Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av spanske departementet for økonomi og konkurranseevne gjennom Miguel Servet programmet [CP13/00077] etablert av FEDER (European Regional Development Fund) og tildelt Dr. R. Gómez tillegg Carlos III Institute of Health tilskudd tildelt Dr. R Gómez [PI14/00547 og PI17/02329] og Prof A. Cano [PI12/02582].

Bruk av menneskelige vevsprøver ble godkjent av institusjonelle Review Board og etikk Hospital Universitario La fe. Alle pasienter gitt skriftlig samtykke. Undersøkelsen omfatter dyr ble godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen på Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, og alle prosedyrer ble utført følge retningslinjene og bruk av pattedyr fra de nasjonale institutter helse.
1. endometrial vev innsamling og pre-prosessering
<ol><li>Få en god kvalitet biopsy av menn...

<ol>
	<li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+endometriosis.">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li><li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis+and+infertility.">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li><li>Eskenazi, B., Warner, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endometriosis.">Epidemiology of endometriosis.</a> Obstetrics and Gynecology Clinics of North America. 24 (2), 235-258 (1997).</li><li>Giudice, L. C., Kao, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis.">Endometriosis.</a> Lancet. 364 (9447), 1789-1799 (2004).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+medical+and+surgical+treatment+of+endometriosis-associated+infertility+and+pelvic+pain.">The efficacy of medical and surgical treatment of endometriosis-associated infertility and pelvic pain.</a> Gynecologic and Obstetric Investigation. 54, 2-7 (2002).</li><li>D'Hooghe, T. M., Bambra, C. S., Cornillie, F. J., Isahakia, M., Koninckx, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+laparoscopic+appearance+of+spontaneous+endometriosis+in+the+baboon+(Papio+anubis,+Papio+cynocephalus).">Prevalence and laparoscopic appearance of spontaneous endometriosis in the baboon (Papio anubis, Papio cynocephalus).</a> Biology of Reproduction. 45 (3), 411-416 (1991).</li><li>Dick, E. J., Hubbard, G. B., Martin, L. J., Leland, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Record+review+of+baboons+with+histologically+confirmed+endometriosis+in+a+large+established+colony.">Record review of baboons with histologically confirmed endometriosis in a large established colony.</a> Journal of Medical Primatology. 32 (1), 39-47 (2003).</li><li>Donnez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+endometriotic+nodules+in+an+experimental+baboon+modelmimicking+human+deep+nodular+lesions.">Induction of endometriotic nodules in an experimental baboon modelmimicking human deep nodular lesions.</a> Fertility &amp; Sterility. 99 (3), 783-789 (2013).</li><li>Grummer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+in+endometriosis+research.">Animal models in endometriosis research.</a> Human Reproduction Update. 12 (5), 641-649 (2006).</li><li>Rossi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+aspects+of+endometriosis+in+a+mouse+model+through+analysis+of+implantation+and+progression.">Dynamic aspects of endometriosis in a mouse model through analysis of implantation and progression.</a> Archives of Gynecology and Obstetrics. 