Name: noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis
Uploaded: 2019-02-26T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de economía y competitividad a través del programa de Servet Miguel [CP13/00077] cofundado por el FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional) y concedió a Dr R. Gómez, así como por el Instituto de Salud Carlos III subvenciones concedidas Dr R Gómez [PI14/00547 PI17/02329] y Prof A. Cano [PI12/02582].

El uso de muestras de tejido humano fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética del Hospital Universitario La Fe. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito. El estudio con animales fue aprobado por el Comité institucional de cuidado de animales en el Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia, y todos los procedimientos fueron realizados siguiendo los lineamientos para el cuidado y uso de los mamíferos de los institutos nacionales de de la salud....

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	<li>Nap, A. W., Groothuis, P. G., Demir, A. Y., Evers, J. L., Dunselman, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+endometriosis.">Pathogenesis of endometriosis.</a> Best Practice &amp; Research: Clinical Obstetrics &amp; Gynaecology. 18, 233-244 (2004).</li><li>Holoch, K. J., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometriosis+and+infertility.">Endometriosis and infertility.</a> Clinical Obstetrics and Gynecology. 53, 429-438 (2010).</li><li>Eskenazi, B., Warner, M. 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El protocolo detallado en el presente documento describe la aplicación de un modelo animal de endometriosis en la cual la arquitectura de implantación de arquitectura de lesiones se conserva mientras que simultaneamente permite evaluación en tiempo real de la fluorescencia emitida por mCherry etiquetado el tejido endometrial. En este protocolo, describimos el uso de un sistema específico de proyección de imagen en vivo y programas relacionados con evaluación no invasiva fluorescencia emitida por la lesión marcada....

