خلال برنامج سيرفيت ميغيل [CP13/00077] تأسيسه قبل FEDER (صندوق التنمية الإقليمية الأوروبية) الإسبانية ومنحت للدكتور ر. غوميز إلى جانب المنح "معهد كارلوس الثالث للصحة" الدكتور R غوميز [PI14/00547 و PI17/02329] وزين ألف كانو [PI12/02582].

وأقر استخدام عينات الأنسجة البشرية المؤسسية استعراض المجلس ولجنة الأخلاقيات للمستشفى الجامعي La Fe. وقدمت جميع المرضى الموافقة الخطية. تمت الموافقة على الدراسة التي تنطوي على الحيوانات "لجنة رعاية الحيوان المؤسسية" في مركز بحوث وبرينسيبي فيليبي دي فالنسيا، وأجريت جميع الإجراءات وفقا للمب...

<ol>
	<li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+endometriosis.">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li><li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis+and+infertility.">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li><li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endometriosis.">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li><li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis.">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain.">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li><li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+(Papio+anubis,+Papio+cynocephalus).">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li><li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony.">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li><li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions.">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility &amp; Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li><li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+endometriosis+research.">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression.">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li><li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+endometriosis:+validation+of+an+in-vivo+model.">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li><li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-invasive+model+of+endometriosis+for+monitoring+the+efficacy+of+antiangiogenic+therapy.">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li><li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions.">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li><li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenesis+therapy+for+endometriosis.">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+(Pro-EGCG)+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice.">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li><li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis.">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li><li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers.">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 197 (6), 578 (2007).</li><li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis.">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis.">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis:+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method.">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li></ol>

ويصف البروتوكول هنا بالتفصيل تنفيذ نموذج الحيوان من بطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ بنية غرس العمارة الآفات بينما يسمح في نفس الوقت تقييم الوقت الحقيقي للأسفار تنبعث حسب مشري المسمى أنسجة بطانة الرحم. في هذا البروتوكول، يصف لنا استخدام محددة المجراة في نظام التصوير والبرامج ذات الصلة لتقي...

