Name: a precise and autonomous system for the detection of insect emergence patterns
Uploaded: 2019-01-09T13:30:00
Duration: 6 min 22 s
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Vorremmo ringraziare il gruppo di lavoro insetto Criobiologia ed Ecofisiologia in Fargo, ND per i loro utili commenti su esperimenti utilizzando il sistema descritto.

1. sistema di costruzione
<ol><li>Utilizzando PLA filamento, stampare il seguente numero di parti per ogni canale in costruzione: 1 collettore collettore (collector_manifold.stl), 1 tappo (end_cap.stl), 6 platform supporta (platform_support.stl), placche base 4 tubo rack (base_plate.stl) e 4 tubo cremagliera a piastra (face_plate.stl). Assicurarsi che la stampante letto è abbastanza grande per stampare un elemento prima della stampa. Tutti i file *. STL sono disponibili nei dati supplementari.</li>
	<li>Con 3 supporti di piattaforma e un pezzo di plastica ondulata 33 x 30 cm, è necessario utilizzare colla a caldo per assemblare 2 piattaforme di cremagliera di tubo per canale in costruzione, come mostrato nella Figura 2. La plastica ondulata può essere segnata da un lato ad ogni angolo per consentire per la piegatura.</li>
	<li>Installare elettronica nel collettore del collettore.<ol>
<li>Saldare una resistenza di 120 Ω verso l'anodo (gamba più lunga) di sia l'emettitore a infrarossi e il rilevatore a raggi infrarossi e una lunghezza di circa 5 cm di 22 GA filo per entrambi catodi. Usare colori diversi di fili per evitare confusione nei passaggi successivi.</li>
		<li>Inserire con cautela il rivelatore in una presa del collettore collettore (evidenziate in blu nella Figura 3) e l'emettitore nella seconda presa (evidenziata in rosso). Entrambi i componenti dovrebbero andare bene comodamente.</li>
		<li>Passare i cavi del rivelatore attraverso il canale del cablaggio (evidenziati in giallo nella Figura 3) e tirare tutti i quattro fili attraverso il foro di accesso (evidenziato in verde). Garantire che nessun conduttore nudo stanno toccando, usando colla a caldo per garantire loro di posto.</li>
		<li>Saldare tutti i quattro fili a un RJ45 jack (Ethernet), utilizzando l'ultima fila di pin. Entrambi anodi devono essere saldati il pin più a sinistra, il catodo dell'emettitore al pin più a destra e il catodo del rivelatore a uno dei centro pins (Figura 4).</li>
		<li>Fissare la presa RJ45 sopra il foro di accesso collettore collettore (evidenziato in verde nella Figura 3) con colla a caldo, garantendo che nessun conduttore nudo stanno toccando all'interno del collettore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Costrutto che cade collezionista di palla (1 per canale in costruzione) come mostrato nella Figura 5
	<ol>
<li>Con un collettore collettore via cavo, un coperchio di un'estremità e una sezione di 24 x 30 cm di plastica ondulata, utilizzare colla a caldo per collegare la base dell'unità (rosso, verde e luce grigio componenti della Figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare una sezione di 8 x 27 cm di plastica ondulata per aggiungere una rampa palla caduta al collettore (componente grigio scuro di Figura 5). I disegni a fine cap e collettore collettori includono sporgenze per garantire il corretto posizionamento. Verifica una transizione fluida dalla rampa al collettore per evitare inceppamenti durante l'uso.</li>
	<li>Costruire il processore centrale del sistema (come descritto nella Figura 6).<ol>
<li>Stampare una scheda personalizzata per la costruzione del sistema. Tutti i file necessari per la stampa di PCB board sono disponibili nei dati supplementari.</li>
		<li>Saldare femminile intestazioni il attraverso-fori contrassegnati per le seguenti installazioni: Arduino Nano, temp, orologio, modulo SD e schermo a cristalli liquidi display (LCD) (2 x 5 senza etichetta foro passante zona in alto a sinistra della scheda PCB).</li>
		<li>A scatto e sei prese RJ45 lungo il bordo inferiore del bordo del PWB di saldatura.</li>
		<li>A saldare resistenze di pulldown sei 470K ohm nei luoghi dell'attraverso-foro situati appena sopra le prese RJ45.</li>
		<li>Installare Arduino Nano, DHT-temperatura e sensore di umidità, orologio e modulo SD sul bordo del PWB. Sensore di DHT-temperatura e umidità deve essere testato prima dell'uso in esperimenti per garantire l'accuratezza.</li>
		<li>Collegare un filo di nastro 10-connettore al connettore dello schermo LCD del bordo del PWB. Saldare l'altra estremità del filo della barra multifunzione per lo schermo LCD in modo che i perni di schermo corrispondano ai pin Arduino, come indicato nella Figura 4. Maggiori dettagli sul cablaggio LCD sono disponibili presso https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Programmazione di sistema<ol>
<li>Scaricare e installare l'ultima versione dell'IDE di Arduino per il sistema operativo corretto da www.arduino.cc.</li>
		<li>Al primo utilizzo, è necessario installare le librerie di Arduino per il real time clock (github.com/adafruit/RTClib) e il sensore di temperatura/umidità (github.com/adafruit/DHT-sensor-library). Impostare l'orologio per l'ora locale corrente utilizzando lo script ds1307 incluso con la libreria.</li>
		<li>Caricare il sistema Arduino script, disponibile in dati supplementari.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sistema uso