La endometriosis es un trastorno ginecológico crónico por la implantación del endometrio funcional fuera de la cavidad uterina. Lesiones ectópicas crecen y provocar procesos inflamatorios conduce a crónico pélvico dolor e infertilidad1. Se estima que hasta a 10 – 15% de las mujeres en edad reproductiva sufren de endometriosis2, y está presente en aproximadamente el 40-50% de las mujeres estériles3. Los tratamientos farmacológicos para la endometriosis son incapaces de erradicar completamente las lesiones y no están libres de efectos secundarios4,5. La investigación de terapias más eficientes requiere del refinamiento de los modelos existentes de animal de endometriosis de tal manera que las lesiones humanas pueden mímico apropiadamente y evaluar de cerca los efectos de compuestos en el tamaño de la lesión entre otros.
Modelos de primates se han utilizado para imitar la endometriosis implantación ectópicas lesiones histológicamente idénticas y en sitios similares como en los seres humanos6,7,8; sin embargo, preocupaciones éticas y los altos costos económicos relacionados con la experimentación con primates límite su uso9. En consecuencia, el uso de pequeños animales, especialmente roedores, para la implementación de modelos in vivo de la endometriosis sigue ser favorecido ya que estudios con un mayor número de individuos10,11. La endometriosis puede ser inducida en estos animales mediante el trasplante de pedazos de cuernos uterinos roedores "(modelos de homólogos")12,13 o tejido endometrial/endometriotic humano a sitios ectópicos (modelos heterólogos)14 . A diferencia de los seres humanos, roedores no arrojar su tejido endometrial y así endometriosis puede no desarrollarse espontáneamente en estas especies. Por lo tanto, ratón homólogo modelos de la endometriosis han sido criticados debido a que implanta tejido uterino ratón ectópico no refleja las características de las lesiones endometriotic humana15.
Fisiología adecuado de la endometriosis se puede mímico en los modelos heterólogos de la endometriosis donde fragmentos de endometrio humanos frescos implantados en animales inmunodeficientes. En modelos convencionales heterólogos, los efectos terapéuticos de compuestos de interés se evalúan comúnmente en el punto final de la evaluación del tamaño de la lesión con el uso de pinzas16. Una limitación obvia es que, como tal, modelos animales extremo no permiten estudiar la dinámica de implantación o desarrollo de la lesión endometriotic con el tiempo. Una limitación adicional es que el uso de calibradores no permite mediciones precisas del tamaño de la lesión. De hecho, el error estándar proporcionado por pinzas es en el mismo rango (es decir, milímetros) como el tamaño de las lesiones en ratones, así limitar la capacidad de estas herramientas para detectar las variaciones reales en el tamaño.
Para superar tales limitaciones, adjunto, describimos a la generación de un modelo de ratón heterólogos de la endometriosis en la cual implantado tejido humano está diseñado para expresar una proteína fluorescente reportera m-Cherry. Detección de la señal fluorescente con un sistema apropiado de la imagen permite la monitorización no invasiva del estado de la lesión con cuantificación simultánea de su tamaño en tiempo real. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece claras ventajas en comparación con los modelos convencionales de punto final que trae la oportunidad de en tiempo real monitoreo no invasivo y la posibilidad de hacer más objetiva y exacta estimación de las variaciones en el tamaño de la lesión.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Endosampler&#8482;</td>
			<td>Medgyn</td>
			<td>22720</td>
			<td>Cannula for sampling the uterine endometrium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM Medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HYCLSH30285.FS</td>
			<td>Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ad-mCherry</td>
			<td>Vector Biolabs</td>
			<td>1767</td>
			<td>Adenoviral vector expressing mCherry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, 1X solution, sterile, pH 7,4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E504-500ML</td>
			<td>Buffer for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/ 60 days</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>SE-121</td>
			<td>Hormone pellets for rodents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vetbond&#8482; Tissue Adhesive</td>
			<td>3M</td>
			<td>780-680</td>
			<td>Tissue adhesive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes in polystyrene crystal</td>
			<td>Levantina</td>
			<td>367-P101VR20</td>
			<td>Petri dishes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomicin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>Antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, medical 10 ml 0,5 ml</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CODA626616</td>
			<td>Syringes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves, powder-free</td>
			<td>VWR</td>
			<td>112-2754</td>
			<td>Gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soft swiss nude mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>SNUSSFE05S</td>
			<td>Mice for animal experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ivis Spectrum In vivo Imaging system</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>In vivo Monitoring equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image&#174; (Ivis software)</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>---</td>
			<td>In vivo monitoring software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Enrichment serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well cell culture treated plates</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>167008</td>
			<td>Culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urine flasks</td>
			<td>Summedical</td>
			<td>4004-248-001</td>
			<td>Flasks for washes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical blades</td>
			<td>(Aesculap Division) Sanycare</td>
			<td>1609022-0008</td>
			<td>Surgical blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isovet 1000 mg/g</td>
			<td>B-BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Isoflurane (Anesthetic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprex&#174; 0.3 mg</td>
			<td>Schering Plough S.A.</td>
			<td>---</td>
			<td>Buprenorphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injectable morphine solution 10 mg/mL</td>
			<td>B BRAUN</td>
			<td>---</td>
			<td>Morphine (Analgesic solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monofyl&#174; Absorbable Sutures</td>
			<td>COVIDIEN</td>
			<td>---</td>
			<td>Sutures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinclor chlorhexidine</td>
			<td>Promedic SA</td>
			<td>---</td>
			<td>Antiseptic solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopy DMi8</td>
			<td>Leica Mycrosystems</td>
			<td>---</td>
			<td>fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hera Cell 150 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026282</td>
			<td>Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

noninvasive monitoring of lesion size in a heterologous mouse model of endometriosis

Aquí, describimos un protocolo para la implementación de un modelo de ratón heteróloga en la que la progresión de la endometriosis puede evaluarse en tiempo real a través de monitoreo no invasivo de la fluorescencia emitida por tejido endometrial humano ectópico implantado. Para ello, se obtienen biopsias de endometrio humano de donación de ovocitos curso de mujeres donantes. Fragmentos de endometrio humanos son cultivadas en presencia de adenovirus diseñados para expresar cDNA para el reportero proteína fluorescente mCherry. Sobre visualización, etiquetados como los tejidos con una tasa óptima de fluorescencia después de infección son posteriormente seleccionados para la implantación en ratones receptores. Una semana antes de la cirugía de implantación, ratones receptores son ooforectomizadas, y pastillas de estradiol se colocan subcutáneamente para mantener la supervivencia y el crecimiento de las lesiones. En el día de la cirugía los ratones son anestesia y peritoneal cavidad accedida a través de una incisión pequeña (1,5 cm) por la linea-alba. Fluorescencia de etiquetado implantes son tweezed, brevemente empapados en pegamento y Unidos a la capa peritoneal. Incisiones se suturan, y animales a la izquierda para recuperar un par de días. Fluorescencia emitida por implantes endometriotic generalmente no invasiva se controla cada 3 días durante 4 semanas con un sistema de proyección de imagen in vivo. Variaciones en el tamaño de los implantes endometriósicos se pueden estimar en tiempo real por la cuantificación de la señal mCherry y normalización contra el momento inicial que muestra la intensidad de la fluorescencia máxima.
Tradicionales roedores preclínicas de los modelos de la endometriosis no permiten monitoreo no invasivo de la lesión en tiempo real pero que permiten la evaluación de los efectos de las drogas analizadas en el punto final. Este protocolo permite un seguimiento de las lesiones en tiempo real y es más útil para explorar el potencial terapéutico de los fármacos en modelos preclínicos de la endometriosis. La principal limitación del modelo así generado es que el monitoreo no invasivo no es posible durante largos períodos de tiempo debido a la expresión episomal del Ad virus.

