Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Ministério da economia e competitividade através do Miguel Servet programa [CP13/00077] co-fundou pelo FEDER (Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional) e premiado para Dr R. Gómez, bem como por Carlos III Instituto de saúde subvenções concedidas Dr R Gómez [00547/PI14 e PI17/02329] e Prof A. Cano [PI12/02582].

O uso de amostras de tecido humano foi aprovado pelo Comitê de ética do Hospital Universitario La Fe e Conselho de revisão institucional. Todos os pacientes fornecidos escrito consentimento informado. O estudo envolvendo animais foi aprovado pelo Comitê de cuidados institucionais Animal no Centro de Investigacion Principe Felipe de Valencia, e todos os procedimentos foram realizados seguindo as orientações para o cuidado e o uso de mamíferos de institutos nacionais de de saúde.
1. pré-p...

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O protocolo detalhado neste documento descreve a implementação de um modelo animal de endometriose, em que a arquitetura de implantação de arquitetura de lesões é preservada enquanto simultaneamente, permitir avaliação em tempo real da fluorescência emitida pelo mCherry rotulado de tecido endometrial. Neste protocolo, descrevemos a utilização de um sistema de imagens in vivo específico e software relacionado de forma não-invasiva avaliar fluorescência emitida pela lesão rotulada. Cada usuário deve adaptar...

Endometriose é uma doença ginecológica crônica iniciada pela implantação do endométrio funcional fora da cavidade uterina. Gravidez ectópica lesões crescem e induzem processos inflamatórios, levando a crônica pélvica dor e infertilidade1. Estima-se que acima de 10 a 15% das mulheres em idade reprodutiva são afetadas por endometriosis2, e está presente em aproximadamente 40-50% das mulheres inférteis3. Os tratamentos farmacológicos atuais para endometriose são incapazes de erradicar completamente as lesões e não é livre de efeitos colaterais4,5. A pesquisa das terapias mais eficientes requer de refinamento de modelos animais existentes da endometriose, de tal forma que lesões humanas podem ser imitadas adequadamente, e os efeitos dos compostos no tamanho da lesão entre outros podem ser avaliados de perto.
Modelos de primatas têm sido utilizados para imitar a endometriose por responsável ectópica lesões histologicamente idênticas e em sites semelhantes como seres humanos6,7,8; no entanto, as preocupações éticas e os elevados custos económicos relacionam à experimentação com primatas limite seu uso9. Consequentemente, a utilização de pequenos animais, especialmente roedores, para a implementação de modelos in vivo de endometriose continua a ser favorecida, pois permite estudos com maior número de indivíduos de10,11. Endometriose pode ser induzida nestes animais transplantando ou pedaços de roedores cornos uterinos ("modelos homólogos")12,13 ou tecido endometrial/endometriotic humano para sites de gravidez ectópica (modelos heterólogos)14 . Em contraste com os humanos, roedores não derramem seu tecido endometrial e, assim, endometriose não pode ser desenvolvida espontaneamente nestas espécies. Portanto, homólogo rato modelos da endometriose tem sido criticados, devido ao fato de que implantou o tecido uterino de gravidez ectópica do mouse não reflete as características de lesões endometriotic humana15.
Fisiologia adequada da endometriose pode ser imitada nos modelos heterólogos de endometriose, onde fragmentos de endométrio humanos frescos são implantados em animais imunodeficientes. Em modelos convencionais heterólogos, os efeitos terapêuticos de compostos de interesse são comumente avaliados no ponto final pela avaliação do tamanho da lesão com o uso de compassos de calibre16. Uma limitação óbvia é que, como tal, modelos animais de ponto de extremidade não permitem estudar a dinâmica de implantação ou desenvolvimento de lesão endometriotic ao longo do tempo. Uma limitação adicional é que o uso de compassos de calibre não permite medições precisas de tamanho da lesão. Na verdade, o erro-padrão fornecido por pinças é na mesma faixa (ou seja, milímetros) como o tamanho das lesões implantado em ratos, restringindo assim a capacidade dessas ferramentas para detectar variações reais em tamanho.
Neste documento, a fim de superar tais limitações, descrevemos a geração de um modelo de mouse heteróloga da endometriose, em que é engenharia de tecidos humanos implantado para expressar uma proteína fluorescente m-cereja de repórter. Deteção do sinal fluorescente com um sistema de imagem apropriado permite monitoramento invasivo do status de lesão com quantificação simultânea de seu tamanho em tempo real. Assim, nosso modelo fornece vantagens evidentes quando comparado aos modelos convencionais de ponto de extremidade, pois traz a oportunidade de monitoramento não-invasivo em tempo real e a possibilidade de realizar mais objectivo e estimativa exacta das variações no tamanho da lesão.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Aqui, descrevemos um protocolo para a implementação de um modelo de mouse heteróloga em que a progressão da endometriose pode ser avaliada em tempo real através de monitorização não-invasiva da fluorescência emitida pelo implante ectópico humano tecido endometrial. Para essa finalidade, biópsias do endométrio humano são obtidas a partir de doação de oócito em curso de mulheres de doador. Fragmentos de endométrio humanos são cultivados na presença de adenovírus projetados para cDNA expresso para o repórter mCherry de proteína fluorescente. Após a visualização, rotulado tecidos com uma taxa ideal de fluorescência após infecção posteriormente são escolhidos para a implantação em ratos do destinatários. Uma semana antes da cirurgia de implante, destinatários ratos são oophorectomized, e pelotas de estradiol são colocadas por via subcutânea para sustentar a sobrevivência e o crescimento das lesões. No dia da cirurgia, os ratos são cavidade peritoneal e anestesiada, acessada através de uma incisão de pequeno (1,5 cm) pelo linea-alba. Implantes fluorescente etiquetados são depilar, brevemente embebidos em cola e anexados à camada peritoneal. As incisões são suturadas e animais deixaram de recuperar por um par de dias. Fluorescência emitida por implantes endometriotic geralmente não invasiva é monitorada a cada 3 dias por 4 semanas com um sistema de imagens in vivo. Variações no tamanho dos implantes endometriotic podem ser estimadas em tempo real pela quantificação do sinal de mCherry e normalização contra o tempo-ponto inicial mostrando a intensidade da fluorescência máxima.
Roedores pré-clínicos tradicionais de modelos de endometriose não permitem monitoramento invasivo da lesão em tempo real, mas bastante permitam a avaliação dos efeitos das drogas na analisada no ponto final. Este protocolo permite rastrear lesões em tempo real e é mais útil para explorar o potencial terapêutico de drogas em modelos pré-clínicos de endometriose. A principal limitação do modelo gerado, portanto, é que o monitoramento não-invasivo não é possível durante longos períodos de tempo devido a expressão epissomal Ad-vírus.

