Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
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这项工作得到了西班牙经济和竞争力部的支持, 该方案得到了 miguel servet 方案的支持, 该方案由欧洲区域发展基金 (feder) 共同发起, 并颁发给了 r. gómez 博士以及卡洛斯三世卫生研究所颁发的赠款给 r gómez 博士 [pi14/00547 和 pi17/12329] 和 a. cano 教授 [PI14/00547]。

la fe 大学机构审查委员会和道德委员会批准使用人体组织标本。所有患者均提供书面知情同意。这项涉及动物的研究得到了瓦伦西亚国家调查中心动物机构护理委员会的批准, 所有程序都是按照国家研究所的哺乳动物护理和使用准则进行的的健康。
1. 子宫内膜组织收集和预处理
<ol><li>通过使用连接在吸力装置上的插管, 获得高质量的人子宫内膜吸气活检。将活检物倒进含有10...

<ol>
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本文详细介绍了子宫内膜异位症动物模型的实施情况, 在该模型中, 植入病变结构的结构得以保存, 同时允许实时评估 mcherry 发出的荧光标记的子宫内膜组织。在这个协议中, 我们描述了使用一个特定的体内成像系统和相关软件, 以非侵入性评估荧光发射的标记病变。每个用户都应根据其机构提供的特定成像设备和相关软件调整协议。通过将异氟烷气体麻醉机与体内成像系统结合, 在麻醉动物身上进?...

子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病, 由子宫腔外功能性子宫内膜的植入引起。异位病变生长和诱发炎症过程, 导致慢性盆腔疼痛和不孕1。据估计, 多达10-15% 的育龄妇女受到子宫内膜异位症2的影响, 大约40-50% 的不孕妇女存在。目前子宫内膜异位症的药物治疗不能完全根除病变, 不具有副作用4,5。更有效的治疗方法的研究要求完善现有的子宫内膜异位症动物模型, 使人类病变可以被适当地模仿, 化合物对病变大小的影响等可以仔细评估。
灵长类动物模型已被用来模仿子宫内膜异位症植入异位病变组织学上相同, 并在类似的地点, 在人类6,7,8;然而, 与灵长类动物试验有关的伦理问题和高昂的经济成本限制了它们的使用。因此, 使用小动物, 特别是啮齿类动物, 实施子宫内膜异位症的体内模型继续受到青睐, 因为它允许对更多的人进行研究 10,11。子宫内膜异位症可以诱导这些动物通过移植到异位点 (异质模型)12, 13 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 (异质模型) 12, 或人类子宫内膜子宫内膜异位体组织 14.与人类不同的是, 啮齿类动物不会脱落其子宫内膜组织, 因此子宫内膜异位症不能在这些物种中自发发展。因此, 同种异体子宫内膜异位症模型因植入异位小鼠子宫肌组织的事实而受到批评, 不能反映人类子宫内膜异位症病变的特点15。
子宫内膜异位症的适当生理可在异种子宫内膜异位症模型中进行模拟, 在这些模型中, 新鲜的人子宫内膜片段被植入免疫缺陷的动物体内。在传统的异源模型中, 通常通过使用卡钳16评估病变大小来评估感兴趣的化合物的治疗效果。一个明显的局限性是, 因此, 端点动物模型不允许研究植入动力学或子宫内膜异位症病变的发展随着时间的推移。另一个限制是, 使用卡钳不允许准确测量病变大小。事实上, 卡钳提供的标准误差与小鼠植入病变的大小在相同的范围 (即毫米), 从而限制了这些工具检测大小实际变化的能力。
为了克服这些限制, 本文描述了子宫内膜异位症的异源小鼠模型的产生, 在该模型中植入人体组织的工程来表达记者 m-cherry 荧光蛋白。通过适当的图像系统检测荧光信号, 可以对病变状态进行非侵入性监测, 同时实时量化其大小。因此, 与传统端点模型相比, 我们的模型提供了明显的优势, 因为它带来了实时非侵入性监测的机会, 并有可能对病变大小的变化进行更客观、更准确的估计。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

在这里, 我们描述了一个协议, 实现了一个异源小鼠模型, 其中子宫内膜异位症的进展可以通过无创监测所植入的异位人类子宫内膜组织发出的荧光实时评估。为此, 从正在进行的卵母细胞捐献的供体妇女身上获得人体子宫内膜活检。人类子宫内膜片段是在腺病毒存在的情况下培养的, 这些腺病毒的设计是为了表达 cdna, 为报告荧光蛋白 mcherry。在可视化之后, 在接受者小鼠的植入中选择感染后荧光率最佳的标记组织。植入手术前一周, 受者小鼠被进行卵巢切除, 雌二醇颗粒被皮下放置, 以维持病变的存活和生长。手术当天, 小鼠被麻醉, 腹膜腔通过一个小 (1.5 厘米) 的切口通过线-阿尔巴进入.荧光标记的植入物被推状, 短暂浸泡在胶水中, 并附着在腹膜层。对氯感进行缝合, 动物离开后恢复几天。子宫内膜异位植入物发出的荧光通常每3天通过体内成像系统进行为期4周的非侵入性监测。通过对 mcherry 信号进行定量和对显示最大荧光强度的初始时间点的归一化, 可以实时估计子宫内膜植入物大小的变化。
子宫内膜异位症模型的传统临床前啮齿类动物不允许对病变进行实时非侵入性监测, 而是允许评估在终点检测的药物的效果。该方案允许一个人实时跟踪病变, 更有助于探索药物在子宫内膜异位症临床前模型中的治疗潜力。由此产生的模型的主要局限性是, 由于 Ad-virus 的会代表达, 非侵入性监测不可能长期进行。

在这里, 我们描述了创建子宫内膜异位症异源模型的过程, 在这个模型中, 通过将荧光标记的人类子宫内膜植入免疫功能受损的小鼠来保存病变的结构, 从而允许非侵入性病灶进展的监测。子宫内膜碎片的标记是通过感染腺病毒设计来表达 mcherry, 一种在近红外区域的蛋白质发出荧光。在图 1中, 我们显示了在荧光显微镜下观察到的人类子宫内膜碎片感染...