<ol><li>Assemblare il sistema come illustrato nella Figura 7. Per ogni canale utilizzato, una palla che cade collezionista (assemblato nel passaggio 1.4) dovrebbe essere affiancata su entrambi i lati da una piattaforma di rack (montata al punto 5.1). Utilizzare nastro d'imballaggio per tenere insieme i pezzi e creare un bordo arrotondato liscio sulla piattaforma rack.</li>
	<li>Configurare i canali non utilizzati per evitare falsi segnali positivi. Poiché il sistema si basa su un basso segnale per rilevare un evento (rilevatore a infrarossi non riceve un segnale dall'emettitore a infrarossi), i canali non utilizzati devono essere configurati correttamente per evitare falsi segnali positivi. Questa operazione può essere eseguita da uno dei due modi.<ol>
<li>Disattivare i canali non utilizzati nel software commentando i loop corrispondenti ai canali inutilizzati. Nell'IDE di Arduino, questo può essere realizzato aggiungendo "/ *" prima i loop non necessari e "* /" alla loro estremità.</li>
		<li>Disattivare i canali non utilizzati attraverso una sistemazione semplice hardware. Basta saldare insieme fili #6 e #8 (solitamente i marroni e tinta verdi fili pieni di un cavo commercialmente disponibile cat 6) e inserire nella presa RJ45 vuota del processore centrale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cremagliere di tubo carico e posto immediatamente prima di eseguire un esperimento.<ol>
<li>Garantire che tutti i fori contengono una microcentrifuga 0,5 mL con il tappo rimosso e che i tubi aderente al corpo.</li>
		<li>Riempire ogni provetta con una cella di Covata dell'insetto, caso pupal o cocoon, un airsoft pellet e infine un metallo BB. Assicurarsi che il lato filo piatto (PAC) della cella covata sia rivolto verso il pellet airsoft e metallo BB. Apporre il frontalino di cremagliera del tubo, con il bordo arrotondato verso il basso del rack, con viti in nylon da ¼ di pollice.</li>
		<li>Posto tubo rack sulla piattaforma rack, con l'apertura rivolta verso il collettore di palla che cade. Rack dovrebbe essere posizionato ai margini della piattaforma affinché un BB metallo possa cadere liberamente nella bacinella di raccolta senza rimbalzare contro un'altra porzione della struttura (Figura 7). Quando porre il rack, iniziare con l'apertura rivolta verso l'alto e quindi ruotare delicatamente in atto per garantire che metallo BBs non vengono rilasciati. Le cremagliere sono progettate in modo che i tubi inclinano leggermente all'indietro quando correttamente posizionato, riducendo la possibilità di rilascio accidentale della BBs in metallo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inserire una scheda SD nell'adattatore e quindi avviare il processore centrale inserendo un connettore micro-USB Arduino e l'altra estremità a qualsiasi adattatore USB appropriato. Lo schermo LCD visualizzerà i numeri da uno a sei quando è pronto. Cadere una singola BB metallo il collezionista di palla di ogni canale e orologio per il conteggio corrispondente ad apparire sullo schermo e per il momento giusto per visualizzare nella parte inferiore dello schermo.<ol>
<li>Se non è visualizzata l'ora corretta, ripetere i passaggi 1.6.3 e 1.6.4 per reimpostare l'orologio.</li>
		<li>Se il test di metallo BB non è registrato, il collettore è bloccato. Controllare visivamente per bloccaggio e riavviare il sistema.</li>
		<li>Se un canale "conta" un evento ogni secondo, ciò indica che il canale non è collegato correttamente. Controllare tutte le connessioni e riavviare il sistema.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sperimentare la fine e l'analisi dei dati
<ol><li>Dopo l'emersione è terminata (Vedi risultati e figure 8 e 9 per esempi della scala temporale), spegnere l'apparecchio scollegando l'Arduino. Rack può essere smontato e pulito per il riutilizzo.</li>
	<li>Durante l'esperimento, i dati vengono memorizzati sulla scheda SD in un file delimitato da virgole (CSV) accessibile dal linguaggio di programmazione R. Utilizzare la scheda SD per trasferire i dati al computer e RStudio per auto-generare grafici a bolle dei dati.<ol>
<li>Dati evento e di temperatura vengono salvati nel file stesso per l'integrità dei dati. Quindi, alcune operazioni di elaborazione deve essere completata prima dell'analisi. Importare il file delimitato da virgole in un foglio di calcolo. Colonne I e J sono la data e l'ora di emersione per le API; li rendono le colonne A e B tagliando e incollando colonne A-E in un secondo foglio di calcolo, e salvare come file separato, questo è i dati di temperatura.</li>
		<li>Colonna con titolo, "Data" e colonna B "Tempo" e ordina i dati in colonna A poi in B. Salva come un file CSV. file.</li>
		<li>Scaricare e installare l'ultima versione del RStudio da https://www.r-project.org/. Aiuto con l'utilizzo RStudio per il caricamento e l'analisi dei dati può essere trovato qui a https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html.</li>
