Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Ministero spagnolo dell'economia e la competitività attraverso il Miguel Servet programma [CP13/00077] ha cofondato dal FESR (Fondo europeo di sviluppo regionale) e assegnato a Dr R. Gómez nonché da Carlos III Istituto superiore di sanità sovvenzioni conferite Dr R Gómez [PI14/00547 e PI17/02329] e Prof A. Cano [PI12/02582].

L'uso di campioni di tessuto umano è stato approvato dal comitato etico dell'Ospedale Universitario La Fe e Institutional Review Board. Tutti i pazienti hanno fornito consenso informato scritto. Lo studio che coinvolgono gli animali è stato approvato dal comitato di cura animale istituzionale presso il Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e tutte le procedure sono state effettuate seguendo le linee guida per la cura e l'uso dei mammiferi da istituti nazionali della salute.
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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+(Pro-EGCG)+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice.">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li><li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis.">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li><li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers.">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 197 (6), 578 (2007).</li><li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis.">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis.">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis:+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method.">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li></ol>

Il protocollo dettagliato nel presente documento viene descritta l'implementazione di un modello animale di endometriosi in cui l'architettura di impiantare architettura lesioni è conservata mentre simultaneamente permettendo la valutazione di tempo reale della fluorescenza emessa da mCherry con l'etichetta tessuto endometriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un specifico sistema di imaging in vivo e relativo software per valutare in modo non invasivo fluorescenza emessa dalla lesione con etichetta. Ogni ute...