Aqui, descrevemos o processo para criar um modelo heterólogo da endometriose, em que a arquitetura das lesões é preservada pela implantação fluorescente etiquetados pedaços de endométrio humano em ratos imunodeprimidos, permitindo que não-invasiva monitoramento da progressão da lesão. Rotulagem de fragmentos endometriais é alcançado por infecção com adenovírus projetado para mCherry express, uma proteína que emitem fluorescência na região do infravermelho próxima. Na <s...

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Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo de fluorescente etiquetadas fragmentos endometriais humanas transplantada em ratos. O método permite estudar os efeitos das drogas de escolha no tamanho da lesão endometriotic através do acompanhamento e quantificação da fluorescência emitida pelo repórter fluorescente em tempo real

Monitorização não invasiva do tamanho da lesão em um modelo de Mouse heteróloga de endometriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na avaliação dos efeitos de drogas terapêuticas no campo da endometriose, como os efeitos de compostos anti-androgênicos no tamanho das lesões endometriotes. A principal vantagem dessa técnica é que os efeitos das drogas específicas podem ser avaliados em modelos animais de endometriose em tempo real, e não no ponto final. O procedimento será Jessica Martinez, que é técnica do meu laboratório, assim como Viviana Bisbal e Nerea Marin, que são veterinárias do Centro de Investigação Principe Felipe e que são colaboradores próximas com nossa equipe.Dois a três dias antes da cirurgia de implante, transfira fragmentos de biópsia de tecido endometrial saudável e lavados em uma placa de Petri de 10 centímetros contendo meio completo, e use bisturis para picar o tecido em pedaços de cinco a dez milímetros. Usando uma micropipette, adicione 30 a 50 gotas de microliter de DMEM na parte inferior de um novo prato de cultura de 10 centímetros, deixando espaço suficiente entre cada gota para que eles não entrem em contato uns com os outros. Quando todas as gotas tiverem sido colocadas, use uma agulha de seringa para colocar um único pedaço de tecido de biópsia em cada gota.Em seguida, adicione 100 a 200 microliters de adeno-mCherry recém-preparado a um poço de uma placa de 96 poços por fragmento de tecido, além de três poços com DMEM livre de adenovírus como um controle negativo. Em seguida, use a agulha para transferir uma amostra de tecido em cada poço de solução adeno-mCherry para uma incubação durante a noite a 37 graus celsius e 5%DE CO2. Na manhã seguinte coloque a placa em um estágio de microscópio de fluorescência e use um laser de 568 nanômetros para verificar os fragmentos para uma rotulagem ideal.Usar a diluição apropriada de infectar mCherry adenovírus é fundamental para uma rotulagem eficiente do tecido. Assim, para determinar a concentração adequada, vários para diluição mCherry, para cada experimento individual, devem ser avaliados. Em seguida, transfira os fragmentos mais brilhantes para poços individuais de uma nova placa de 96 poços contendo meio fresco e completo.Pelo menos sete dias após a oofrectomia, decante os fragmentos de tecido endometrial em uma placa de Petri, e confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo em um animal anestesiado e oofrectomizado. Com o rato na posição supina desinfetar a área ventral e fazer uma incisão longitudinal de 1,5 centímetros no abdômen. Separe a pele do músculo e faça uma segunda incisão de 1,5 centímetros no músculo para acessar a cavidade peritoneal.Segurando a borda esquerda da parede muscular abdominal com mini-fórceps, dobre o músculo para expor a face interna do peritônio na parte externa do animal. Use mini pinças para absorver brevemente um implante endometrial no adesivo de cianoacrilato de n-butil e anexar o fragmento ao peritônio. Quando o adesivo estiver seco, coloque um segundo implante no lado contralateral do peritônio como apenas demonstrado.Use uma sutura 6-0 absorvível para fechar a camada muscular e uma sutura 6-0 não absorvível para fechar a pele. Em seguida, limpe a incisão da pele com solução antisséptica e coloque o animal na zona de recuperação com monitoramento até a recumbência total. Para imagens fluorescentes in vivo dos fragmentos de tecido implantado, 