		<li>Utilizzando lo script R disponibile in dati supplementari, i dati caricati in RStudio. Modificare la destinazione di lavoro nello script R per una partita dove il excel *. File CSV si trova. Eseguire lo script e selezionare il file di dati da analizzare. Digitare "tracciare" in console di R. Il grafico a bolle si trovino nella destinazione di lavoro denominata "High-res;" rinominare questo file da salvare come file tiff ad alta risoluzione (300 dpi).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lankinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographical+variation+in+circadian+eclosion+rhythm+and+photoperiodic+adult+diapause+in+Drosophila+littoralis.">Geographical variation in circadian eclosion rhythm and photoperiodic adult diapause in Drosophila littoralis.</a> Journal of Comparative Physiology A. 159, 123-142 (1986).</li><li>Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+circadian+eclosion+rhythm+between+non-diapause+and+diapause+pupae+in+the+onion+fly,+Delia+antiqua.">Comparison of the circadian eclosion rhythm between non-diapause and diapause pupae in the onion fly, Delia antiqua.</a> Journal of Insect Physiology. 48, 83-89 (2002).</li><li>Zimmerman, W. F., Pittendrigh, C. S., Pavlidis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+compensation+of+the+circadian+oscillation+in+Drosophila+pseudoobscura+and+its+entrainment+by+temperature+cycles.">Temperature compensation of the circadian oscillation in Drosophila pseudoobscura and its entrainment by temperature cycles.</a> Journal of Insect Physiology. 14, 669-684 (1968).</li><li>Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Yocum, I. S., Kemp, W. P., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoperiodism+synchronizes+emergence+in+the+alfalfa+leafcutting+bee+(Hymenoptera:+Megachilidae).">Thermoperiodism synchronizes emergence in the alfalfa leafcutting bee (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Environmental Entomology. 45, 245-251 (2016).</li><li>Bennett, M. M., Rinehart, J. P., Yocum, G. D., Doetkott, C., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+for+cavity+nesters:+Investigating+relevant+Zeitgebers+for+emerging+leafcutting+bees,+Megachile+rotundata+(Hymenoptera:+Megachilidae).">Cues for cavity nesters: Investigating relevant Zeitgebers for emerging leafcutting bees, Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Journal of Experimental Biology. 221, jeb175406 (2018).</li><li>Miyazaki, Y., Goto, S. G., Tanaka, K., Saito, O., Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoperiodic+regulation+of+the+circadian+eclosion+rhythm+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis.">Thermoperiodic regulation of the circadian eclosion rhythm in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 57, 1249-1258 (2011).</li><li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+background+light+conditions+on+thermoperiodic+eclosion+rhythm+of+onion+fly+Delia+antiqua.">Effects of background light conditions on thermoperiodic eclosion rhythm of onion fly Delia antiqua.</a> Entomological Science. 17, 191-197 (2014).</li><li>Greenberg, S. M., Armstrong, J. S., Setamou, M., Coleman, R. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+feeding,+oviposition,+and+emergence+of+the+boll+weevil+(Coleoptera:+Curculionidae).">Circadian rhythms of feeding, oviposition, and emergence of the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae).</a> Insect Science. 13, 461-467 (2006).</li><li>Yocum, G. D., Zdarek, J., Joplin, K. H., Lee, R. E., Smith, D. C., Manter, K. D., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+eclosion+rhythm+and+eclosion+behavior+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis,+by+low+and+high+temperature+stress.">Alteration of the eclosion rhythm and eclosion behavior in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis, by low and high temperature stress.</a> Journal of Insect Physiology. 40, 13-21 (1994).</li><li>Winfree, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+view+of+resetting+a+circadian+clock.">Integrated view of resetting a circadian clock.</a> Journal of Theoretical Biology. 28, 327-374 (1970).</li><li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interacting+effect+of+thermoperiod+and+photoperiod+on+the+eclosion+rhythm+in+the+onion+fly,+Delia+antiqua+supports+the+two-oscillator+model.">Interacting effect of thermoperiod and photoperiod on the eclosion rhythm in the onion fly, Delia antiqua supports the two-oscillator model.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1192-1197 (2010).</li><li>Short, C. A., Meuti, M. E., Zhang, Q., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+eclosion+and+preliminary+ontogeny+of+circadian+clock+gene+expression+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis.">Entrainment of eclosion and preliminary ontogeny of circadian clock gene expression in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 93, 28-35 (2016).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Vi presentiamo un protocollo per il montaggio e l'uso di un sistema che permette di misurare con precisione i tempi di comparsa dell'insetto. Questo sistema risolve due problemi, che ha limitato i disegni precedenti: automazione parziale e dimensione del campione limitato. Abbiamo risolto questi problemi automatizzando raccolta dati mediante microcontrollori, che anche ci ha permesso di aumentare la dimensione del campione utilizzando più canali. Il design attuale ha sei canali che possono contenere un totale di 1200 API. Canali supplementari possono essere aggiunti o sottratti se necessario, consentendo non solo per dimensione del campione maggiore, ma anche per simultaneamente che studiano gli effetti di trattamenti multipli. Fasi critiche, modifiche, limitazioni e applicazioni future sono discussi di seguito.