L'endometriosi è un disturbo ginecologico cronico avviato tramite l'impianto dell'endometrio funzionale di fuori della cavità uterina. Le lesioni ectopiche crescono e inducono processi infiammatori che conduce a dolore e sterilità pelvica cronica1. Si stima che fino a 10-15% delle donne dell'età riproduttiva sono affetti da endometriosis2, ed è presente in circa il 40-50% delle donne infertili3. Gli attuali trattamenti farmacologici per endometriosi sono in grado di eliminare completamente le lesioni e non privo di effetti collaterali4,5. La ricerca di terapie più efficiente richiede del perfezionamento dei modelli animali esistenti di endometriosi in modo tale che le lesioni umane possono essere imitate in modo appropriato, e gli effetti dei composti sulla dimensione della lesione tra gli altri possono essere valutati molto attentamente.
Primate modelli sono stati utilizzati per simulare l'endometriosi di impiantare le lesioni ectopiche istologicamente identiche e a siti simili come in esseri umani6,7,8; Tuttavia, preoccupazioni etiche e gli elevati costi economici legate alla sperimentazione con primati limite loro uso9. Di conseguenza, l'uso di piccoli animali, specialmente roditori, per la realizzazione di modelli in vivo di endometriosi continua ad essere favorito in quanto consente di studi con i più grandi numeri di individui10,11. L'endometriosi può essere indotta in questi animali trapiantando o pezzi di roditore corni uterini "(modelli di omologhe")12,13 o tessuto umano dell'endometrio/endometriosiche per luoghi ectopici (modelli eterologhe)14 . In contrasto con gli esseri umani, roditori non versato il loro tessuto dell'endometrio e quindi l'endometriosi non possono essere sviluppata spontaneamente in queste specie. Pertanto, omologa mouse modelli di endometriosi sono state criticate in quanto impiantato tessuto uterino ectopica del mouse non riflette le caratteristiche delle lesioni endometriosiche umane15.
Fisiologia appropriata di endometriosi può essere imitato nei modelli eterologi di endometriosi dove frammenti endometriali umane fresche vengono impiantati in animali immunodeficienti. In modelli convenzionali eterologi, gli effetti terapeutici di composti di interesse sono comunemente valutati al punto finale dalla valutazione della dimensione della lesione con l'uso di pinze16. Una limitazione evidente è che, come tale, modelli animali dell'endpoint non consentono studiando l'impianto dynamics o lo sviluppo della lesione endometriotic nel corso del tempo. Un'ulteriore limitazione è che l'uso dei calibri non consente misure accurate della dimensione della lesione. Infatti, l'errore standard fornito da pinze è nella stessa fascia (cioè millimetri) come la dimensione delle lesioni impiantati nei topi, limitando così la capacità di questi strumenti per rilevare variazioni effettive dimensioni.
Al fine di superare tali limitazioni, qui, descriviamo la generazione di un modello murino eterologo di endometriosi in cui tessuto umano impiantato è costruita per esprimere una proteina fluorescente di reporter m-Cherry. Rilevamento del segnale fluorescente con un sistema di immagine appropriata consente il monitoraggio non invasivo dello status di lesione con quantificazione simultanea delle sue dimensioni in tempo reale. Così, il nostro modello fornisce chiari vantaggi rispetto ai modelli convenzionali endpoint in quanto porta l'opportunità di non invasivo di monitoraggio in tempo reale e la possibilità di eseguire più obiettivo e stima accurata delle variazioni nella dimensione della lesione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Qui, descriviamo un protocollo per l'attuazione di un modello di topo eterologo in cui progressione di endometriosi può essere valutata in tempo reale attraverso il monitoraggio non invasivo della fluorescenza emessa dal tessuto dell'endometrio umano ectopico impiantato. Per questo scopo, le biopsie dell'endometrio umano vengono ottenute dalla donazione di ovociti in corso donne di donatore. Frammenti dell'endometrio umani sono coltivate in presenza di adenovirus progettato per esprimere cDNA per il reporter proteina fluorescente mCherry. Al momento della visualizzazione, etichettato tessuti con un tasso ottimo di fluorescenza dopo infezione successivamente vengono scelti per l'impianto in topi destinatari. Una settimana prima dell'intervento di impianto, destinatari topi sono oophorectomized e pallini di estradiolo sono posizionati per via sottocutanea per sostenere la sopravvivenza e la crescita delle lesioni. Il giorno dell'intervento, i topi sono anestetizzate e peritoneale cavità accessibili attraverso un'incisione di piccole dimensioni (1,5 cm) da linea-alba. Impianti fluorescente contrassegnati sono tweezed, brevemente imbevuti di colla e attaccati allo strato peritoneale. Incisioni sono suturate e gli animali lasciati a recuperare per un paio di giorni. Fluorescenza emessa da impianti endometriosici solitamente non invasivo è monitorata ogni 3 giorni per 4 settimane con un sistema di imaging in vivo. Variazioni nelle dimensioni di impianti endometriosici possono essere stimate in tempo reale mediante la quantificazione del segnale mCherry e normalizzazione contro il tempo-punto iniziale che mostra l'intensità di fluorescenza massima.
Roditori tradizionale preclinici di modelli di endometriosi non consentono il monitoraggio non invasivo della lesione in tempo reale, ma piuttosto consentono la valutazione degli effetti di farmaci dosati al punto finale. Questo protocollo permette di tenere traccia di lesioni in tempo reale ed è più utile per esplorare il potenziale terapeutico di farmaci in modelli preclinici di endometriosi. Il limite principale del modello così generato è che il monitoraggio non invasivo non è possibile per lunghi periodi di tempo a causa dell'espressione episomal del annuncio-virus.

Qui, descriviamo il processo per la creazione di un modello eterologo di endometriosi che conserva l'architettura delle lesioni impiantando fluorescente contrassegnati pezzi di endometrio umano in topi immunocompromessi, consentendo in tal modo non invasivo monitoraggio della progressione della lesione. Etichettatura dei frammenti endometriali è raggiunto tramite l'infezione con l'adenovirus progettato per esprimere mCherry, una proteina che emettono fluorescenza nella regione del vicino...

