Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Spaanse ministerie van economie en het concurrentievermogen door de Miguel Servet programma [CP13/00077] samen door het EFRO (Europees Fonds voor regionale ontwikkeling) en toegekend aan Dr. R. Gómez alsmede door Carlos III Institute of Health toegekende subsidies Dr. R Gómez [PI14/00547 en PI17/02329] en Prof A. Cano [PI12/02582].

Het gebruik van menselijk weefsel specimens is goedgekeurd door de institutionele Review Board en de ethische commissie van het Hospital Universitario La Fe. Alle patiënten verstrekte schriftelijke geïnformeerde toestemming. De studie waarbij dieren werd goedgekeurd door de Commissie van de institutionele dier zorg bij het Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, en alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van zoogdieren van de nationale instituten van de ge...

<ol>
	<li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+endometriosis.">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li><li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis+and+infertility.">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li><li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endometriosis.">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li><li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis.">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain.">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li><li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+(Papio+anubis,+Papio+cynocephalus).">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li><li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony.">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li><li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions.">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility &amp; Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li><li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+endometriosis+research.">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression.">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li><li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+endometriosis:+validation+of+an+in-vivo+model.">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li><li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-invasive+model+of+endometriosis+for+monitoring+the+efficacy+of+antiangiogenic+therapy.">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li><li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions.">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li><li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenesis+therapy+for+endometriosis.">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+(Pro-EGCG)+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice.">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li><li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis.">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li><li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers.">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 197 (6), 578 (2007).</li><li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis.">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis.">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis:+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method.">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li></ol>

Het protocol hierin gedetailleerde beschrijving van de implementatie van een dierlijk model van endometriose waarin de architectuur van het implanteren van laesies het platform is bewaard terwijl tegelijkertijd waardoor real-time beoordeling van de fluorescentie uitgestoten door mCherry Label baarmoederslijmvlies weefsel. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een specifieke in vivo imaging systeem en verwante software te beoordelen niet-gebeurt fluorescentie uitgestoten door de gelabelde laesie. Elke gebruiker m...