L'unica parte del sistema che non è automatico è caricare i cestelli con cellette, metallo BBs e pallini da softair all'inizio dell'esperimento. Anche se i rack sono progettati in modo che si appoggiano posteriore leggermente per impedire la caduta quando le cremagliere sono in piedi in posizione verticale, cura di metallo BBs deve essere presa quando ponendo le cremagliere per impedire il rilascio accidentale di metallo BBs. Inoltre, assicurarsi che i rack sono a filo con il bordo della mensola, così la traiettoria di caduta del metallo BB si allinea con la pista. Infine, detriti di foglia dovrebbero essere cancellato chiaro dalla pista, e il carrello di atterraggio che tiene il BBs del metallo da esperimenti precedenti deve essere deselezionata per evitare il blocco del sensore. I dati vengono automaticamente registrati su una scheda SD come un file CSV, e lo script è scritto in modo che Arduino non verrà eseguito se una scheda SD è presente. Il file di dati è importato manualmente in RStudio e visualizzati utilizzando lo script R menzionato in precedenza. Questo script verrà automaticamente i dati come un grafico a bolle del grafico e identificare il tempo mediano e il giorno dell'emersione. Lo script di Arduino è scritto per aggiungere i dati dell'evento alla fine del file, che impedisce la perdita di dati in caso di un'interruzione dell'alimentazione. Tuttavia, ciò significa anche che una volta che i dati vengono estratti dalla scheda SD, tutti i file devono essere cancellati prima dell'esperimento successivo.
I file di SketchUp può subire modifiche per regolare le dimensioni delle rastrelliere per gli insetti di dimensioni diverse, con diversi tubi di dimensioni utilizzati nelle cremagliere modificate. Inoltre, la dimensione del pellet airsoft è importante perché impedisce l'insetto da lasciando il tubo, e palline di diverse dimensioni possono essere necessari anche. Un'ampia varietà di alterazioni può essere fatto per lo script di R per modificare l'aspetto dei grafici a bolle e altri parametri grafici.
Abbiamo ridotto il rischio di falsi positivi di scrittura di un codice di antirimbalzo che disattiva qualsiasi canale specificato per un secondo dopo un metallo che BB è rilevato impedendo una singola BB metallo vengano contati come più punti dati. Anche se, questo crea la possibilità di un punto dati viene perso se molte API emergono in una sola volta, ma il fatto che i canali sono indipendenti riduce questo rischio. Un'altra limitazione del sistema attuale è che singoli punti dati non sono distinguibili, vale a dire, un metallo caduto BB non sono riconducibili a un individuo specifico. Inoltre, il sistema attuale misura emersione ma non eclosion ritmi in M. rotundata, ma dovrebbe misurare ritmi eclosion in specie cui emersione ed eclosion sono sinonimi. Infine, il design attuale non è resistente alle intemperie, limitando l'uso di ambienti controllati.
Future applicazioni includono che esaminano gli effetti di altri stimoli ambientali abiotici e biotici per emersione di temporizzazione di M. rotundata. Inoltre, perché gli insetti occupano diversi ambienti, stimoli ambientali pertinenti variano tra le specie. Così, incorporazione di altre specie di insetti è importante d'istruttore come circadiani sistemi evoluti attraverso taxa. Piccolo è conosciuto circa condizioni come inerente allo sviluppo influenzano i tempi di insorgenza adulta; di conseguenza, il nostro sistema consente di decifrare gli effetti dei trattamenti su emersione. Inoltre, combinazioni di stimoli ambientali possono influenzare le risposte dell'insetto, così gli esperimenti futuri dovrebbero incorporare più stimoli ambientali per capire i loro effetti relativi emersione. Infine, distribuzione nel campo per osservare come mediano ambienti naturali ritmi di emersione è di interesse. La facilità d'uso di questo sistema e la sua combinazione unica di produzione additiva, programmazione open source e osservabili tratti biologici, lo rendono un candidato per l'utilizzo in un ambiente educativo.