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Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Qui, presentiamo un protocollo per l'imaging di vivere di frammenti endometriali umane fluorescente contrassegnati innestate nei topi. Il metodo permette di studiare gli effetti dei farmaci di scelta sulla dimensione della lesione endometriotic attraverso il monitoraggio e la quantificazione della fluorescenza emessa dal reporter fluorescente in tempo reale

Monitoraggio non invasivo della dimensione della lesione in un modello murino eterologo di endometriosi

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella valutazione degli effetti terapeutici dei farmaci nel campo dell'endometriosi, come gli effetti dei composti anti-androgeni sulle dimensioni delle lesioni endometriotiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che gli effetti dei farmaci specifici possono essere valutati nei modelli animali di endometriosi in tempo reale, piuttosto che all'endpoint. A dimostrare la procedura saranno Jessica Martinez, che è una tecnico del mio laboratorio, così come Viviana Bisbal e Nerea Marin, che sono veterinari del Centro de Investigacion Principe Felipe e che sono stretti collaboratori del nostro team.Da due a tre giorni prima dell'intervento chirurgico dell'impianto, trasferire frammenti di biopsia del tessuto endometriale risciacquati e sani in una piastra di Petri di 10 centimetri contenente mezzo completo e utilizzare bisturi per tritare il tessuto in pezzi a cubetti da cinque a 10 millimetri. Utilizzando una micropipetta, aggiungere da 30 a 50 gocce di microliter di DMEM sul fondo di un nuovo piatto di coltura di 10 centimetri, lasciando abbastanza spazio tra ogni goccia in modo che non entrano in contatto tra loro. Quando tutte le gocce sono state posizionate, utilizzare un ago per siringhe per posizionare un singolo pezzo di frammento di tessuto di biopsia in ogni goccia.Successivamente, aggiungere da 100 a 200 microlitri di adeno-mCherry appena preparati a un pozzo di una piastra da 96 porri per frammento di tessuto, più tre pozzi con DMEM privo di adenovirus come controllo negativo. Quindi utilizzare l'ago per trasferire un campione di tessuto in ogni pozzo di soluzione adeno-mCherry per un'incubazione notturna a 37 gradi celsius e 5%CO2. La mattina seguente posizionare la piastra su uno stadio di microscopio a fluorescenza e utilizzare un laser da 568 nanometri per controllare i frammenti per un'etichettatura ottimale.L'uso dell'appropriata diluizione dell'infezione da adenovirus mCherry è fondamentale per un'etichettatura efficiente del tessuto. Pertanto, per determinare la concentrazione appropriata, è necessario valutarsi diversi per la diluizione di mCherry, per ogni singolo esperimento. Quindi trasferire i frammenti più brillanti in singoli pozzi di una nuova piastra da 96 pozza contenente mezzo fresco e completo.Almeno sette giorni dopo l'oophorectomia, decantare i frammenti di tessuto endometriale in una piastra di Petri e confermare la mancanza di risposta al pizzico in un animale anestetizzato e ooforrectomizzato. Con il topo in posizione supina disinfettare l'area ventrale e fare un'incisione longitudinale di 1,5 centimetri nell'addome. Separare la pelle dal muscolo e fare una seconda incisione di 1,5 centimetri nel muscolo per accedere alla cavità peritoneale.Tenendo il bordo sinistro della parete muscolare addominale con mini-forcep, piegare il muscolo per esporre la faccia interna del peritoneo all'esterno dell'animale. Utilizzare mini-pinzette per immergere brevemente un impianto endometriale nell'adesivo cianoacrilato n-butile estere e attaccare il frammento al peritoneo. Quando l'adesivo viene asciugato, posizionare un secondo impianto sul lato conlaterale del peritoneo come appena dimostrato.Utilizzare una sutura assorbibile 6-0 per chiudere lo strato muscolare e una sutura 6-0 non assorbibile per chiudere la pelle. Quindi pulire l'incisione cutanea con soluzione antisettica e posizionare l'animale nella zona di recupero con il monitoraggio fino alla piena rimescenza. Per l'imaging fluorescente in vivo dei frammenti di tessuto impiantato, da 24 a 48 ore dopo l'intervento chirurgico di impianto accendere