Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
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Diese Arbeit wurde unterstützt vom spanischen Ministerium für Wirtschaft und Wettbewerbsfähigkeit durch Miguel Servet Programm [CP13/00077] mitgegründet von FEDER (europäischer Fonds für regionale Entwicklung) und Dr. R. Gómez sowie von Carlos III Institute of Health Stipendien vergeben Dr R Gómez [PI14/00547 und PI17/02329] und Prof. A. Cano [PI12/02582].

Die Verwendung von menschlichem Gewebeproben wurde von Institutional Review Board und Ethik-Kommission der Hospital Universitario La Fe genehmigt. Alle Patienten zur Verfügung gestellt schriftliche Einwilligungserklärung. Die Studie an Tieren institutionelle Tier Pflege des Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia genehmigt wurde, und alle Eingriffe wurden nach den Richtlinien für die Pflege und Nutzung von Säugetieren aus den nationalen Ämtern der Gesundheit.
(1) endometrial Gew...

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Das Protokoll hier detailliert beschreibt die Umsetzung von einem Tiermodell der Endometriose in die Architektur der Implantation Läsionen Architektur bewahrt wird während gleichzeitig ermöglicht Echtzeit-Bewertung der Fluoreszenz emittiert durch mCherry mit der Bezeichnung endometrial Gewebes. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines speziellen in-vivo imaging-System und zugehöriger Software nicht-invasiv Fluoreszenz emittierten die beschrifteten Läsion einzuschätzen. Jeder Benutzer sollte das Prot...