Aquí, describimos el proceso para la creación de un modelo heterólogo de la endometriosis en la cual se conserva la arquitectura de las lesiones implantando fluorescencia etiquetadas pedazos de endometrio humano en ratones inmunocomprometidos, permitiendo de este modo no invasivo seguimiento de la progresión de la lesión. Etiquetado fragmentos endometriales se logra por la infección con adenovirus dirigido a expreso mCherry, una proteína que emite fluorescencia en la región infrar...

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Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Aquí, presentamos un protocolo para obtener imágenes en vivo de fluorescencia etiquetadas fragmentos de endometrio humanos injertado en ratones. El método permite estudiar los efectos de los fármacos de elección en el tamaño de la lesión endometriotic a través del monitoreo y cuantificación de la fluorescencia emitida por el reportero fluorescente en tiempo real

Monitoreo no invasivo del tamaño de la lesión en un modelo de ratón heterólogos de la Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la evaluación de efectos de fármacos terapéuticos en el campo de la endometriosis, como los efectos de los compuestos anti-androgénicos en el tamaño de las lesiones endometróticas. La principal ventaja de esta técnica es que los efectos de los fármacos específicos se pueden evaluar en modelos animales de endometriosis en tiempo real, en lugar de en el punto final. Demostrando el procedimiento estarán Jessica Martínez, que es una técnico de mi laboratorio, así como Viviana Bisbal y Nerea Marín, que son veterinarias del Centro de Investigación Príncipe Felipe y que son estrechas colaboradoras con nuestro equipo.Dos a tres días antes de la cirugía del implante, transfiera fragmentos de biopsia de tejido endometrial sano y enjuagado en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga un medio completo, y use bisturíes para picar el tejido en trozos en cubos de cinco a 10 milímetros. Usando una micropipeta, agregue de 30 a 50 microlitro gotas de DMEM en la parte inferior de un nuevo plato de cultivo de 10 centímetros, dejando suficiente espacio entre cada gota para que no entren en contacto entre sí. Cuando se hayan colocado todas las gotas, utilice una aguja de jeringa para colocar una sola pieza de fragmento de tejido de biopsia en cada gota.A continuación, añada de 100 a 200 microlitros de adeno-mCherry recién preparado a un pozo de una placa de 96 pozos por fragmento de tejido, más tres pozos con DMEM libre de adenovirus como control negativo. A continuación, utilice la aguja para transferir una muestra de tejido a cada pocótule de adeno-mCherry para una incubación durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2. A la mañana siguiente coloque la placa en una etapa del microscopio de fluorescencia y utilice un láser de 568 nanómetros para comprobar los fragmentos para un etiquetado óptimo.El uso de la dilución adecuada de adenovirus mCherry infecte es clave para un etiquetado eficiente del tejido. Por lo tanto, para determinar la concentración adecuada, varios para la dilución de mCherry, para cada experimento individual, tienen que ser evaluados. A continuación, transfiera los fragmentos más brillantes a pozos individuales de una nueva placa de 96 pozos que contenga un medio fresco y completo.Al menos siete días después de la ooforectomía, decantar los fragmentos de tejido endometrial en un plato de Petri, y confirmar una falta de respuesta al pellizco del dedo del dedo en un animal anestesiado, ooforectomizado. Con el ratón en posición supina desinfectar el área ventral y hacer una incisión longitudinal de 1,5 centímetros en el abdomen. Separe la piel del músculo y haga una segunda incisión de 1,5 centímetros en el músculo para acceder a la cavidad peritoneal.Sosteniendo el borde izquierdo de la pared muscular abdominal con mini-fórceps, dobla el músculo para exponer la cara interna del peritoneo en el exterior del animal. Utilice mini pinzas para remojar brevemente un implante endometrial en adhesivo de cianoacrilato de éster de n-butilo y unir el fragmento al peritoneo. Cuando el adhesivo se seque, coloque un segundo implante en el lado contralateral del peritoneo como acaba de demostrar.Utilice una sutura absorbible 6-0 para cerrar la capa muscular y una sutura no absorbible 6-0 para cerrar la piel. A continuación, limpie la incisión