Endometriose is een chronische gynecologic disorder, geïnitieerd door de inplanting van het functionele baarmoederslijmvlies buiten de baarmoederholte. Ectopische laesies groeien en veroorzaken van inflammatoire processen die leiden tot chronische bekken pijn en onvruchtbaarheid1. Geschat wordt dat omhoog tot 10 – 15% van de vrouwen in de reproductieve leeftijd worden beïnvloed door endometriosis2, en het is aanwezig in ongeveer 40-50% van onvruchtbare vrouwen3. Huidige farmacologische behandelingen voor endometriose zijn niet in staat om volledig uit te roeien laesies en niet vrij van bijwerkingen4,5. Het onderzoek voor meer efficiënte therapieën vereist van de verfijning van de bestaande diermodellen van endometriose op zodanige wijze dat menselijke laesies op de juiste wijze kunnen worden geïmiteerd, en de effecten van verbindingen op de grootte van de laesie o.a. nauw kunnen worden beoordeeld.
Primate modellen zijn gebruikt om na te bootsen endometriose door het inplanteren van ectopische laesies histologisch identiek en op vergelijkbare sites zoals mensen6,7,8; echter, ethische bezwaren en de hoge economische kosten in verband met experimenten met primaten limiet hun gebruik9. Bijgevolg blijft het gebruik van kleine dieren, vooral knaagdieren, voor de uitvoering van in vivo modellen van endometriose worden begunstigd omdat het zorgt studies met grotere aantallen personen10,11. Endometriose kan in deze dieren worden opgewekt door het transplanteren van stukken van knaagdier baarmoeder horens ("homologe modellen")12,13 of menselijk baarmoederslijmvlies/endometriotic weefsel naar ectopische sites (heterologe modellen)14 . In tegenstelling tot mensen, knaagdieren doen hun baarmoederslijmvlies weefsel niet vergoten en daardoor endometriose kan niet worden ontwikkeld spontaan in deze soorten. Homologe muis modellen van endometriose hebben bekritiseerd vanwege het feit dat ectopische muis uteriene weefsel ingeplant weerspiegelen derhalve niet de kenmerken van menselijke endometriotic laesies15.
Passende fysiologie van endometriose kan worden geïmiteerd in de heterologe modellen van endometriose waar verse menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten immunodeficiëntie dieren zijn ingeplant. Conventionele heterologe modellen, worden de therapeutische effecten van verbindingen van belang vaak beoordeeld op het eindpunt van de beoordeling van de grootte van de laesie met het gebruik van de remklauwen16. Een duidelijke beperking is dat, als zodanig, eindpunt diermodellen niet toestaan studeren implantatie dynamics of endometriotic laesie ontwikkeling na verloop van tijd. Een extra beperking is dat het gebruik van de remklauwen niet nauwkeurige metingen van de grootte van de laesie toelaat. Inderdaad, de standaardfout geboden door remklauwen is in hetzelfde bereik (dat wil zeggen, millimeters) als de omvang van de letsels geïmplanteerd in muizen, dus de beperking van de capaciteit van deze hulpprogramma's te detecteren van werkelijke variaties in grootte.
Om deze beperkingen te overwinnen, hierin beschrijven we de generatie van een heteroloog muismodel van endometriose waarin geïmplanteerde menselijk weefsel is ontworpen om uit te drukken een verslaggever m-Cherry fluorescent proteïne. Detectie van het fluorescerende signaal met een passende afbeelding-systeem maakt het mogelijk niet-invasieve monitoring van de status van de laesie met gelijktijdige kwantificering van het formaat in real-time. Ons model biedt dus duidelijke voordelen in vergelijking met conventionele eindpunt modellen, aangezien het de mogelijkheid van bewaking in real-time niet-invasieve en de mogelijkheid voor het uitvoeren van meer objectieve en nauwkeurige schatting van de variaties in de grootte van de laesie brengt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Hier beschrijven we een protocol voor de uitvoering van een heteroloog muismodel waarin progressie van endometriose kan worden beoordeeld in real time via noninvasive monitoring van fluorescentie uitgestoten door geïmplanteerde ectopische menselijke baarmoederslijmvlies weefsel. Voor dit doel worden Biopten van menselijke endometrium donor vrouwen lopende oöcyt donatie verkregen. Menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten worden gekweekt in aanwezigheid van adenovirussen ontworpen om uitdrukkelijke cDNA voor de verslaggever fluorescent proteïne mCherry. Label op visualization, weefsels met een optimale tarief van fluorescentie na infectie worden vervolgens gekozen voor de implantatie in ontvangende muizen. Een week voorafgaand aan de implantatie-operatie, ontvangende muizen zijn oophorectomized en estradiol pellets subcutaan worden geplaatst om de overleving en de groei van de laesies. Op de dag van de operatie zijn muizen narcose en peritoneale holte benaderd via een kleine (1,5 cm) incisie door de linea-alba. Fluorescently geëtiketteerde implantaten zijn tweezed, kort gedrenkt in lijm en gekoppeld aan de peritoneale laag. Insnijdingen zijn ingehecht en dieren verlaten om te herstellen voor een paar dagen. Fluorescentie uitgestoten door endometriotic implantaten is meestal niet-gebeurt elke 3 dagen voor 4 weken met een in vivo imaging systeem gecontroleerd. Variaties in de grootte van endometriotic implantaten kunnen worden geraamd in real-time door de kwantificering van de mCherry signaal en de normalisatie tegen het oorspronkelijke tijd-punt maximale fluorescentie intensiteit tonen.
Traditionele preklinische knaagdieren van modellen van endometriose staan geen niet-invasieve monitoring van de laesie in real-time maar eerder toe evaluatie van de effecten van drugs vehiculumcontrolegroep op het eindpunt. Dit protocol maakt het mogelijk om bij te houden van de laesies in real-time en meer nuttig kunnen de therapeutische mogelijkheden van drugs in preklinische modellen van endometriose. De belangrijkste beperking van de aldus opgewekte model is dat niet-invasieve toezicht niet mogelijk gedurende lange perioden van tijd als gevolg van de episomal uitdrukking van Ad-virus is.