Endometriose ist eine chronische gynäkologische Erkrankung, initiiert durch die Implantation der funktionellen Gebärmutterschleimhaut außerhalb der Gebärmutterhöhle. Ektopische Läsionen wachsen und entzündliche Prozessen führt zu chronischen Becken-Schmerz und Unfruchtbarkeit1zu induzieren. Es wird geschätzt, dass bis zu 10 – 15 % der Frauen im gebärfähigen Alter von endometriosis2 betroffen sind, und es ist in ca. 40 – 50 % der unfruchtbaren Frauen3. Aktuellen pharmakologische Behandlungen für Endometriose sind nicht in der Lage, vollständig auszurotten Läsionen und nicht frei von Nebenwirkungen4,5. Die Forschung für eine effizientere Therapien braucht der Verfeinerung von bestehenden Tiermodellen der Endometriose in einer Weise, dass menschliche Läsionen können entsprechend nachgeahmt, und die Auswirkungen der Verbindungen auf die Größe der Läsion unter anderem genau beurteilt werden können.
Primas Modelle wurden verwendet, um die Endometriose zu imitieren, durch Implantation ektopische Läsionen, die histologisch identisch und an ähnlichen Standorten wie in Menschen6,7,8; jedoch im Zusammenhang mit ethische Bedenken und der hohen volkswirtschaftliche Kosten experimentieren mit Primaten Begrenzung ihrer Verwendung-9. Daher weiterhin die Verwendung von kleinen Tieren, vor allem Nagetiere, für die Umsetzung von in Vivo Modellen der Endometriose bevorzugt werden, da es Studien mit einer größeren Anzahl von Personen10,11erlaubt. Endometriose kann bei diesen Tieren induziert werden, durch die Transplantation entweder Stücke von Nagetier uterine Hörner ("homologe Modelle")12,13 oder menschlichen Endometrium/nichtmalignem Gewebe, ektopische Websites (heterologe Modelle)14 . Im Gegensatz zu Menschen Nager ihre endometrial Gewebes nicht vergossen und somit Endometriose nicht entwickelt werden kann spontan in dieser Arten. Homologe Maus, die Modelle der Endometriose kritisiert wurden die ektopische Maus uterine Gewebe implantiert spiegelt daher nicht die Eigenschaften des menschlichen nichtmalignem Läsionen15.
Entsprechende Physiologie der Endometriose kann in die heterologe Modelle der Endometriose nachgeahmt werden, wo frische menschliche endometrialen Fragmente immungeschwächte Tiere implantiert werden. In herkömmlichen heterologen Modellen werden die therapeutischen Wirkungen von Verbindungen des Interesses häufig am Endpunkt durch die Beurteilung der Größe der Läsion mit dem Einsatz von Bremssättel16bewertet. Eine offensichtliche Einschränkung ist, dass als solche Endpunkt Tiermodelle nicht zulassen Implantation Dynamik oder nichtmalignem Läsion Entwicklung im Laufe der Zeit zu studieren. Eine weitere Einschränkung ist, dass die Verwendung der Bremssättel genaue Messungen der Größe der Läsion nicht zulässt. In der Tat ist der Standardfehler von Bremssättel zur Verfügung gestellt in der gleichen Größenordnung wie die Größe der Läsionen implantiert bei Mäusen, so beschränken die Kapazität dieser Werkzeuge, tatsächliche Abweichungen in der Größe zu erkennen (z.B. Millimeter).
Um solche Einschränkungen zu überwinden, beschreiben wir hier die Generation der heterologen Mausmodell der Endometriose in der implantiertes menschlichen Gewebe entwickelt, um ein Reporter m-Cherry fluoreszierende Protein zum Ausdruck bringen. Erkennung von das Fluoreszenzsignal mit einem entsprechenden Image-System ermöglicht nichtinvasive Überwachung der Läsion Status mit gleichzeitige Quantifizierung dieser Größe in Echtzeit. So sieht unser Modell klare Vorteile im Vergleich zu herkömmlichen Endpunkt Modelle wie es bringt die Möglichkeit, nicht-invasive Überwachung in Echtzeit und die Möglichkeit, weitere Objektive und präzise Einschätzung der Variationen in Größe der Läsion führen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Durchführung einer heterologen Mausmodell, in dem Fortschreiten der Endometriose in Echtzeit durch eine nicht-invasive Überwachung der Fluoreszenz emittiert von implantierten ektopische menschlichen endometrial Gewebes beurteilt werden kann. Zu diesem Zweck werden Spender Frauen laufenden Eizellspende Biopsien des menschlichen Endometrium entnommen. Menschlichen endometrialen Fragmente sind im Beisein von Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche cDNA für Reporter fluoreszierendes Protein mCherry kultiviert. Bei der Visualisierung beschriftet Gewebe mit einer optimalen Rate der Fluoreszenz nach Infektion werden anschließend für die Implantation im Empfänger Mäuse ausgewählt. Eine Woche vor der Implantation Operation Empfänger Mäuse oophorectomized und Estradiol Pellets sind subkutan aufgestellt, um das Überleben und Wachstum der Läsionen aufrecht zu erhalten. Am Tag der Operation sind Mäuse narkotisierten und peritonealen Hohlraum erreicht durch einen kleinen (1,5 cm) Schnitt durch die Linea Alba. Eindringmittel beschrifteten Implantate sind tweezed, kurz in Klebstoff getränkt und die peritoneale Schicht an. Einschnitte vernäht, und Tiere übrig, um für ein paar Tage zu erholen. Fluoreszenz emittierten nichtmalignem Implantate wird in der Regel nicht-invasiv alle 3 Tage für 4 Wochen mit einer in-vivo imaging-System überwacht. Variationen in der Größe von nichtmalignem Implantaten können in Echtzeit durch Quantifizierung des mCherry Signal und Normalisierung gegen die anfängliche Zeit-Punkt zeigen maximale Fluoreszenzintensität geschätzt werden.
Traditionelle präklinischen Nagetiere von Modellen der Endometriose nicht erlauben, nicht-invasive Überwachung der Läsion in Echtzeit aber eher erlauben Bewertung der Auswirkungen von Drogen am Endpunkt untersucht. Dieses Protokoll ermöglicht es, Läsionen in Echtzeit verfolgen und ist nützlicher, das therapeutische Potenzial von Drogen in präklinischen Modellen der Endometriose zu erkunden. Die wichtigste Einschränkung des so erzeugten Modells ist, dass nicht-invasives monitoring über längere Zeit wegen der episomal Ausdruck des Ad-Virus nicht möglich ist.

Hier beschreiben wir das Verfahren zum Erstellen einer heterologen Modell der Endometriose, in dem die Architektur der Läsionen durch Implantation von Eindringmittel beschrifteten Teile des menschlichen Endometrium in immungeschwächte Mäuse erhalten bleibt, damit nicht-invasive Überwachung der Läsion Progression. Kennzeichnung von endometrialen Fragmente wird durch Infektion mit Adenoviren entwickelt, um ausdrückliche mCherry, ein Protein emittierende Fluoreszenz im nahen Infrarotbe...