cutánea con solución antiséptica y coloque el animal en la zona de recuperación con monitorización hasta la recumbencia completa. Para la toma de imágenes fluorescentes in vivo de los fragmentos de tejido implantados, 24 a 48 horas después de la cirugía de implantación encienda el sistema de imágenes en vivo, inicialice el software y permita que la cámara CCD se enfríe durante unos minutos.Una vez que el instrumento esté listo coloque el primer ratón anestesiado en la jaula del sistema de imágenes in-vivo, en la posición supina, con la cabeza dentro de un tubo conectado a la máquina de anestesia, y cierre la tapa. A continuación, haga clic en adquirir y guarde las cinco imágenes resultantes. Para cuantificar la fluorescencia in vivo, en el software de análisis de imágenes adecuado, haga clic en Examinar y seleccione el archivo no comprimido de interés que desea analizar.Aparecerá una nueva ventana. Haga clic en Agregar a la lista para incluir todos los archivos no mezclados de cada animal en diferentes puntos de tiempo y haga clic en cargar como grupo. Todas las imágenes deben aparecer en una sola secuencia.En la ventana de la paleta de herramientas, anule la selección de la casilla de verificación de escala individual para ajustar todas las imágenes a la misma escala y haga doble clic en una imagen de la secuencia. Para crear una región de interés, en la región de interés las herramientas seleccionan el contorno y las opciones automáticas una, y haz clic en la forma del círculo para colocar el círculo en el centro de la señal fluorescente. Haga clic en Crear para crear la región de interés y copiar y pegar la región de interés en un fondo donde no haya señal.A continuación, haga clic en medir regiones de interés y seleccione todas para mostrar los valores de la intensidad de fluorescencia de cada región y copie y pegue estos valores en una hoja de cálculo. El etiquetado de los fragmentos endometriales se logra mediante una infección por adenovirus diseñado para expresar mCherry, una proteína que emite fluorescencia en la sección infrarroja cercana que es significativamente más robusta que la autofluorescencia de tejido endometrial no infectado. Durante la monitorización, además de la longitud de onda de referencia para mCherry, se toman imágenes fluorescentes con diferentes pares de filtros de longitud de onda de emisión de excitación.Para definir los perfiles característicos de emisión de tejido fluorescente de las lesiones del fondo, y la autofluorescencia emitida por los tejidos del huésped, las imágenes de monitorización que contienen fluorescencia cruda emitida por los animales durante cada punto de tiempo se unen, sin normalizar, en un solo archivo. A continuación, la fluorescencia no se mezcla, se normaliza y se representa como una imagen de color falsa, y las regiones de intereses correspondientes a señales de legión y fondo específicas son automáticamente reconocidas por el programa y cuantificadas. La región de fondo de señalización de interés se resta de la región legión de señalización de interés.Y los resultados de la intensidad en cada punto de tiempo se normalizan contra el punto de tiempo en el que la intensidad es máxima. Después de varias semanas de monitoreo, los implantes viables se pueden recuperar para un análisis posterior. Al intentar este procedimiento es importante recordar seleccionar la concentración de Ad-mCherry que proporciona la señal más brillante sin comprometer la viabilidad del tejido.Después de este procedimiento, las lesiones se pueden recuperar y utilizar para estudiar parámetros distintivos adicionales. Este procedimiento está optimizado para la monitorización no invasiva de lesiones de xenointriosis humana. Sin embargo, se puede adaptar fácilmente para evaluar los efectos de un fármaco específico de interés en los sitios de un xenoinjerto en tiempo real.

Research

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Un modelo de ratón de inestabilidad lumbar de la columna vertebral

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Monitoring Dynamic Growth of Retinal Vessels in Oxygen-Induced Retinopathy Mouse Model

Monitoreo del crecimiento dinámico de los vasos retinianos en un modelo de ratón con retinopatía inducida por oxígeno

Oxygen-induced retinopathy (OIR) is widely used to study abnormal vessel growth in ischemic retinal diseases, including retinopathy of prematurity (ROP), ...