Hier beschrijven we het proces voor het maken van een heteroloog model van endometriose waarin de architectuur van letsels wordt bewaard door het implanteren van fluorescently geëtiketteerde stukken van menselijke endometrium in immuungecompromitteerde muizen, waardoor niet-invasieve controle van de laesie progressie. Etikettering van baarmoederslijmvlies fragmenten wordt bereikt door besmetting met adenovirus ontworpen om uitdrukkelijke mCherry, een eiwit uitstoten fluorescentie in het ...

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging van fluorescently geëtiketteerde menselijke baarmoederslijmvlies fragmenten geënt in muizen. De methode kunt bestuderen van de gevolgen van de drugs van keuze voor endometriotic laesie grootte door middel van controle en kwantificering van de fluorescentie die wordt uitgestoten door de fluorescerende verslaggever op real-time

Noninvasive controle van de grootte van de laesie in een heteroloog muismodel van endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen bij de evaluatie van therapeutische drugseffecten in het endometrioseveld, zoals de effecten van anti-androgene verbindingen op de grootte van endometriotische laesies. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de effecten van de specifieke geneesmiddelen in dierlijke modellen van endometriose in real-time kunnen worden beoordeeld, in plaats van op het eindpunt. Het aantonen van de procedure zal Jessica Martinez, dat is een technicus uit mijn lab, evenals Viviana Bisbal en Nerea Marin, die dierenartsen van Centro de Investigacion Principe Felipe en die nauwe medewerkers met ons team.Twee tot drie dagen voor de implantaatoperatie, overdracht gespoeld, gezond endometrium weefsel biopsie fragmenten in een 10 centimeter petrischaal met compleet medium, en gebruik scalpels om het weefsel gehakt in vijf tot 10 millimeter blokjes. Met behulp van een micropipet, voeg 30 tot 50 microliter druppels DMEM over de bodem van een nieuwe 10 centimeter cultuur schotel, waardoor er genoeg ruimte tussen elke druppel, zodat ze niet in contact komen met elkaar. Wanneer alle druppels zijn geplaatst, gebruik dan een spuitnaald om een enkel stuk biopsieweefselfragment in elke druppel te plaatsen.Voeg vervolgens 100 tot 200 microliter vers bereide adeno-mCherry toe aan een put van een 96 putplaat per weefselfragment, plus drie putten met adenovirusvrije DMEM als negatieve controle. Gebruik vervolgens de naald om één weefselmonster over te brengen in elke put van adeno-mCherry-oplossing voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5% CO2. De volgende ochtend plaats de plaat op een fluorescentie microscoop stadium en gebruik een 568 nanometer laser om de fragmenten te controleren voor een optimale etikettering.Het gebruik van de juiste verdunning van het infecteren van mCherry adenovirus is de sleutel voor een efficiënte etikettering van het weefsel. Dus om de juiste concentratie te bepalen, moeten er meerdere voor mCherry verdunning, voor elk individueel experiment, worden geëvalueerd. Breng dan de meest briljante fragmenten over in individuele putten van een nieuwe 96 putplaat met vers, compleet medium.Ten minste zeven dagen na oophorectomie, decanteren de endometrium weefselfragmenten in een petrischaaltje, en bevestigen een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofd, oophorectomized dier. Met de muis in de supine positie desinfecteren het ventrale gebied en maak een 1,5 centimeter longitudinale incisie in de buik. Scheid de huid van de spier en maak een tweede incisie van 1,5 centimeter in de spier om toegang te krijgen tot de buikholte.Houd de linkerrand van de buikspierwand met mini-tangen, vouw de spier om het binnenste gezicht van het buikvlies bloot te stellen aan de buitenkant van het dier. Gebruik mini-pincet om kort een endometriumimplantaat in n-butylester cyanoacrylaatlijm te weken en het fragment aan het buikvlies te bevestigen. Wanneer de lijm wordt gedroogd, plaats een tweede implantaat aan de contralaterale kant van het buikvlies zoals net aangetoond.Gebruik een absorbeerbare 6-0 hechting om de spierlaag te sluiten en een niet-absorbeerbare 6-0 hechting om de huid te sluiten. Reinig vervolgens de huidincisie met antiseptische oplossing en plaats het dier in de herstelzone met controle tot volledige recumbency. Voor in-vivo fluorescerende beeldvorming van de geïmplanteerde weefselfragmenten, 24 tot 48 uur na de implantatieoperatie, schakel het in-vivo beeldvormingssysteem in, initialiseert