24 a 48 horas após a cirurgia de implantação ligar o sistema de imagem in vivo, inicializar o software e permitir que a câmera CCD esfrie por alguns minutos.Uma vez que o instrumento esteja pronto, coloque o primeiro rato anestesiado na gaiola do sistema de imagem in vivo, na posição supina, com a cabeça dentro de um túbulo conectado à máquina de anestesia, e feche a tampa. Em seguida, clique em adquirir e salvar as cinco imagens resultantes. Para quantificar a fluorescência in vivo, no software de análise de imagem apropriado clique em procurar e selecione o arquivo de interesse não misturado a ser analisado.Uma nova janela aparecerá. Clique em adicionar à lista para incluir todos os arquivos não misturados de cada animal em diferentes pontos de tempo e clique em carregar como um grupo. Todas as imagens devem aparecer em uma única sequência.Na janela da paleta de ferramentas, desmarque a caixa de seleção de escala individual para ajustar todas as imagens à mesma escala e clique duas vezes em uma imagem da sequência. Para criar uma região de interesse, na região de ferramentas de interesse selecione as opções contorno e auto um, e clique na forma de círculo para colocar o círculo no centro do sinal fluorescente. Clique em criar para criar a região de interesse e copiar e colar a região de interesse em um fundo onde não há sinal.Em seguida, clique em medir regiões de interesse e selecione todas para exibir valores para a intensidade de fluorescência de cada região e copie e cole esses valores em uma planilha. A rotulagem dos fragmentos endometrial é obtida pela infecção com adenovírus projetado para expressar mCherry, uma proteína que emite fluorescência na seção quase infravermelha que é significativamente mais robusta do que a autofluorescência do tecido endometrial não infectado. Durante o monitoramento, além do comprimento de onda de referência para mCherry, imagens fluorescentes são tiradas com diferentes pares de filtros de comprimento de onda de emissão de excitação.Para definir os perfis característicos de emissão de tecido fluorescente das lesões a partir do fundo, e a autofluorescência emitida pelos tecidos hospedeiros, as imagens de monitoramento contendo fluorescência bruta emitida pelos animais durante cada ponto de tempo são reunidas, nãonormalizadas, em um único arquivo. Em seguida, a fluorescência é não misturada, normalizada e representada como uma falsa imagem colorida, e as regiões de interesses correspondentes a legiões específicas e sinais de fundo são automaticamente reconhecidas pelo programa e quantificadas. A região de fundo de sinalização de interesse é subtraída da região legião de sinais de interesse.E os resultados da intensidade em cada ponto de tempo são normalizados em relação ao ponto de tempo em que a intensidade é máxima. Após várias semanas de monitoramento, os implantes viáveis podem ser recuperados para análises mais a jusante. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de selecionar a concentração de Ad-mCherry que fornece o sinal mais brilhante sem comprometer a viabilidade do tecido.Após este procedimento, as lesões podem ser recuperadas e utilizadas para estudar parâmetros distintos adicionais. Este procedimento é otimizado para o monitoramento não invasivo de lesões de endometriose humana de xenoenxerto. No entanto, pode ser facilmente adaptado para avaliar os efeitos de uma droga específica de interesse nos sites de um xenoenxerto em tempo real.

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Visualization of Replisome Encounters with an Antigen Tagged Blocking Lesion

Visualização de Encontros de Replisome com uma Lesão de Bloqueio com Antígeno Marcado

Considerable insight is present into the cellular response to double strand breaks (DSBs), induced by nucleases, radiation, and other DNA breakers. In ...

A Mouse Model of Lumbar Spine Instability

Um modelo de mouse de instabilidade lombar

Intervertebral disc degeneration (IDD) is a common pathological change leading to low back pain. Appropriate animal models are desired for understanding ...

Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Monitoramento do crescimento dinâmico dos vasos retinais no modelo de rato de retinopatia induzido pelo oxigênio

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...