بطانة الرحم اضطراب الجهاز التناسلي للمرأة مزمنة بدأت بغرس الوظيفية بطانة الرحم خارج تجويف الرحم. تنمو الآفات حمل خارج الرحم والحث على التهابات العمليات المؤدية إلى المزمنة الألم والعقم الحوض1. ومن المقدر أن يصل إلى 10-15% نساء في سن الإنجاب تتأثر endometriosis2، وأنها موجودة في حوالي 40-50% من النساء المصابات بالعقم3. العلاجات الدوائية الحالية لبطانة الرحم غير قادر على القضاء التام على آفات ولا يخلو من الآثار الجانبية4،5. يتطلب البحث عن علاجات أكثر فعالية لتحسين النماذج الحيوانية الموجودة في بطانة الرحم بطريقة يمكن أن تحاكي آفات البشرية على نحو ملائم، ويمكن تقييم آثار المركبات على حجم الآفة بين أمور أخرى عن كثب.
وقد استخدمت نماذج الرئيسيات لتقليد بطانة الرحم بترسيخ آفات حمل خارج الرحم الأشيع متطابقة وفي مواقع مماثلة كما هو الحال في البشر6،،من78؛ ومع ذلك، الشواغل الأخلاقية وارتفاع التكاليف الاقتصادية المتصلة بالتجريب مع حد الرئيسات استخدام9. ونتيجة لذلك، لا يزال استخدام الحيوانات الصغيرة، ولا سيما من القوارض، لتنفيذ نماذج فيفو من بطانة الرحم تكون يفضل أنها تتيح دراسات مع عدد أكبر من الأفراد10،11. بطانة الرحم يمكن أن يتسبب في هذه الحيوانات بزرع قطعة من القوارض ابواق الرحم ("نماذج مثلى")،من1213 أو أنسجة بطانة الرحم/اندوميتريوتيك البشرية إلى مواقع خارج الرحم (نماذج مغايرة)14 . وعلى النقيض من البشر، القوارض لا تسلط على أنسجة بطانة الرحم ومما بطانة الرحم يمكن عدم وضع تلقائياً في هذه الأنواع. ولذلك، الماوس مثلى نماذج من بطانة الرحم قد تعرض للانتقاد يرجع ذلك إلى حقيقة أن زرع أنسجة الرحم الماوس حمل خارج الرحم لا تعكس خصائص الآفات اندوميتريوتيك البشرية15.
يمكن أن تحاكي المناسبة فسيولوجيا بطانة الرحم في نماذج مغايرة لبطانة الرحم حيث يتم زرع شظايا بطانة الرحم البشرية الطازجة في الحيوانات العوز. في نماذج مغايرة التقليدية، يتم عادة تقييم الآثار العلاجية من المركبات ذات الأهمية عند نقطة النهاية بتقييم حجم الآفة باستخدام الفرجار16. حد واضح، على هذا النحو، نماذج حيوانية نقطة النهاية لا تسمح دراسة ديناميات غرس أو تطور الآفة اندوميتريوتيك على مر الزمن. قيداً إضافيا أن لا تسمح باستخدام الفرجار القياسات الدقيقة لحجم الآفة. وفي الواقع، الخطأ القياسي تقدمها الفرجار في نفس النطاق (أي، ملليمتر) كحجم الآفات مزروع في الفئران، مما يحد من قدرة هذه الأدوات للكشف عن التغيرات الفعلية في الحجم.
وللتغلب على هذه القيود، هنا، يصف لنا توليد نموذج الماوس مغايرة لبطانة الرحم التي تم تصميم مزروع الأنسجة البشرية للتعبير عن كرز م مراسل بروتين فلوري. يمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت مع نظام صورة مناسبة غير الغازية رصد حالة الآفة مع الكمي المتزامن لحجمه في الوقت الحقيقي. وهكذا، لدينا نموذج يوفر مزايا واضحة عند مقارنة النماذج التقليدية نقطة النهاية كما أنه يجلب الفرصة للرصد في الوقت الحقيقي غير الغازية وإمكانية أداء أكثر موضوعية وتقدير دقيق للتغيرات في حجم الآفة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتنفيذ نموذج مغايرة الماوس التي يمكن تقييم تطور بطانة الرحم في الوقت الحقيقي من خلال رصد موسع للأسفار التي تنبعث من مزروع الأنسجة بطانة الرحم البشرية خارج الرحم. ولهذا الغرض، يتم الحصول على خزعات من بطانة الرحم البشرية من المانحين التبرع البويضيه الجارية المرأة. شظايا بطانة الرحم البشرية تستزرع حضور غدية هندسيا لكدنا صريحة مشري بروتين فلوري مراسل. على التصور، ويسمى الأنسجة بمعدل أمثل للأسفار بعد الإصابة في وقت لاحق المختارة لغرس في الفئران المستفيدة. أسبوع واحد قبل جراحة زرع، هي أووفوريكتوميزيد الفئران المستفيدة، والكريات استراديول توضع تحت الجلد للحفاظ على بقاء ونمو الآفات. اليوم لعملية جراحية الفئران تجويف تخديره، والبريتوني الوصول إليها من خلال شق صغيرة (1.5 سم) لينيا-ألبا. يزرع المسمى فلوريسسينتلي تويزيد، بإيجاز غارقة في الغراء وتعلق على طبقة البريتوني. يتم خياطة الشقوق، وترك الحيوانات لاسترداد لبضعة أيام. ويرصد fluorescence المنبعثة من يزرع اندوميتريوتيك عادة غير-إينفاسيفيلي كل 3 أيام لمدة 4 أسابيع مع نظام تصوير في الحية. ويمكن تقدير الاختلافات في الحجم من يزرع اندوميتريوتيك في الوقت الحقيقي بالتحديد الكمي للإشارات مشري والتطبيع ضد الزمن-النقطة الأولى تبين كثافة fluorescence القصوى.
القوارض السريرية التقليدية لنماذج من بطانة الرحم عدم السماح برصد غير الغازية للآفة في الوقت الحقيقي ولكن بدلاً من ذلك السماح بتقييم لآثار المخدرات جزيئي عند نقطة النهاية. هذا البروتوكول يسمح أحد لتتبع الآفات في الوقت الحقيقي، وهو أكثر فائدة لاستكشاف إمكانات العلاج من المخدرات في نماذج السريري لالتهاب بطانة الرحم. القيد الرئيسي للنموذج وهكذا ولدت أن الرصد غير الغازية من غير الممكن على مدى فترات طويلة من الوقت بسبب التعبير ابيسومال من الفيروسات الإعلانية.

هنا، يمكننا وصف عملية لإنشاء نموذج مغايرة لبطانة الرحم التي يتم الاحتفاظ ببنية الآفات بغرس قطع بطانة الرحم البشري المسمى فلوريسسينتلي في الفئران المناعة، مما يسمح لغير الغازية رصد تطور الآفة. وسم من شظايا بطانة الرحم يتحقق عن طريق العدوى مع إتش هندسيا للتعبير عن مشري، ب...