263 (3), 102-107 (2000).</li><li>Grummer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peritoneal+endometriosis:+validation+of+an+in-vivo+model.">Peritoneal endometriosis: validation of an in-vivo model.</a> Human Reproduction. 16 (8), 1736-1743 (2001).</li><li>Becker, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+non-invasive+model+of+endometriosis+for+monitoring+the+efficacy+of+antiangiogenic+therapy.">A novel non-invasive model of endometriosis for monitoring the efficacy of antiangiogenic therapy.</a> The American Journal of Pathology. 168 (6), 2074-2084 (2006).</li><li>Laschke, M. W., Giebels, C., Nickels, R. M., Scheuer, C., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+progenitor+cells+contribute+to+the+vascularization+of+endometriotic+lesions.">Endothelial progenitor cells contribute to the vascularization of endometriotic lesions.</a> The American Journal of Pathology. 178 (1), 442-450 (2011).</li><li>Nap, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiangiogenesis+therapy+for+endometriosis.">Antiangiogenesis therapy for endometriosis.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 89 (3), 1089-1095 (2004).</li><li>Wang, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prodrug+of+green+tea+epigallocatechin-3-gallate+(Pro-EGCG)+as+a+potent+anti-angiogenesis+agent+for+endometriosis+in+mice.">Prodrug of green tea epigallocatechin-3-gallate (Pro-EGCG) as a potent anti-angiogenesis agent for endometriosis in mice.</a> Angiogenesis. 16 (1), 59-69 (2013).</li><li>Delgado-Rosas, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+ergot+and+non-ergot-derived+dopamine+agonists+in+an+experimental+mouse+model+of+endometriosis.">The effects of ergot and non-ergot-derived dopamine agonists in an experimental mouse model of endometriosis.</a> Reproduction. 142 (5), 745-755 (2011).</li><li>Al-Jefout, M., Andreadis, N., Tokushige, N., Markham, R., Fraser, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pilot+study+to+evaluate+the+relative+efficacy+of+endometrial+biopsy+and+full+curettage+in+making+a+diagnosis+of+endometriosis+by+the+detection+of+endometrial+nerve+fibers.">A pilot study to evaluate the relative efficacy of endometrial biopsy and full curettage in making a diagnosis of endometriosis by the detection of endometrial nerve fibers.</a> American Journal of Obstetrics &amp; Gynecology. 197 (6), 578 (2007).</li><li>Fortin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+human+endometriotic+tissue+maintenance+and+regression+in+a+noninvasive+mouse+model+of+endometriosis.">Quantitative assessment of human endometriotic tissue maintenance and regression in a noninvasive mouse model of endometriosis.</a> Molecular Therapy. 9 (4), 540-547 (2004).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+nude+mouse+models+for+green+fluorescence+human+endometriosis.">Improved nude mouse models for green fluorescence human endometriosis.</a> Journal of Obstetrics and Gynaecology Research. 36 (6), 1214-1221 (2010).</li><li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+red+fluorescent+nude+mouse+model+of+human+endometriosis:+advantages+of+a+non-invasive+imaging+method.">A red fluorescent nude mouse model of human endometriosis: advantages of a non-invasive imaging method.</a> European Journal of Obstetric Gynecologic and Reproductive Biology. 176, 25-30 (2014).</li></ol>