Misurare precisamente la tempistica dell'emersione degli insetti terrestri in impostazioni sperimentali è notoriamente difficile e richiede un certo grado di automazione. Parecchi meccanismi sono stati progettati in passato, incorporando un principio di "palla di cadere", utilizzando palle di cadere e sensori o un "bang-box", utilizzando un imbuto-tipo sistema1,2,3. Ci sono due limitazioni con le strutture esistenti: 1) dati raccolta è solo parzialmente automatizzato e 2) dimensione del campione o il numero di insetti emergenti che può essere rilevato è limitato. Questi problemi di diminuiscono la precisione della raccolta di dati, che è importante per studiare tempi di sfarfallamento e/o emergere modelli. Abbiamo affrontato questi problemi di progettazione di un sistema che è automatizzato e non limitato dalla dimensione del campione, consentendo all'utente di visualizzare meglio i ritmi di emersione in risposta a stimoli ambientali.
Il nostro sistema è un miglioramento per il principio di palla che cade, la versione più recente dei quali utilizzato sensori a infrarossi per rilevare emersione dell'insetto in sei minuti con incrementi di2. Il nostro sistema utilizza ancora i sensori a infrarossi, ma incorpora anche un microcontrollore Arduino per registrare la data e l'ora di ogni evento di emersione al secondo più vicino. Dati memorizzati automaticamente a una scheda secure digital (SD), che può essere esportata come un file delimitato da virgole per l'analisi. L'analisi è automatizzato utilizzando uno script personalizzato di R, che rappresentare graficamente i dati come un grafico a bolle e identificare il tempo mediano e il giorno dell'emersione.
Più canali consentono all'utente maggiore flessibilità nell'acquisizione dati. Ad esempio, il nostro disegno di canale multiplo non solo minimizza l'impatto di un sensore "intasato", ma può essere utilizzato anche per aumentare la dimensione del campione. Inoltre, più canali permettono all'utente di definire trattamenti a specifici canali in modo da poter eseguire simultaneamente in un esperimento. Utilizzo di tutti i sei canali consente circa 1200 emergenti le API devono essere registrati in un singolo esperimento. A nostra conoscenza, questo è la più grande dimensione del campione di qualsiasi sistema attuale misurazione emersione dell'insetto e ci ha permesso di osservare modelli di scala fine emersione in risposta a stimoli ambientali. Infine, il nostro sistema beneficia del fatto che la maggior parte delle parti è 3D stampato. Questo crea appunto dimensioni componenti, che riduce la probabilità di errori che si verificano (ad esempio rivelatore intasamento) durante le operazioni. Permette anche di personalizzazione per altri sistemi di ricerca.
L'obiettivo del presente protocollo è quello di generazione personalizzata un sistema preciso e automatizzato per misurare l'emersione degli insetti, di indagare domande in fisiologia cronobiologia e stress. Questo sistema è stato e continuerà ad essere, critico nelle indagini relazionate a modelli di emersione degli insetti in risposta a stimoli ambientali di domande senza risposta. Qui descriviamo il suo montaggio e uso per rilevazione di emersione dell'ape del foglio-taglio di erba medica, Megachile rotundata in impostazioni basate su laboratorio sperimentale. Il sistema è automatizzato utilizzando un microcontrollore programmabile e personalizzabile utilizzando 3D parti stampate. Stampato rack tenere in luogo provette contenenti cellule di nido ape dopo un BB in metallo. Al momento di emergere, il BB metallo viene liberato dal rack, passando attraverso un sensore ad infrarossi, registrando la data e l'ora dell'emersione di una scheda SD. Il design attuale è ottimizzato per M. rotundata, ma con piccoli ritocchi può essere adattato per altre specie di insetti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PLA printer filament</td>
			<td>www.lulzbot.com</td>
			<td>various</td>
			<td>Catalog number varies by color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>www.daigger.com</td>
			<td>EF4254C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5 mm size &#34;bb&#34; metal pellets</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00419C1IA</td>
			<td>Daisy 4.5 mm metal size bb pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm plastic &#34;softair&#34; pellets</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B003QNELYE</td>
			<td>Crosman 6 mm airsoft pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic corregated sheet</td>
			<td>www.lowes.com</td>
			<td>345710</td>
			<td>Corrugated plastic sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared emmiter/detector pair</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00XPSIT3O</td>
			<td>5 mm diameter, 940 nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ohm resisitors</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B01MSZK8DV</td>
			<td>120 ohm, 1/4 watt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 GA hookup wire</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>1311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RJ45 jacks</td>
			<td>www.sparkfun.com</td>
			<td>PRT-00643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom PCB board</td>
