Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

העבודה הזאת הייתה נתמך על ידי ספרדית משרד הכלכלה ואת התחרותיות באמצעות התוכנית Servet מיגל [CP13 00077] הקים על ידי פדר (קרן פיתוח אזורי אירופה), זכה ד ר ר גומז כמו גם על ידי קרלוס השלישי המכון לבריאות מענקים ד ר גומז R [PI14/00547, PI17/02329], פרופ ' / ח' א קאנו [PI12 02582].

השימוש של דגימות רקמה אנושית אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של בית החולים Universitario La Fe. כל המטופלים מסופקים בכתב הסכמה מדעת. המחקר המערבות בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה טיפול בעלי חיים מוסדיים ב ולנסיה סנטרו דה Investigacion פרינסיפה פליפה, כל ההליכים שבוצעו בעקבות הנחיות טיפול ושימוש י?...

<ol>
	<li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+endometriosis.">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li><li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis+and+infertility.">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li><li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endometriosis.">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li><li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis.">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain.">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li><li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+(Papio+anubis,+Papio+cynocephalus).">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li><li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony.">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li><li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions.">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility &amp; Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li><li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+endometriosis+research.">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression.">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li><li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+endometriosis:+validation+of+an+in-vivo+model.">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li><li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-invasive+model+of+endometriosis+for+monitoring+the+efficacy+of+antiangiogenic+therapy.">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li><li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions.">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li><li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenesis+therapy+for+endometriosis.">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+(Pro-EGCG)+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice.">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li><li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis.">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li><li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers.">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 197 (6), 578 (2007).</li><li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis.">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis.">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis:+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method.">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li></ol>

פרוטוקול מפורט במסמך זה מתאר את היישום של מודל חיה של אנדומטריוזיס שבו נשמר את הארכיטקטורה של השתלת נגעים אדריכלות בזמן בו זמנית ומאפשר הערכה בזמן אמת של קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי mCherry מתויג רקמת רירית הרחם. ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השימוש של מערכת הדמיה ויוו ספציפיות וכן תוכנו...