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Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für live-Aufnahmen von Eindringmittel beschriftete menschliche endometrialen Fragmente bei Mäusen verpflanzt. Die Methode ermöglicht das untersuchen die Auswirkungen der Medikamente der Wahl auf die Größe der nichtmalignem Läsion durch Überwachung und Quantifizierung der Fluoreszenz emittiert von fluoreszierenden Reporter in Echtzeit

Nicht-invasive Überwachung der Größe der Läsion in einer heterologen Mausmodell der Endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen bei der Bewertung der therapeutischen Arzneimittelwirkungen im Bereich der Endometriose zu beantworten, wie die Auswirkungen von anti-androgenen Verbindungen auf die Größe der endometriotischen Läsionen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Wirkung der spezifischen Medikamente in Tiermodellen der Endometriose in Echtzeit und nicht am Endpunkt beurteilt werden kann. Demonstriert wird das Verfahren von Jessica Martinez, einer Technikerin aus meinem Labor, sowie Viviana Bisbal und Nerea Marin, die Tierärzte vom Centro de Investigacion Principe Felipe sind und eng mit unserem Team zusammensind.Zwei bis drei Tage vor der Implantatoperation übertragen Sie die biotrizierten, gesunden Endometriumgewebe-Biopsiefragmente in eine 10 Zentimeter lange Petrischale, die ein komplettes Medium enthält, und verwenden Sie Skalpelle, um das Gewebe in fünf bis zehn Millimeter gewürfelte Stücke zu zerkleinern. Mit einer Mikropipette 30 bis 50 Mikroliter Tropfen DMEM über den Boden einer neuen 10-Zentimeter-Kulturschale hinzufügen, so dass genügend Platz zwischen jedem Tropfen, so dass sie nicht miteinander in Kontakt kommen. Wenn alle Tropfen platziert wurden, verwenden Sie eine Spritzennadel, um ein einzelnes Stück Biopsiegewebefragment in jeden Tropfen zu legen.Als nächstes fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter frisch zubereitetes Adeno-mCherry zu einem Brunnen einer 96-Well-Platte pro Gewebefragment hinzu, plus drei Brunnen mit Adenovirus-freiem DMEM als Negativkontrolle. Dann verwenden Sie die Nadel, um eine Gewebeprobe in jeden Brunnen der adeno-mCherry-Lösung für eine nächtliche Inkubation bei 37 Grad Celsius und 5% CO2 zu übertragen. Am nächsten Morgen die Platte auf eine Fluoreszenzmikroskop-Bühne stellen und mit einem 568-Nanometer-Laser die Fragmente auf eine optimale Kennzeichnung überprüfen.Die Verwendung der geeigneten Verdünnung der Infektion mCherry Adenovirus ist der Schlüssel für eine effiziente Kennzeichnung des Gewebes. Um die entsprechende Konzentration zu bestimmen, müssen für jedes einzelne Experiment mehrere für die mCherry-Verdünnung bewertet werden. Dann übertragen Sie die brillantesten Fragmente in einzelne Brunnen einer neuen 96-Well-Platte mit frischem, komplettem Medium.Mindestens sieben Tage nach der Oophorektomie dekantieren Sie die Endometriumgewebefragmente in eine Petrischale und bestätigen einen Mangel an Reaktion auf Zehenkniff in einem anästhesierten, oophorrectomisierten Tier. Mit der Maus in der Supine-Position desinfizieren Sie den ventralen Bereich und machen Sie einen 1,5 Zentimeter längsigen Schnitt im Bauch. Trennen Sie die Haut vom Muskel und machen Sie einen zweiten 1,5-Zentimeter-Schnitt im Muskel, um auf die Peritonealhöhle zuzugreifen.Halten Sie den linken Rand der bauchigen Muskelwand mit Mini-Zange, falten Sie den Muskel, um das Innengesicht des Peritoneums auf der Außenseite des Tieres zu belichten. Verwenden Sie Mini-Pinezer, um kurz ein Endometriumimplantat in n-Butylester Cyanoacrylat-Klebstoff einweichen und befestigen Sie das Fragment am Peritoneum. Wenn der Klebstoff getrocknet ist, legen Sie ein zweites Implantat auf die kontralaterale Seite des Peritoneums, wie gerade gezeigt.Verwenden Sie eine resorbierbare 6-0 Naht, um die Muskelschicht zu schließen und eine nicht resorbierbare 6-0 Naht, um die Haut zu schließen. Reinigen Sie dann den Hautschnitt mit antiseptischer Lösung und legen Sie das Tier in die Erholungszone mit Überwachung bis zur vollständigen Reemumbency. Für die in-vivo fluoreszierende Bildgebung der implantierten Gewebefragmente schalten 24 bis 48 Stunden nach der Implantationsoperation das In-vivo-Bildgebungssystem ein, initialisieren die Software und lassen die CCD-Kamera für einige Minuten