Protokollen, detaljert beskriver gjennomføringen av en dyr modell av endometriose der arkitektur implanting lesjoner arkitektur er bevart mens samtidig gir sanntid vurdering av fluorescens slippes ut av mCherry merket endometrial vev. I denne protokollen beskriver vi bruk av en bestemt i vivo tenkelig system og tilhørende programvare til ikke-invasively vurdere fluorescens slippes ut av merket lesjonen. Hver bruker bør tilpasse protokollen avhengig av spesifikke bildeenheten og tilhørende programvare tilgjengelig ved...

Endometriosis er en kronisk gynecologic lidelse initiert av implantering av funksjonelle endometrium utenfor livmor hulrom. Ektopisk lesjoner vokse og indusere inflammatoriske prosesser fører til kroniske bekken smerte og ufruktbarhet1. Det er anslått at opp til 10-15% av kvinner i reproduktiv alder påvirkes av endometriosis2, og det finnes i ca 40-50% i infertile kvinner3. Gjeldende farmakologiske behandlinger for endometriosis er stand til å fullstendig utrydde lesjoner og ikke uten bivirkninger4,5. Forskningen mer effektiv terapi krever av avgrensningen av eksisterende dyr modeller av endometriose slik at menneskelige lesjoner kan bli riktig etterlignet, og effekten av forbindelser på lesjon størrelse blant andre kan vurderes nøye.
Primas modeller har blitt brukt til å etterligne endometriose implanting ektopisk lesjoner histologisk identiske og på lignende nettsteder som mennesker6,7,8; imidlertid knyttet visse etiske spørsmål og de høye økonomiske kostnadene til eksperimentering med primater grense deres bruk9. Derfor fortsetter bruk av liten dyrene, særlig gnagere, for gjennomføringen av-vivo modeller av endometriose å bli favorisert som det tillater studier med større antall individer10,11. Endometriosis kan bli indusert i disse dyrene ved transplanting enten stykker av gnager livmor horn ("homologe modeller")12,13 eller menneskelig endometrial/endometriotic vev ektopisk områder (heterologous modeller)14 . I motsetning til mennesker, gnagere kaste ikke endometrial vev og dermed endometriosis kan ikke bli utviklet spontant i disse artene. Homologe musen modeller av endometriose har blitt kritisert skyldes at implantert ektopisk musen livmor vev gjenspeiler derfor ikke egenskapene til menneskelig endometriotic lesjoner15.
Aktuelle fysiologi av endometriose kan bli etterlignet heterologous modeller av endometriose hvor frisk menneskelige endometrial fragmenter er implantert inn immunodeficient dyr. I konvensjonell heterologous modeller, er terapeutiske effekter av forbindelser av interesse vanligvis vurdert på endepunktet av vurdering av lesjon størrelse med bruk av calipers16. En tydelig begrensning er at slik endepunktet dyremodeller ikke tillater studere implantasjon dynamics eller endometriotic lesjon utvikling over tid. En ekstra begrensning er at bruk av calipers ikke tillater nøyaktige målinger av lesjon størrelse. Standardfeilen fra calipers er faktisk i samme område (dvs. millimeter) som størrelsen på lesjoner implantert i mus, dermed begrense kapasitet av disse verktøyene til å oppdage faktiske variasjoner i størrelse.
For å overvinne slike begrensninger, her, beskrive vi generering av en heterologous musemodell av endometriose der implantert menneskelig vev er konstruert for å uttrykke en reporter m-Cherry fluorescerende protein. Påvisning av fluorescerende signalet med aktuelle bildet system kan ikke-invasiv overvåking av lesjon status med samtidige kvantifisering av sin størrelse i sanntid. Dermed gir vår modell klare fordeler i forhold til konvensjonelle endepunktet modeller som det gir mulighet for sanntids ikke-invasiv overvåking og muligheten til å utføre mer objektive og nøyaktig vurdering av variasjoner i lesjon størrelse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Her beskriver vi en protokoll for gjennomføringen av en heterologous musemodell der progresjon av endometriose kan vurderes i sanntid via noninvasive overvåking av fluorescens fra implantert ektopisk menneskelig endometrial vev. For dette formålet hentes biopsies av menneskelig endometrium fra kvinner pågående oocyte sponsorbidraget. Menneskelige endometrial fragmenter er kultivert i nærvær av adenoviruses konstruert å uttrykke cDNA for reporter fluorescerende protein mCherry. På visualisering, merket vev med en optimal hastighet på fluorescens etter infeksjon er valgt for implantering i mottakerens mus. En uke før implantasjon kirurgi, mottaker mus er oophorectomized, og østradiol pellets plasseres subcutaneously for å opprettholde den overlevelse og vekst av lesjoner. På dagen for kirurgi er mus bedøvet og peritoneal hulrom tilgang via en liten (1,5 cm) snitt ved linea-alba. Fluorescently merket implantater er tweezed, kort dyppet i lim og knyttet til peritoneal laget. Incisions er sutured, og dyr igjen for å gjenopprette for et par dager. Fluorescens fra endometriotic implantater er vanligvis ikke-invasively kontrollert hver 3 dager for 4 uker med i vivo tenkelig system. Variasjoner i størrelsen av endometriotic implantater kan estimeres i sanntid ved kvantifisering av mCherry signalet og normalisering mot det første tidspunktet viser maksimal fluorescens intensitet.
Tradisjonelle prekliniske gnagere modeller av endometriose tillater ikke ikke-invasiv overvåking av leksjonen i sanntid, men heller tillate evaluering av effekten av legemidler assayed på sluttpunktet. Dette gjør det mulig å spore lesjoner i sanntid og er mer nyttig å utforske terapeutiske potensialet av narkotika i preklinisk modeller av endometriose. Den viktigste begrensningen av modellen dermed genereres er at ikke-invasiv overvåking ikke er mulig over lengre tid på grunn av episomal uttrykk for Ad-virus.