אנדומטריוזיס היא מחלה כרונית גניקולוגיות שיזם ההשתלה של רירית הרחם פונקציונלי מחוץ חלל הרחם. חוץ רחמי נגעים גדלים, זירוז תהליכים דלקתיים שמוביל כרונית האגן כאב שרירים פוריות1. ההערכה היא כי עד כדי 10 – 15% מהנשים בגיל הפריון הושפעו endometriosis2, זה קיים כ- 40%-50% של נשים עקרה3. טיפולים שוטפים תרופתי אנדומטריוזיס הינם מסוגל לחסל לחלוטין נגעים לא ללא תופעות לוואי4,5. המחקר עבור טיפולים יעילים יותר מחייב של העידון של הדגמים בעלי חיים הקיים של אנדומטריוזיס באופן כזה כי יכול להיות חיקה כראוי האנושי נגעים, ההשפעות של תרכובות על גודל הנגע בין היתר יכול להידרש מקרוב.
פרימטים הדגמים השתמשו כדי לחקות אנדומטריוזיס מאת נגעים חוץ רחמי implanting זהה בהיסטולוגיה, באתרים דומים כמו בני אדם6,7,8; עם זאת, חששות אתיים והעלויות כלכלית גבוהה קשורה ניסויים עם מגבלת פרימטים שלהם לשימוש9. כתוצאה מכך, השימוש של בעלי חיים קטנים, בעיקר מכרסמים, ליישום בבית-vivo מודלים של אנדומטריוזיס ימשיך להיות העדיף שכן היא מאפשרת לימודי עם מספר גדול של אנשים10,11. אנדומטריוזיס יכול להיגרם בבעלי חיים אלה על ידי משתילים חתיכות של מכרסמים הרחם קרניים ("מודלים הומולוגיים")12,13 או רקמה רירית הרחם/endometriotic אנושית לאתרים חוץ רחמי (מודלים heterologous)14 . בניגוד לבני אדם, מכרסמים אל תזילו רקמת רירית הרחם שלהם, ובכך אנדומטריוזיס לא ניתן לפתח באופן ספונטני במינים אלו. לכן, העכבר הומולוגי מודלים של אנדומטריוזיס ננזף בשל העובדה כי מושתל רקמת הרחם חוץ רחמי העכבר אינו משקף את מאפייני האנושי נגעים endometriotic15.
פיזיולוגיה המתאים של אנדומטריוזיס יכול חיקה במודלים heterologous של אנדומטריוזיס איפה טריים האנושי קטעי רירית הרחם מושתלים לתוך חיות immunodeficient. במודלים heterologous המקובלת, ההשפעות הטיפוליות של תרכובות עניין הם בדרך כלל לאומדן בנקודת הקצה ההערכה של גודל הנגע בעזרת מחוגה16. מגבלה ברור הוא, ככזה, הקצה של מודלים בעלי חיים אינם מאפשרים לימוד הדינמיקה ההשתלה או התפתחות הנגע endometriotic לאורך זמן. מגבלה נוספת היא כי השימוש מחוגה אינו מאפשר מדידות מדויקות של גודל הנגע. אכן, שגיאת התקן שסופק על-ידי מחוגה הוא בטווח זהה (קרי, מילימטרים) כגודל של נגעים שהושתלו בעכברים, לפיכך הגבלת הקיבולת של כלים אלה כדי לזהות וריאציות בפועל בגודלם.
כדי להתגבר על מגבלות כאלה, במסמך זה, אנו מתארים את הדור של מודל heterologous העכבר של אנדומטריוזיס בו מושתל רקמה אנושית מתוכנן לבטא m-שרי כתב חלבון פלואורסצנטי. זיהוי של האות פלורסנט עם מערכת התמונה מאפשר בקרה בלתי פולשני של מצב הנגע באמצעות כימות בו זמנית הגודל שלה בזמן אמת. לפיכך, המודל שלנו מספק יתרונות משמעותיים בהשוואה למודלים קצה קונבנציונאלי כשהוא מחזיר את ההזדמנות של ניטור פולשני בזמן אמת ועל האפשרות לביצוע יותר אובייקטיבית, אומדן מדויק של וריאציות בגודל הנגע.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול ליישום מודל העכבר heterologous שבו ההתקדמות של אנדומטריוזיס יכול להיות מוערך בזמן אמת באמצעות ניטור לא פולשנית של זריחה הנפלטת מושתל חוץ רחמי רקמה רירית הרחם אנושית. למטרה זו, ביופסיות של רירית הרחם האנושי מתקבלים מתרומה oocyte מתמשך של התורם נשים. קטעי רירית הרחם אדם מתורבתים בנוכחות adenoviruses מתוכנן cDNA אקספרס עבור mCherry חלבון פלואורסצנטי הכתב. על ויזואליזציה, תוויות רקמות עם שיעור אופטימלית של קרינה פלואורסצנטית לאחר זיהום נבחרו לאחר מכן עבור ההשתלה בעכברים הנמען. שבוע לפני ניתוח ההשתלה, עכברים הנמענים הם oophorectomized, כדורי אסטרדיול ממוקמים subcutaneously לקיים את הישרדות וצמיחה של נגעים. ביום של הניתוח עכברים הם מרדימים, ואת הצפק חלל לגשת דרך חתך קטן (כ- 1.5 ס מ) על ידי לינאה-אלבה. שתלים fluorescently שכותרתו tweezed, בקצרה טבולים בדבק, מחוברת לשכבה הצפק. חתכים ומאחים והשאירו חיות להתאושש במשך כמה ימים. קרינה פלואורסצנטית הנפלטים על ידי שתלים endometriotic בדרך כלל לא פולשני מנוטר כל 3 ימים 4 שבועות עם מערכת הדמיה ויוו. וריאציות בגודל של endometriotic שתלים יכול להיות בזמן אמת לפי אומדן כימות של mCherry אות ו נורמליזציה נגד הראשונית הזמן נקודת-מציג עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקסימלי.
מכרסמים פרה המסורתי של מודלים של אנדומטריוזיס אינם מאפשרים פיקוח בלתי פולשני של הנגע בזמן אמת אבל מאפשר הערכת ההשפעות של תרופות לבדיקה על נקודת הקצה. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב אחר נגעים בזמן אמת והוא שימושי יותר לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של תרופות במודלים פרה של אנדומטריוזיס. המגבלה העיקרית של המודל כך שנוצר הוא כי ניטור פולשני אינו אפשרי על פני תקופות זמן בשל ביטוי episomal של Ad-וירוס.