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

نقدم هنا، بروتوكولا للعيش-التصوير المسمى فلوريسسينتلي شظايا بطانة الرحم البشرية المطعمة في الفئران. يسمح الأسلوب دراسة آثار المخدرات الاختيار على حجم الآفة اندوميتريوتيك من خلال الرصد والقياس الكمي للأسفار التي تنبعث من المراسل الفلورسنت في الوقت الحقيقي

رصد موسع لحجم الآفة في نموذج ماوس مغايرة لبطانة الرحم

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في تقييم آثار الأدوية العلاجية في مجال بطانة الرحم ، مثل آثار المركبات المضادة للاندروجيني على حجم الآفات بطانة الرحم. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن تقييم آثار الأدوية المحددة في النماذج الحيوانية لبُلُق الرحم في الوقت الحقيقي، وليس في نقطة النهاية. وسوف يكون إثبات الإجراء جيسيكا مارتينيز، وهو فني من مختبري، وكذلك فيفيانا بيسبال ونيري مارين، وهما طبيبان بيطريان من مركز الاستثمار برينسيبي فيليبي والذين هم متعاونون بشكل وثيق مع فريقنا.قبل يومين إلى ثلاثة أيام من جراحة الزرع، نقل شطف، صحية شظايا خزعة الأنسجة بطانة الرحم في طبق بيتري 10 سم تحتوي على متوسط كامل، واستخدام مشرط لفرم الأنسجة إلى قطع مكعبة من خمسة إلى 10 ملليمترات. باستخدام micropipette، إضافة 30 إلى 50 قطرات ميكرولتر من DMEM عبر الجزء السفلي من طبق ثقافة جديد 10 سنتيمترات، وترك مساحة كافية بين كل قطرة بحيث لا تأتي في اتصال مع بعضها البعض. عندما تم وضع كل من قطرات، واستخدام إبرة حقنة لوضع قطعة واحدة من شظايا النسيج الخزعة في كل قطرة.بعد ذلك ، أضف 100 إلى 200 ميكرولترات من adeno-mCherry المعدة حديثًا إلى بئر واحد من 96 بئرًا لكل جزء من الأنسجة ، بالإضافة إلى ثلاثة آبار مع DMEM خالية من الفيروس الغدي كتحكم سلبي. ثم استخدم الإبرة لنقل عينة واحدة من الأنسجة إلى كل بئر من محلول adeno-mCherry لاحتضان بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي وضع لوحة على مرحلة المجهر fluorescence واستخدام الليزر 568 نانومتر للتحقق من شظايا لوضع العلامات الأمثل.استخدام التخفيف المناسب من إصابة فيروس الغدة الأدينوية mCherry هو المفتاح لوضع العلامات الفعالة للأنسجة. حتى لتحديد التركيز المناسب، عدة لتخفيف mCherry، لكل تجربة على حدة، يجب أن يتم تقييمها. ثم نقل شظايا الأكثر تألقا في آبار فردية من لوحة جديدة 96 بئر تحتوي على الطازجة، والمتوسطة كاملة.بعد سبعة أيام على الأقل من استئصال المبيض ، قم باستئصال شظايا الأنسجة بطانة الرحم في طبق بيتري ، وتأكيد عدم الاستجابة لقرصة إصبع في مُجَدَّد ومُجَنَّد. مع الماوس في موقف سوبين تطهير منطقة البطن وجعل شق طولي 1.5 سنتيمتر في البطن. فصل الجلد من العضلات وجعل 1.5 سنتيمتر ثانية شق في العضلات للوصول إلى تجويف البريتوني.عقد على الحافة اليسرى من جدار البطن العضلي مع مصغرة ملقط، أضعاف العضلات لفضح الوجه الداخلي من الصفاق على السطح الخارجي للحيوان. استخدام ملاقط صغيرة لنقع لفترة وجيزة زرع بطانة الرحم في ن-بوتيل استر سيانوكريلات لاصقة وإرفاق جزء إلى البريتونيوم. عندما يتم تجفيف لاصقة، ووضع زرع الثانية على الجانب contralateral من الصفاق كما أظهرت للتو.استخدام خياطة امتصاص 6-0 لإغلاق طبقة العضلات وغير قابلة للامتصاص 6-0 خياطة لإغلاق الجلد. ثم تنظيف شق الجلد مع محلول مطهر ووضع الحيوان في منطقة الانتعاش مع مراقبة حتى إعادة شغل كامل. للتصوير الفلوري في vivo من شظايا الأنسجة المزروعة، 24 إلى 48 ساعة بعد جراحة الزرع بدوره على نظام التصوير في vivo، وتهيئة البرنامج، والسماح للكاميرا CCD لتهدئة لبضع دقائق.مرة واحدة الصك هو مكان جاهز الفأر تخدير أول في قفص نظام التصوير في vivo، في موقف سوبين، مع الرأس داخل أنبوب متصل آلة التخدير، وإغلاق الغطاء. ثم انقر فوق الحصول على وحفظ الصور الناتجة الخمسة. لتحديد كمية في vivo fluorescence ، في برنامج تحليل الصور المناسبة انقر فوق تصفح وحدد الملف غير المُزَجَر من الفائدة التي سيتم تحليلها.