il sistema di imaging in vivo, inizializzare il software e consentire alla fotocamera CCD di raffreddarsi per alcuni minuti.Una volta che lo strumento è pronto posizionare il primo mouse anestetizzato nella gabbia del sistema di imaging in vivo, in posizione supina, con la testa all'interno di un tubulo collegato alla macchina per anestesia e chiudere il coperchio. Quindi fare clic su acquisisci e salva le cinque immagini risultanti. Per quantificare la fluorescenza in vivo, nell'apposito software di analisi delle immagini fare clic su sfoglia e selezionare il file non mixed di interesse da analizzare.Verrà visualizzata una nuova finestra. Fare clic su Aggiungi all'elenco per includere tutti i file non mesati di ogni animale in diversi punti di tempo e fare clic su Carica come gruppo. Tutte le immagini devono essere visualizzate in un'unica sequenza.Nella finestra della tavolozza degli strumenti deselezionare la casella di controllo Scala singola per regolare tutte le immagini sulla stessa scala e fare doppio clic su un'immagine della sequenza. Per creare un'area di interesse, nella regione di interesse gli strumenti selezionano le opzioni contorno e auto una e fate clic sulla forma cerchio per posizionare il cerchio al centro del segnale fluorescente. Fare clic su crea per creare l'area di interesse e copiare e incollare l'area di interesse su uno sfondo in cui non è disponibile alcun segnale.Quindi fare clic su misura aree di interesse e selezionare tutto per visualizzare i valori per l'intensità di fluorescenza di ogni regione e copiare e incollare questi valori in un foglio di calcolo. L'etichettatura dei frammenti endometriali è ottenuta per infezione da adenovirus progettato per esprimere mCherry, una proteina che emette fluorescenza nella sezione del vicino infrarosso che è significativamente più robusta dell'autofluorescenza del tessuto endometriale non infetto. Durante il monitoraggio, oltre alla lunghezza d'onda di riferimento per mCherry, vengono scattate immagini fluorescenti con diverse coppie di filtri di lunghezza d'onda di emissione di eccitazione.Per definire i caratteristici profili di emissione dei tessuti fluorescenti delle lesioni dallo sfondo e l'autofluorescenza emessa dai tessuti ospiti, le immagini di monitoraggio contenenti fluorescenza grezza emessa dagli animali durante ogni punto di tempo vengono riunite, non normalizzate, in un unico file. Successivamente, la fluorescenza viene unmixed, normalizzata e rappresentata come una falsa immagine a colori, e le regioni di interesse corrispondenti a specifici segnali di legione e sfondo vengono automaticamente riconosciute dal programma e quantificate. La regione di fondo di segnalazione di interesse viene sottratta dalla regione legione di segnalazione di interesse.E i risultati dell'intensità in ogni punto di tempo sono normalizzati rispetto al punto di tempo in cui l'intensità è massima. Dopo diverse settimane di monitoraggio, gli impianti vitali possono essere recuperati per ulteriori analisi a valle. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di selezionare la concentrazione di Ad-mCherry che fornisce il segnale più brillante senza compromettere la vitalità del tessuto.Seguendo questa procedura, le lesioni possono essere recuperate e utilizzate per studiare ulteriori parametri distintivi. Questa procedura è ottimizzata per il monitoraggio non invasivo delle lesioni dell'endometriosi umana xenograft. Tuttavia, può essere facilmente adatto per valutare gli effetti di uno specifico farmaci di interesse sui siti di uno xenograft in tempo reale.

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A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Un modello murino di ostruzione intestinale parziale

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Visualizzazione di incontri replisali con una lesione bloccante con tag antigene

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Un modello di topo di instabilità della colonna lombare

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Monitoraggio della crescita dinamica dei vasi retinici in un modello murino di retinopatia indotta da ossigeno

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...