כאן, אנו מתארים את התהליך ליצירת מודל heterologous של אנדומטריוזיס שבו הארכיטקטורה של נגעים נשמר על ידי השתלת fluorescently שכותרתו פיסות רירית הרחם אנושי לתוך immunocompromised עכברים, ובכך מאפשר לא פולשנית ניטור של התקדמות הנגע. תיוג של קטעי רירית הרחם מושגת על-ידי זיהום עם אדנו מתוכנן mCherry...

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור live-הדמיה של fluorescently שכותרתו קטעי רירית הרחם האנושי הושתל בעכברים. השיטה מאפשרת ללמוד את השפעות הסמים על גודל הנגע endometriotic באמצעות ניטור, כימות של זריחה הנפלטים על ידי הכתבת פלורסנט בזמן אמת

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בהערכת השפעות תרופתיות טיפוליות בתחום אנדומטריוזיס, כגון ההשפעות של תרכובות אנטי אנדרוגנית על גודל נגעים אנדומטריוטיים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי ההשפעות של תרופות ספציפיות ניתן להעריך במודלים של בעלי חיים של אנדומטריוזיס בזמן אמת, ולא בסוף. הדגמת ההליך תהיה ג'סיקה מרטינז, שהיא טכנאית מהמעבדה שלי, כמו גם ויויאנה ביסבל ונרה מרין, שהם וטרינרים מסטרו דה אינטיגאצ'יון פרינסיפה פליפה והם משתפי פעולה קרובים עם הצוות שלנו.יומיים עד שלושה ימים לפני ניתוח השתל, מעבירים שברי ביופסיה של רקמת רירית לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה מדיום מלא, ולהשתמש באזמלים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קוביות של חמישה עד 10 מילימטרים. באמצעות micropipette, להוסיף 30 עד 50 טיפות microliter של DMEM על פני החלק התחתון של צלחת תרבות חדשה 10 ס"מ, משאיר מספיק מקום בין כל טיפה, כך שהם לא באים במגע אחד עם השני. כאשר כל הטיפות הונחו, השתמש במחט מזרק כדי למקם חתיכה אחת של שבר רקמת ביופסיה לתוך כל טיפה.לאחר מכן, להוסיף 100 כדי 200 microliters של אדנו-mCherry מוכן טרי ל הבאר אחת של צלחת 96 גם לכל שבר רקמה, בתוספת שלוש בארות עם DMEM חינם אדנווירוס כבקרה שלילית. לאחר מכן השתמש במחט כדי להעביר דגימת רקמה אחת לתוך כל באר של פתרון אדנו-mCherry עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. למחרת בבוקר מניחים את הצלחת על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולהשתמש לייזר 568 ננומטר כדי לבדוק את השברים עבור תיוג אופטימלי.באמצעות הדילול המתאים של להדביק אדנווירוס mCherry הוא המפתח לתיוג יעיל של הרקמה. אז כדי לקבוע את הריכוז המתאים, כמה עבור דילול mCherry, עבור כל ניסוי בודדים, יש להעריך. לאחר מכן להעביר את השברים המבריקים ביותר לתוך בארות בודדות של צלחת חדשה 96 גם המכיל טרי, מדיום שלם.לפחות שבעה ימים לאחר כריתת אופורקטום, decant שברי רקמת רירית הרחם לתוך צלחת פטרי, ולאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בבעל חיים הרדמה, oophorectomized. עם העכבר במצב supine לחטא את אזור הגחון ולעשות חתך אורך 1.5 ס"מ בבטן. להפריד את העור מן השריר ולעשות חתך שני 1.5 ס"מ בשריר כדי לגשת לחלל צנית.מחזיק את הקצה השמאלי של דופן שרירי הבטן עם מאלץ מיני, לקפל את השריר כדי לחשוף את הפנים הפנימיות של הצפק בצד החיצוני של החיה. השתמשו במיני פינצטה כדי להשרות בקצרה שתל רירית רירית ריחיים אחד בבקתת n-butyl ester cyanoacrylate ולצרף את השבר לצפא. כאשר דבק מיובש, מניחים שתל שני בצד הנגדי של ההקפאה כפי שהוכח רק.השתמש בתפר 6-0 נספג כדי לסגור את שכבת השריר ותפר 6-0 שאינו נספג כדי לסגור את העור. לאחר מכן לנקות את חתך העור עם פתרון חיטוי ולמקום את החיה באזור ההתאוששות עם ניטור עד שיקום מלא. עבור הדמיה פלואורסצנטי in-vivo של שברי הרקמה המושתלת, 24 עד 48 שעות לאחר ניתוח ההשתלה להפעיל את מערכת ההדמיה in-vivo, לאתחל את התוכנה, ולאפשר למצלמת CCD להתקרר במשך כמה דקות.