Her beskriver vi prosessen for å skape en heterologous modell av endometriose der arkitekturen av lesjoner er bevart av implanting fluorescently merket stykker av menneskelig endometrium i immunsupprimerte mus, slik at ikke-invasiv overvåking av lesjon progresjon. Merking av endometrial oppnås av infeksjon med adenovirus utviklet å uttrykke mCherry, et protein emitting fluorescens i nær infrarøde regionen. I figur 1viser vi representant bilder av mennes...

Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Her presenterer vi en protokoll for live bildebehandling av fluorescently merket menneskelige endometrial fragmenter podet i mus. Den tillater studere virkningene av valget på endometriotic lesjon størrelse gjennom overvåking og måling av fluorescens fra fluorescerende reporteren i sanntid

Noninvasiv overvåking av lesjonen størrelse i en Heterologous musemodell av endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i evalueringen av terapeutiske legemiddeleffekter i endometriosefeltet, som effekten av anti-androgene forbindelser på størrelsen av endometriotiske lesjoner. Den største fordelen med denne teknikken er at effekten av de spesifikke stoffene kan vurderes i dyremodeller av endometriose i sanntid, i stedet for på endepunktet. Demonstrere prosedyren vil være Jessica Martinez, som er en tekniker fra laboratoriet mitt, samt Viviana Bisbal og Nerea Marin, som er veterinærer fra Centro de Investigacion Principe Felipe og som er nære samarbeidspartnere med vårt team.To til tre dager før implantatoperasjonen, overføre skyllet, sunn endometrievev biopsi fragmenter i en 10 centimeter Petri skål som inneholder komplett medium, og bruke skalpeller for å hakke vevet i fem til 10 millimeter cubed stykker. Bruk en mikropipette til å legge til 30 til 50 mikroliter dråper DMEM over bunnen av en ny 10 centimeter kulturrett, slik at nok plass mellom hver dråpe slik at de ikke kommer i kontakt med hverandre. Når alle dråpene er plassert, bruk en sprøytenål til å plassere et enkelt stykke biopsivevfragment i hver dråpe.Deretter legger du til 100 til 200 mikroliter nylaget adeno-mCherry til en brønn av en 96 brønnplate per vevfragment, pluss tre brønner med adenovirusfri DMEM som en negativ kontroll. Bruk deretter nålen til å overføre en vevsprøve til hver brønn av adeno-mCherry-løsning for en inkubasjon over natten ved 37 grader celsius og 5%CO2. Neste morgen plasserer du platen på et fluorescensmikroskop stadium og bruke en 568 nanometer laser for å sjekke fragmentene for en optimal merking.Bruk av riktig fortynning av infiserende mCherry adenovirus er nøkkelen for en effektiv merking av vevet. Så for å bestemme riktig konsentrasjon, må flere for mCherry fortynning, for hvert enkelt eksperiment, evalueres. Deretter overfører du de mest briljante fragmentene til individuelle brønner av en ny 96-brønnplate som inneholder friskt, komplett medium.Minst syv dager etter ooforektomi dekanterer endometrievevet i en petriskål, og bekrefter mangel på respons på tåklemme i et bedøvet, ooforektomiisert dyr. Med musen i liggende stilling desinfiserer ventralområdet og gjør et 1, 5 centimeter langsgående snitt i magen. Skill huden fra muskelen og gjør et andre 1,5 centimeter snitt i muskelen for å få tilgang til bukhulen.Holder venstre kant av abdominal muskelveggen med mini-tang, brett muskelen for å avsløre det indre ansiktet av bukhinnen på utsiden av dyret. Bruk mini-pinsett til kort suge en endometrial implantat i n-butyl ester cyanoacrylate lim og feste fragmentet til bukhinnen. Når limet er tørket, legg et nytt implantat på den kontralaterale siden av bukhinnen som nettopp demonstrert.Bruk en absorberbar 6-0 sutur for å lukke muskellaget og en ikke-absorberbar 6-0 sutur for å lukke huden. Rengjør deretter hud snittet med antiseptisk løsning og plasser dyret i gjenopprettingssonen med overvåking til full recumbency. For in-vivo fluorescerende avbildning av de implanterte vevfragmentene, 24 til 48 timer etter implantasjonsoperasjonen