			<td>www.pcbexpress.com</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Can be printed from files included in the supplimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano v 3.0</td>
			<td>www.roboshop.com</td>
			<td>RB-Gra-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card module</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>DFR0071</td>
			<td>DFRobot SD card module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time Clock module</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>264</td>
			<td>DS1307 real time clock breakout board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/humidity sensor</td>
			<td>www.tinyosshop.com</td>
			<td>G4F4494F29ED05</td>
			<td>DHT11 temperature/humidity sensor on breakout board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470k ohm resistors</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00EV2R39Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female headers</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>598</td>
			<td>Break off to desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male headers</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>392</td>
			<td>Break off to desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribbon wire</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00X77964O</td>
			<td>10 wire ribbon wire with connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cat6 cable</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00N2VISLW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00E9W1URM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a precise and autonomous system for the detection of insect emergence patterns

I sistemi esistenti per misurare modelli di emersione degli insetti hanno limitazioni; Essi sono solo parzialmente automatizzati e sono limitati nel numero massimo di insetti emergenti che possano rilevare. Al fine di ottenere misure precise dell'emersione degli insetti, è necessario per i sistemi di essere semi-automatizzate e in grado di misurare un numero elevato di insetti emergenti. Abbiamo affrontato questi temi da progettare e costruire un sistema che è automatizzato e può misurare l'emergere di fino a 1200 insetti. Abbiamo modificato il sistema di "palla di cadere" esistente utilizzando Arduino microcontroller per automatizzare la raccolta dei dati ed espandere la dimensione del campione attraverso più canali di dati. Più canali di dati consentono all'utente di aumentare non solo la loro dimensione di campione, ma permette anche per trattamenti multipli essere eseguiti simultaneamente in un singolo esperimento. Inoltre, abbiamo creato uno script di R per visualizzare automaticamente i dati come un grafico a bolle, mentre il calcolo anche il mediano giorno e l'ora di emersione. L'attuale sistema è stato progettato utilizzando la stampa 3D, così l'utente può modificare il sistema di essere regolato per diverse specie di insetti. L'obiettivo del presente protocollo è quello di indagare su questioni importanti nella fisiologia cronobiologia e stress, utilizzando questo sistema automatico e preciso per misurare modelli di emersione degli insetti.

Emersione di M. rotundata è asincrona senza esposizione a un segnale ambientale, con emersione che si verificano in modo uniforme in tutto il giorno4. Tuttavia, quando esposti ad un onda quadra termoperiodo (4° C termoperiodo), emersione si trasforma in sincrono con il thermophase4,5. Questo risultato è simile ad altri studi dove gli insetti sono stati trovati a utilizzare termoperiodo indicazioni per regolare la nascita, tra cui la Mosca di carne Sarcophaga crassipalpis6, la Mosca della cipolla Delia atiqua7 e il tonchio di capsula Anthonomus grandis grandis8. Uno studio ha dimostrato che lo stress durante lo sviluppo colpisce la sincronia dell'adulto emersione in S. crassipaplpis9. Qui, presentiamo i risultati da M. rotundata che sono stati esposti a uno stress durante lo sviluppo, per verificare l'ipotesi che questo trattamento provoca la desincronizzazione dell'emersione adulto.
Eseguire il successo
L'utente dovrebbe guardare lo schermo LCD prima di aprire l'incubatrice per assicurarsi che gli insetti non stanno emergendo. Una volta completato l'esperimento, la scheda SD viene rimosso e i dati possono essere esportati in RStudio come un file delimitato da virgole per essere visualizzato come un grafico a bolle, come descritto in precedenza. Figura 8 Visualizza emersione ape sotto un termoperiodo di 4 ° C dopo l'esposizione a un sforzo freddo durante lo sviluppo. Il mirino rosso indica il tempo mediano e giorno di nascita e il nome del file è il titolo. Questo script R deve essere utilizzato per visualizzare i dati, ma non dovrebbe servire come l'analisi di sola. Per analizzare la risposta di emersione di una stecca ambientale, i dati possono essere analizzati per ritmicità (v. analisi).
Complicazione
Quando un sensore è intasato con metallo BBs, la mancanza di un segnale è conteggiata ripetutamente, dando luogo a più punti di dati falsi. Figura 9 viene illustrato il dataset stesso presentato in Figura 8, ma con uno dei sei canali ostruiti con BBs, creando così la grande bolla sul grafico. In caso di un sensore intasato, dati da questo canale possono essere facilmente rimossa dall'analisi. Integrare più canali in un esperimento è benefico nel ridurre al minimo l'impatto di un sensore intasato.