לאחר המכשיר מוכן למקם את העכבר ההרדמה הראשון לתוך כלוב מערכת הדמיה in-vivo, בתמקמת סופין, עם הראש בתוך צינור מחובר למכונת ההרדמה, ולסגור את המכסה. לאחר מכן לחצו על 'רכוש' ושמור את חמש התמונות המתקבלות. כדי לכמת את הפלואורסצנטיות in-vivo, בתוכנת ניתוח התמונה המתאימה לחץ על עיון ובחר את קובץ העניין הבלתי מעורער שיש לנתח.יופיע חלון חדש. לחץ על הוסף לרשימה כדי לכלול את כל הקבצים שאינם מעוכים מכל חיה בנקודות זמן שונות ולחץ על טען כקבוצה. כל התמונות אמורות להופיע ברצף אחד.בחלון לוח הכלים, בטל את הבחירה בתיבת הסימון קנה מידה בודד כדי להתאים את כל התמונות לאותו קנה מידה, ולחץ פעמיים על תמונה אחת של הרצף. ליצירת אזור מעניין, באזור כלי העניין בחרו באפשרויות קווי המתאר וה האוטומטיים, ולחצו על צורת המעגל כדי למקם את המעגל במרכז האות הפלואורסצנטי. לחץ על צור כדי ליצור את אזור העניין ולהעתיק ולהדביק את אזור העניין על רקע שבו אין אות.לאחר מכן לחץ על למדוד אזורים מעניינים ובחר הכל כדי להציג ערכים עבור עוצמת הפלואורסצנטיות של כל אזור ולהעתיק ולהדביק ערכים אלה בגיליון אלקטרוני. התיוג של שברי רירית האנדומטריה מושגת על ידי זיהום עם אדנווירוס מהונדס לבטא mCherry, חלבון פולט פלואורסצנטיות בסעיף כמעט אינפרא אדום כי הוא משמעותית חזק יותר מאשר autofluorescence רקמת רירית רירית האנדומטריה שאינם נגועים. במהלך הניטור, בנוסף לאורך גל הייחוס עבור mCherry, תמונות פלואורסצנטיות נלקחות עם זוגות שונים של מסנני אורך גל של פליטת בעירור.כדי להגדיר את פרופילי פליטת הרקמות הפלואורסצנטיות האופייניות של הנגעים מרקע, ואת שפעת אוטומטית הנפלטת על ידי הרקמות המארחות, תמונות הניטור המכילות פלואורסצנטיות גולמית הנפלטת על ידי בעלי החיים במהלך כל נקודת זמן מובאים יחד, לא מתומלים, בקובץ אחד. לאחר מכן, הפלואורסצנטיות אינה ממורמלת, מנורמלת ומיוצגת כתמונה צבעונית כוזבת, ואזורי האינטרסים המתאימים לאותות לגיון ורקע ספציפיים מזוהים באופן אוטומטי על-ידי התוכנית ומכומתים. אזור הרקע של איתות עניין הוא מופחת מאזור הלגיון של איתות עניין.ותוצאות האינטנסיביות בכל נקודת זמן מנורמלות כנגד נקודת הזמן שבה האינטנסיביות היא מקסימלית. לאחר מספר שבועות של ניטור, ניתן לשחזר את השתלים קיימא לניתוח במורד הזרם. בעת ניסיון הליך זה חשוב לזכור לבחור את הריכוז של Ad-mCherry המספק את האות המבריק ביותר מבלי להתפשר על הכדאיות של הרקמה.בעקבות הליך זה, הנגעים ניתן לשחזר ושמש ללמוד פרמטרים ייחודיים נוספים. הליך זה מותאם לניטור לא פולשני של נגעים אנדומטריוזיס אנושיים קסנוגרפט. עם זאת, זה יכול להיות בקלות להסתגל להערכת ההשפעות של תרופות ספציפיות של עניין באתרים של xenograft בזמן אמת.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

לטווח ארוך רעילות מבחן קטלני עם לסרטן הארטמיה franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

אימות של מודל עכבר לשבש מכלולי LINC באופן ספציפי בתא

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

דגם העכבר של חסימת מעיים חלקית

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

הדמיה של מפגשים רפליזומיים עם נגע חוסם מתויג אנטיגן

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

דגם עכבר של חוסר יציבות בעמוד השדרה המותני

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...