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Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

在这里, 我们提出了一个方案的现场成像荧光标记的人子宫内膜片段移植到小鼠。该方法通过实时监测和定量荧光记者发出的荧光, 研究选择的药物对子宫内膜异位细胞病变大小的影响

子宫内膜异位症异种小鼠病变大小的无创监测

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

该方法有助于回答评估子宫内膜异位症治疗药物效果的关键问题，如抗雄激素化合物对子宫内膜异位体病变大小的影响。这种技术的主要优点是，特定药物的效果可以在子宫内膜异位症的动物模型中实时评估，而不是在终点。演示手术将是杰西卡马丁内斯，这是一个技术人员从我的实验室，以及维维亚娜比斯巴尔和内雷亚马林，他们是兽医从普林西比费利佩调查，他们是与我们的团队密切合作。在植入手术前两到三天，将冲洗后的健康子宫内膜组织活检片段转移到含有完整培养的10厘米培养皿中，并用手术刀将组织切碎成5至10毫米的立方体。使用微管，在新的10厘米培养盘底部加入30至50微升的DMEM滴，在每滴之间留下足够的空间，这样它们之间的接触就不相互接触。当所有滴液都放置后，使用注射器针将一块活检组织片段放入每滴中。接下来，将100至200微升新鲜准备好的腺膜加入每个组织片段的96孔板的一口井中，外加三口无腺病毒DMEM的井作为负对。然后使用针头将一个组织样本转移到腺溶液的每个井中，在37摄氏度和5%CO2下进行过夜孵化。第二天早上，将板放在荧光显微镜阶段，并使用568纳米激光检查碎片，以找到最佳标签。使用适当的稀释感染mCherry腺病毒是有效标记组织的关键。因此，要确定适当的浓度，几个为mCherry稀释，每个单独的实验，必须评估。然后将最辉煌的碎片转移到包含新鲜、完整介质的新 96 井板的单个孔中。卵巢切除术后至少七天，将子宫内膜组织碎片放入培养皿中，并确认麻醉、卵巢切除动物对头趾捏缺乏反应。用鼠标在上部位置消毒腹体区域，并在腹部进行1.5厘米的纵向切口。将皮肤与肌肉分开，在肌肉中进行第二个1.5厘米切口，以进入腹腔。用迷你钳握住腹部肌肉壁的左边缘，折叠肌肉以暴露动物外侧腹膜的内脸。使用迷你钳子将一个子宫内膜植入物短暂地浸泡在 n-丁基酯氰丙烯酸酯胶粘剂中，将片段附着在内膜上。当粘合剂干燥时，将第二个植入物放在膜内膜的对侧侧，正如刚刚演示的。使用可吸收的 6-0 缝合线关闭肌肉层，使用不可吸收的 6-0 缝合线关闭皮肤。然后用防腐剂溶液清洁皮肤切口，将动物放在恢复区进行监测，直到完全恢复。对于植入组织片段的体内荧光成像，植入手术后 24 至 48 小时打开体内成像系统，初始化软件，并允许 CCD 摄像机冷却几分钟。仪器准备就绪后，将第一只麻醉小鼠放入体内成像系统保持架，在上呼吸位处，将头部插入连接到麻醉机的浴缸内，然后合上盖子。然后单击"获取"并保存生成的五个图像。要量化体内荧光，请在相应的图像分析软件中单击浏览并选择要分析的未混合文件。将出现一个新窗口。单击"添加到列表"以包括不同时间点上每个动物的所有未混合文件，然后单击加载作为一个组。所有图像应以单个顺序显示。在工具调色板窗口中，取消选中单个比例复选框以将所有图像调整到相同的比例，然后双击序列的一个图像。要创建感兴趣区域，在感兴趣区域中，工具选择轮廓和自动一个选项，然后单击圆形状将圆放在荧光信号的中心。单击"创建"以创建感兴趣区域，并在没有信号的背景上复制和粘贴感兴趣的区域。然后单击测量感兴趣区域并选择全部以显示每个区域的荧光强度值，然后复制这些值并将其粘贴到电子表格中。子宫内膜碎片的标签是通过感染腺病毒实现的，该腺病毒被设计成表达mCherry，一种在近红外部分发出荧光的蛋白质，比未受感染的子宫内膜组织自动荧光要强得多。在监测过程中，除了mCherry的参考波长外，荧光图像还用不同对的激发发射波长滤波器拍摄。为了定义从背景到病变的特征荧光组织发射特征，以及宿主组织发射的自荧光，将动物在每个时间点中发出的含有原始荧光的监测图像汇集在一起，非正则化。接下来，荧光被解混合、规范化，并表示为假彩色图像，并且与特定军团和背景信号对应的兴趣区域由程序自动识别并量化。兴趣信令的背景区域从兴趣信号的军团区域中减去。并且每个时间点的强度结果与强度最大化的时间点进行规范化。经过几个星期的监测，可行的植入物可以恢复，以进一步下游分析。在尝试此过程时，重要的是要记住选择 Ad-mCherry 的浓度，该浓度提供最辉煌的信号，同时不影响组织的生存能力。按照这个程序，病变可以恢复，并用于研究其他独特的参数。该程序针对异种移植人类子宫内膜异位体异位异位病病变的非侵入性监测进行了优化。然而，它可以很容易地适应评估特定药物对异种移植网站的实时影响。

Research

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