ستظهر نافذة جديدة. انقر فوق إضافة إلى قائمة لتضمين كافة الملفات غير المُزَمَكَم من كل في نقاط زمنية مختلفة وانقر فوق تحميل كمجموعة. يجب أن تظهر كافة الصور في تسلسل واحد.في إطار لوحة الأدوات، قم بإلغاء تحديد مربع الاختيار مقياس فردي لضبط كافة الصور إلى نفس المقياس، وانقر نقراً مزدوجاً فوق صورة واحدة من التسلسل. لإنشاء منطقة ذات أهمية، في منطقة أدوات الفائدة حدد خيارات كفاف والسيارات واحد، وانقر على شكل الدائرة لوضع الدائرة في وسط إشارة الفلورسنت. انقر على إنشاء لإنشاء منطقة ذات أهمية ونسخ ولصق المنطقة ذات الاهتمام على خلفية حيث لا توجد إشارة.ثم انقر على قياس المناطق ذات الأهمية وحدد الكل لعرض قيم كثافة الفلورنس لكل منطقة ونسخ هذه القيم ولصقها في جدول بيانات. يتم تحقيق وضع العلامات على شظايا بطانة الرحم عن طريق العدوى بفيروس الغدة التي تم هندستها للتعبير عن mCherry ، وهو بروتين ينبعث منه الفلورانس في القسم القريب من الأشعة تحت الحمراء الذي هو أكثر قوة بكثير من الانسجة الذاتية بطانة الرحم غير المصابة. أثناء الرصد، بالإضافة إلى الطول الموجي المرجعي لـ mCherry، يتم التقاط الصور الفلورية مع أزواج مختلفة من مرشحات الطول الموجي لانبعاثات الإثارة.لتحديد خصائص الانبعاثات الفلورية الأنسجة ملامح الآفات من الخلفية، وffluorescence المنبعثة من الأنسجة المضيفة، يتم جمع صور الرصد التي تحتوي على الفلوريسين الخام المنبعثة من الحيوانات خلال كل نقطة زمنية معا، غير مخنوق، في ملف واحد. بعد ذلك ، يتم اغتباط fluorescence ، تطبيع ، ويمثل صورة ملونة كاذبة ، ومناطق المصالح المقابلة للفيج محددة وإشارات الخلفية يتم التعرف عليها تلقائيا من قبل البرنامج وكميتها. يتم طرح منطقة خلفية من إشارة الفائدة من منطقة الفيلق من إشارة الفائدة.ويتم تطبيع نتائج كثافة في كل نقطة زمنية مقابل نقطة الوقت التي كثافة القصوى. بعد عدة أسابيع من الرصد، يمكن استرداد الغرسات القابلة للحياة لمزيد من التحليل المصب. أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم أن نتذكر أن تختار تركيز Ad-mCherry الذي يوفر إشارة الأكثر تألقًا دون المساس بقدرة الأنسجة على البقاء.بعد هذا الإجراء ، يمكن استرداد الآفات واستخدامها لدراسة معلمات مميزة إضافية. تم تحسين هذا الإجراء للمراقبة غير الغازية لآفات بطانة الرحم البشرية xenograft. ومع ذلك، يمكن أن يكون بسهولة التكيف لتقييم آثار أدوية محددة ذات أهمية على مواقع xenograft في الوقت الحقيقي.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

في الجسم الحي التصوير والعلاجات العلاجية في الفأر نموذج مثلي من سرطان المبيض

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

عينات الشعر نونينفاسيفي تقنيات الحمض النووي للحصول على ارتفاع الجودة من الثدييات الصغيرة المراوغ

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

على المدى الطويل اختبار السمية المهلكة مع القشريات الأرتيميا franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

التحقق من صحة نموذج الفأر لعرقلة ينك مجمعات بطريقة خلية محددة

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

نموذج الفأر من انسداد الأمعاء الجزئي

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

تصور اللقاءات المجيبة مع آفة حجب مستضد موسومة

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

نموذج الماوس من عدم استقرار العمود الفقري القطني

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

مراقبة النمو الديناميكي لأوعية الشبكية في نموذج فأر اعتلال الشبكية الناجم عن الأكسجين

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...