slå på in-vivo bildesystemet, initialisere programvaren, og la CCD kameraet avkjøles i noen minutter.Når instrumentet er klart, plasser den første bedøvede musen i in-vivo bildesystemburet, i liggende stilling, med hodet inne i en tubule koblet til anestesimaskinen, og lukk lokket. Klikk deretter på Hent og lagre de fem resulterende bildene. For å kvantifisere in-vivo fluorescens, i riktig bildeanalyse programvare klikk bla gjennom og velg den ubyblede filen av interesse som skal analyseres.Et nytt vindu vises. Klikk legg til i listen for å inkludere alle de ublandte filene fra hvert dyr på forskjellige tidspunkter, og klikk last inn som en gruppe. Alle bildene skal vises i én enkelt rekkefølge.I vinduet for verktøypalett fjerner du merket for den enkelte skalaen for å justere alle bildene til samme skala, og dobbeltklikker på ett bilde av sekvensen. Hvis du vil opprette et interesseområde, velger du konturen og automatisk ett alternativ i området, og klikker på sirkelformen for å plassere sirkelen midt i det fluorescerende signalet. Klikk opprett for å opprette interesseområdet og kopiere og lime inn interesseområdet på en bakgrunn der det ikke er noe signal.Klikk deretter mål områder av interesse og velg alle for å vise verdier for fluorescensintensiteten for hvert område og kopiere og lime inn disse verdiene i et regneark. Merkingen av endometriefragmentene oppnås ved infeksjon med adenovirus konstruert for å uttrykke mCherry, et protein som avgir fluorescens i den nærinrøde delen som er betydelig mer robust enn det ikke-infiserte endometrievevet autofluorescens. Under overvåking, i tillegg til referansebølgelengden for mCherry, tas fluorescerende bilder med forskjellige par eksitasjonsbølgelengdefiltre.For å definere de karakteristiske fluorescerende vevsutslippsprofilene til lesjonene fra bakgrunnen, og autofluorescens som slippes ut av vertsvevet, blir overvåkingsbildene som inneholder rå fluorescens som slippes ut av dyrene i hvert tidspunkt, usnormalisert, i en enkelt fil. Deretter er fluorescensen ubmikset, normalisert og representert som et falskt fargebilde, og områdene av interesser som svarer til bestemte legion- og bakgrunnssignaler, gjenkjennes automatisk av programmet og kvantifiseres. Bakgrunnsregionen av interessesignalering trekkes fra legionregionen av interessesignalering.Og resultatene av intensiteten på hvert tidspunkt normaliseres mot tidspunktet hvor intensiteten er maksimal. Etter flere uker med overvåking, levedyktige implantater kan gjenopprettes for videre nedstrøms analyse. Mens du prøver denne prosedyren er det viktig å huske å velge konsentrasjonen av Ad-mCherry som gir det mest strålende signalet uten å gå på akkord med levedyktigheten til vevet.Etter denne prosedyren kan lesjonene gjenopprettes og brukes til å studere flere karakteristiske parametere. Denne prosedyren er optimalisert for ikke-invasiv overvåking av xenograft humane endometrioselesjoner. Det kan imidlertid lett tilpasses for å vurdere effekten av et bestemt stoff av interesse på nettstedene til en xenograft i sanntid.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Langsiktig Dødelig toksisitet Test med krepsdyret Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Validering av en musemodell for å forstyrre LINC Komplekser i en celle-spesifikk Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Trans-indre cellen masse injeksjon av embryonale stamceller fører til høyere Chimerism priser

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

En musemodell av Intestinal delvis hindringer

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Visualisering av replisome møter med et antigen merket blokkerende lesjon

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

En musemodell av lumbal rygg ustabilitet

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Overvåking av dynamisk vekst av retinale kar i oksygenindusert retinopati musemodell

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...