Analisi
Analisi dei dati per la presenza di sincronizzazione può essere fatto calcolando "parametro R," una statistica scalare che identifica se l'emersione è ritmica o aritmica10,11,12. Questo viene fatto calcolando il maggior numero di adulti emergenti in una finestra di 8 ore, dividendo questo numero per il numero di adulti emergenti fuori dalla finestra di 8 ore, quindi moltiplicando per 100. Tutti gli individui che emerse dovrebbero essere riuniti per calcolare il numero di adulti emergenti per ogni ora del giorno. La gamma teorica del parametro R è compreso tra 0 (emersione tutti si verifica all'interno del cancello) a 200 (emersione è distribuita uniformemente durante tutto il giorno)10. R valori < 60 sono considerati ritmica emersione, 60 < R < 90 sono debolmente ritmico e R > 90 sono aritmici. I valori di R > 150 indicare uniforme distribuzione di emersione10. Figura 8 Mostra quello emersione è ritmico con parametro R = 20,21 < 60. Dovuto al fatto che questo tipo di dati è distribuito intorno a un orologio di 24 ore ripetuto, statistiche circolare devono essere impiegate per un'analisi più robusta (descritta in dettaglio in Bennett et al., 20185). Ciò può essere compiuta tramite pacchetti di statistiche circolare disponibile per RStudio (pacchetto 'circolare'-CRAN. R-Project.org).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig1.jpg"> Figura 1: componenti fabbricati additivo. Utilizzando PLA filamento, 3D stampa le parti necessarie per il sistema. Per ogni canale in fase di costruzione, parti necessarie sono 1 collettore collettore (verde), 1 tappo (rosso), 6 piattaforma supporta (arancione), tubo 4 rack piastre di base (viola) e 4 rack faccia piastra (giallo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig2.jpg"> Figura 2: tubo montaggio piattaforma guide. Utilizzare colla a caldo per assemblare due piattaforme di cremagliera di tubo per canale in costruzione. Utilizzare tre supporti di piattaforma (mostrati in arancione) con una sezione di plastica ondulata (visualizzato in grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig3.jpg"> Figura 3: raggi x collettore collettore. Inserire un rilevatore a infrarossi in uno zoccolo di Raccoglitore (mostrato in blu) e l'emettitore nella seconda presa (mostrata in rosso). Passare i cavi del rivelatore attraverso il canale del cablaggio (indicato in giallo) e tirare tutti i quattro fili attraverso il foro di accesso (evidenziato in verde). Garantire che nessun conduttore nudo stanno toccando, usando colla a caldo per garantire loro di posto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig4.jpg"> Figura 4: Connettore cablaggio. Schema di cablaggio per il jack RJ45 prima di apporre al collettore collettore, come si vede dalla parte inferiore del jack e tabella di cablaggio per il collegamento dello schermo LCD al processore centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig5.jpg"> Figura 5: palla raccogligambi. Utilizzando un tappo (mostrato in rosso), un collettore collettore (mostrata in verde) e un 24 x 30 cm pezzo di plastica ondulata (mostrato in grigio chiaro) assemblato i pilastri dell'Assemblea di collezionista di palla. Per aggiungere una rampa, utilizzare un pezzo di plastica ondulata (mostrato in grigio scuro) 8 x 27 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig6.jpg"> Figura 6: processore centrale del PWB. Il bordo del PWB per il processore centrale è costituito da uno strato di fondo (rappresentato in verde), uno strato superiore (raffigurato in rosso) e uno strato di lattice (raffigurato in blu). Saldare femminile intestazioni ai fori tutto pass-through, ad eccezione di quelli per gli spinotti RJ45 (lungo la parte inferiore) e per i resistori di pull-down (direttamente sopra le pastiglie di RJ45). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig7.jpg"> Figura 7: assemblaggio finale. Quando è in uso, l'apparecchio deve essere montato con una piattaforma di cremagliera di tubo su entrambi i lati di ogni collezionista di palla viene utilizzato. Tubo rack con annesso faceplate deve essere posizionato in modo che essi sono ai margini della piattaforma Rack tubo, riducendo la possibilità di caduta BBs che rimbalza fuori l'apparato. L'impronta dell'apparato assemblato è circa 25 cm x 35 cm, con un'altezza di 20 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig7large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig8.jpg"> Figura 8: grafico di una tipica corsa sperimentale dopo l'elaborazione in R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig9.jpg"> Figura 9: grafico di un esperimento che ha sofferto da un rivelatore intasato, come dimostra la relativamente grande bolla il giorno 4. Il canale otturato può essere rimosso dall'analisi, preservando così i rimanenti punti di dati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig9large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Misurazione dei reticoli di emersione degli insetti richiede precisione. I sistemi esistenti sono solo semi-automatizzato e campione di dimensione è limitata. Abbiamo affrontato questi problemi di progettazione di un sistema utilizzando microcontrollori per misurare con precisione il tempo di comparsa di un gran numero di insetti emergenti.