abkühlen.Sobald das Instrument bereit ist, legen Sie die erste beästhesierte Maus in den In-vivo-Bildgebungssystemkäfig, in der Rückenposition, mit dem Kopf in einem Tubuli, der mit der Anästhesiemaschine verbunden ist, und schließen Sie den Deckel. Klicken Sie dann auf Erfassen und Speichern der fünf resultierenden Bilder. Um die In-vivo-Fluoreszenz zu quantifizieren, klicken Sie in der entsprechenden Bildanalysesoftware auf Durchsuchen und wählen Sie die zu analysierende ungemischte Datei aus.Ein neues Fenster wird angezeigt. Klicken Sie auf Zur Liste hinzufügen, um alle nicht gemischten Dateien von jedem Tier zu unterschiedlichen Zeitpunkten einzuschließen, und klicken Sie auf Als Gruppe laden. Alle Bilder sollten in einer einzigen Sequenz angezeigt werden.Deaktivieren Sie im Werkzeugpalettenfenster das Kontrollkästchen für den einzelnen Maßstab, um alle Bilder auf den gleichen Maßstab anzupassen, und doppelklicken Sie auf ein Bild der Sequenz. Um einen Bereich von Interesse zu erstellen, wählen Werkzeuge im Bereich von Interesse die Optionen Kontur und Auto 1 aus, und klicken Sie auf die Kreisform, um den Kreis in der Mitte des Fluoreszenzsignals zu platzieren. Klicken Sie auf Erstellen, um den Interessenbereich zu erstellen, und kopieren und fügen Sie den Interessenbereich auf einem Hintergrund ein, in dem kein Signal vorhanden ist.Klicken Sie dann auf "Interessierte Bereiche" und wählen Sie alle aus, um Werte für die Fluoreszenzintensität jeder Region anzuzeigen, und kopieren und fügen Sie diese Werte in eine Kalkulationstabelle ein. Die Kennzeichnung der Endometriumfragmente erfolgt durch eine Infektion mit dem Adenovirus, das entwickelt wurde, um mCherry auszudrücken, ein Protein, das Fluoreszenz im Nahinfrarotbereich aussendet, das deutlich robuster ist als die nicht infizierte Endometriumgewebe-Autofluoreszenz. Während der Überwachung werden zusätzlich zur Referenzwellenlänge für mCherry fluoreszierende Bilder mit verschiedenen Anregungsemissionswellenlängenfiltern aufgenommen.Um die charakteristischen fluoreszierenden Gewebeemissionsprofile der Läsionen aus dem Hintergrund und die vom Wirtsgewebe emittierte Autofluoreszenz zu definieren, werden die Überwachungsbilder, die rohe Fluoreszenz enthalten, die von den Tieren während jedes Zeitpunkts emittiert werden, unnormalisiert in einer einzigen Datei zusammengefasst. Als nächstes wird die Fluoreszenz ungemischt, normalisiert und als falsches Farbbild dargestellt, und die Interessengebiete, die bestimmten Legions- und Hintergrundsignalen entsprechen, werden vom Programm automatisch erkannt und quantifiziert. Die Hintergrundregion, die von Interesse signalisiert wird, wird von der Legionsregion von Interesse abgezogen.Und die Ergebnisse der Intensität zu jedem Zeitpunkt werden gegen den Zeitpunkt normalisiert, an dem die Intensität maximal ist. Nach mehrwöchiger Überwachung können die lebensfähigen Implantate für weitere nachgelagerte Analysen zurückgewonnen werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Konzentration von Ad-mCherry auszuwählen, die das brillanteste Signal liefert, ohne die Lebensfähigkeit des Gewebes zu beeinträchtigen.Nach diesem Verfahren können die Läsionen wiederhergestellt und verwendet werden, um zusätzliche Unterscheidungsparameter zu untersuchen. Dieses Verfahren ist für die nicht-invasive Überwachung von xenograft menschlichen Endometrioseläsionen optimiert. Jedoch, Es kann leicht angepasst werden, um die Auswirkungen eines bestimmten Arzneimittels von Interesse auf die Standorte eines Xenograft in Echtzeit zu bewerten.

Research

JoVE Journal

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Forschung

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Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massenspektrometrieanalyse zur Identifizierung der Ubiquitylierung von EIFP-A mit EYFP-Tags (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Visualisierung von Replisom-Begegnungen mit einer Antigen-markierten blockierenden Läsion

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Ein Mausmodell der Lumbar Spine Instability

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Überwachung des dynamischen Wachstums von Netzhautgefäßen im sauerstoffinduzierten Retinopathie-Mausmodell

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...