de software en laat de CCD-camera een paar minuten afkoelen.Zodra het instrument klaar is plaats de eerste verdoofde muis in de in-vivo imaging systeem kooi, in de supine positie, met het hoofd in een tubule aangesloten op de anesthesie machine, en sluit het deksel. Klik vervolgens op het verwerven en opslaan van de vijf resulterende afbeeldingen. Om de in-vivo fluorescentie te kwantificeren, klik in de juiste beeldanalysesoftware op bladeren en selecteer je het niet-gemengde bestand dat moet worden geanalyseerd.Er verschijnt een nieuw venster. Klik op Toevoegen om aan lijst toe te voegen om alle niet gemengde dossiers van elk dier op verschillende tijdspunten op te nemen en klik op laden als groep. Alle afbeeldingen moeten in één reeks worden weergegeven.Schakel in het gereedschapspaletvenster het selectievakje afzonderlijke schaal uit om alle afbeeldingen op dezelfde schaal aan te passen en dubbelklik op één afbeelding van de reeks. Als u een interessegebied wilt maken, selecteert u in het gebied van interessehulpprogramma's de contour en automatische één opties en klikt u op de cirkelvorm om de cirkel in het midden van het tl-signaal te plaatsen. Klik op maken om het interessegebied te maken en kopieer en plak het interessegebied op een achtergrond waar er geen signaal is.Klik vervolgens op interessegebieden meten en selecteer alles om waarden weer te geven voor de fluorescentieintensiteit van elke regio en kopieer en plak deze waarden in een spreadsheet. De etikettering van de endometriumfragmenten wordt bereikt door infectie met adenovirus ontworpen om mCherry uit te drukken, een eiwit dat fluorescentie uitzendt in de nabij-infrarode sectie die aanzienlijk robuuster is dan het niet-geïnfecteerde endometriumweefsel autofluorescentie. Tijdens het monitoren worden naast de referentiegolflengte voor mCherry fluorescerende beelden gemaakt met verschillende paren excitatie-emissiegolflengtefilters.Om de karakteristieke fluorescerende weefselemissieprofielen van de laesies van de achtergrond en de autofluorescentie die door de gastheerweefsels worden uitgestoten, te definiëren, worden de monitoringbeelden die ruwe fluorescentie bevatten die door de dieren tijdens elk tijdstip worden uitgestraald, ongenormaliseerd, in één enkel bestand samengebracht. Vervolgens wordt de fluorescentie niet gemengd, genormaliseerd en weergegeven als een valse kleurenafbeelding, en worden de interessegebieden die overeenkomen met specifieke legioen- en achtergrondsignalen automatisch herkend door het programma en gekwantificeerd. De achtergrond regio van belang signalering wordt afgetrokken van het legioen regio van belang signalering.En de resultaten van de intensiteit op elk tijdstip worden genormaliseerd tegen het tijdstip waarop de intensiteit maximaal is. Na enkele weken van monitoring kunnen de levensvatbare implantaten worden teruggewonnen voor verdere downstream-analyse. Tijdens een poging tot deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de concentratie van Ad-mCherry die de meest briljante signaal biedt zonder afbreuk te doen aan de levensvatbaarheid van het weefsel te selecteren.Na deze procedure kunnen de laesies worden hersteld en gebruikt om aanvullende onderscheidende parameters te bestuderen. Deze procedure is geoptimaliseerd voor de niet-invasieve monitoring van xenograft menselijke endometriose laesies. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast voor het beoordelen van de effecten van een specifieke geneesmiddelen van belang op de sites van een xenograft in real-time.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Een niet-invasieve Hair samplingtechniek om High Quality DNA verkrijgen van Elusive kleine zoogdieren

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Lange-termijn Lethal toxiciteit Test met de Schaal- Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validatie van een muismodel voor LINC Complexen verstoren in een cel-specifieke manier

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-inner Cell Mass injectie van embryonale stamcellen tot hogere Chimerism tarieven leidt

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Een muismodel van intestinale gedeeltelijke obstructie

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Visualisatie van replisoomontmoetingen met een antigeen gelabelde blokkerende laesie

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Een muismodel van lumbale wervelkolominstabiliteit

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...