Un sistema preciso ed autonomo per l'individuazione di modelli di emersione degli insetti

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della cronobiologia e della fisiologia dello stress, come quali segnali incidano sui tempi di emergenza degli insetti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è automatizzata e può essere utilizzata per misurare l'emergere di un gran numero di insetti. Per ogni canale in costruzione sono necessarie le seguenti parti.Un collettore collettore, un tappo finale, sei supporti della piattaforma, quattro piastre di base del rack per tubi e quattro piastre per il viso del rack del tubo. Con tre supporti della piattaforma e un pezzo di plastica ondulata da 33 per 30 centimetri, utilizzare la colla a caldo per assemblare due piattaforme rack per canale in costruzione. Installare l'elettronica nel collettore saldando prima un resistore da 120 ohm all'anodo sia dell'emettitore a infrarossi che del rivelatore a infrarossi e una lunghezza di cinque centimetri di filo elettrico calibro 22 a entrambi i catodi.Inserire con cura il rilevatore in una presa del collettore del collettore e l'emettitore nella seconda presa. Entrambi i componenti devono adattarsi perfettamente. Alimentare i fili del rivelatore attraverso il canale di cablaggio e tirare entrambi i fili attraverso il foro di accesso.Saldare tutti e quattro i fili a un jack Ethernet RJ45 utilizzando la fila posteriore di pin. Entrambi gli anodi devono essere saldati al perno più a sinistra, il catodo dell'emettitore al perno più a destra e il catodo del rivelatore a uno dei perni centrale. Fissare il jack RJ45 sopra il foro di accesso del collettore con colla a caldo, assicurandosi che all'interno del collettore non si tocchino fili nudi.Successivamente, inizia la costruzione del processore centrale per il sistema saldando le intestazioni femminili sui fori attraverso etichettati per il modulo Arduino nano, temp, clock e SD. Inoltre, saldare un'intestazione femmina sul foro passante non etichettato due per cinque nell'angolo in alto a sinistra della scheda PCB per lo schermo LCD. Agganciare e saldare sei jack RJ45 lungo il bordo inferiore della scheda PCB.Saldare sei resistori pull-down da 470 kilohm nei siti di fori passanti, situati appena sopra i martinetti RJ45. Installare il sensore di temperatura e umidità Arduino nano, DHT, orologio e SD sulla scheda PCB. Infine, collegare un filo a nastro a dieci connettori al connettore dello schermo LCD della scheda PCB.Una volta assemblato il sistema di rilevamento, caricare e posizionare due rack immediatamente prima di eseguire un esperimento. In primo luogo, assicurarsi che tutti i fori nel rack contengano un tubo di micro-centrifuga da 0,5 millilitri con il cappuccio rimosso e che i tubi si adattino perfettamente. Riempire ogni tubo con una cellula di covata di insetti, assicurandosi che il lato piatto del bordo sia rivolto verso l'apertura.Quindi aggiungere un pellet morbido ad aria e, infine, un BB metallico. Quindi utilizzare viti in nylon da un quarto di pollice per apporre la piastra frontale del rack del tubo, con il bordo arrotondato verso la parte inferiore del rack. Posiziona i rack dei tubi sulla piattaforma rack. Iniziare con le aperture rivolte verso l'alto, quindi ruotare delicatamente in posizione per assicurarsi che i BB metallici non vengano rilasciati.I rack devono essere posizionati sul bordo della piattaforma in modo che un BB metallico possa cadere liberamente nel collettore senza rimbalzare contro un'altra parte della struttura. Inserire una scheda SD nell'adattatore, quindi avviare il processore centrale collegando un connettore micro-USB all'Arduino e l'altra estremità a qualsiasi adattatore USB appropriato. Lo schermo LCD mostrerà i numeri da uno a sei quando è pronto.Rilascia una singola BB metallica nel raccoglitore di palle di ogni canale e osserva che il conteggio corrispondente appaia sullo schermo e per il momento corretto per la visualizzazione nella parte inferiore dello schermo. Dopo che tutti gli insetti sono emersi, alimentare l'apparato scollegando l'Arduino. I rack possono essere smontati e puliti per il ri uso.Durante l'esperimento di emergenza, i dati vengono memorizzati sulla scheda SD in un file delimitato da virgole. Usa la scheda SD per trasferire i dati sul computer e RStudio per generare automaticamente grafici a bolle dei dati. Sia i dati relativi agli eventi che alla temperatura vengono salvati nello stesso file per l'integrità dei dati.Prima dell'analisi, importare il file delimitato da virgole in un programma foglio di calcolo. Le colonne I e J sono la data e l'ora di emergenza per le api. Crearle colonne A e B tagliando e incollando le colonne da A a E in un secondo foglio di calcolo e salva come file separato di dati sulla temperatura per ulteriori analisi.Questa figura mostra l'emergenza delle ape sotto un termo-periodo di quattro gradi Celsius dopo l'esposizione a uno stress da freddo durante lo sviluppo. Questa figura mostra lo stesso set di dati appena visto, ma con uno dei sei canali intasati da BB, creando la grande bolla sul grafico come la mancanza di segnale viene ripetutamente conteggiata. I dati di questo canale possono essere giustamente rimossi dall'analisi.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di controllare tutte le parti saldate per assicurarsi che le connessioni funzionino. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della cronobiologia e della fisiologia dello stress per esplorare quali segnali incidano sui tempi di emergenza nelle api solitarie.

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