Name: a precise and autonomous system for the detection of insect emergence patterns
Uploaded: 2019-01-09T13:30:00
Duration: 6 min 22 s
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Nós gostaríamos de reconhecer o inseto Criobiologia e Ecofisiologia grupo de trabalho em Fargo, ND para seus comentários úteis sobre experimentos utilizando o sistema.

1. sistema construção
<ol><li>Usando o filamento PLA, imprimir o seguinte número de peças para cada canal sendo construído: colector 1 coletor (collector_manifold.stl), 1 tampa (end_cap.stl), 6 suportes de plataforma (platform_support.stl), placas da base (base_plate.stl) do cremalheira tubo 4 e 4 placas de rosto de cremalheira do tubo (face_plate.stl). Certifique-se de impressora cama é grande o suficiente para imprimir um item antes de imprimir. Todos os arquivos de STL estão disponíveis em dados complementares.</li>
	<li>Com 3 suportes de plataforma e um pedaço de plástico corrugado 33 x 30 cm, use cola quente para montar 2 plataformas de cremalheira tubo por canal sendo construída, como mostrado na Figura 2. O plástico corrugado pode ser marcado de um lado em cada canto para permitir a flexão.</li>
	<li>Instale a eletrônica em um tubo de coletor.<ol>
<li>Solde um resistor de 120 Ω para o ânodo (perna mais comprida), dos dois o emissor infravermelho e o detetor infravermelho e um comprimento ~ 5cm de 22 fios de GA para ambos os catodos. Use cores diferentes de fios para evitar confusão em etapas posteriores.</li>
		<li>Insira cuidadosamente o detector uma tomada de entrada para o colector de coletor (realçado em azul na Figura 3) e o emissor na segunda tomada (destacado em vermelho). Ambos os componentes devem caber confortavelmente.</li>
		<li>Alimentar os fios detector através do canal de cabeamento (destacado em amarelo na Figura 3) e puxar todos os quatro fios através do furo de acesso (destaque em verde). Assegure-se de que sem fios desencapados estão tocando, usando cola quente para fixá-los no lugar.</li>
		<li>Solda todos os quatro fios para um RJ45 jack (Ethernet), usando a última fila de pinos. Ambos os anodos devem ser soldados para o pino de extrema esquerda, o cátodo do emissor para o pino de extrema direita e o cátodo do detector para qualquer um dos pinos de centro (Figura 4).</li>
		<li>Fixe o jack RJ45 sobre o furo de acesso Múltiplo coletor (destacado em verde na Figura 3) com cola quente, garantindo que não há fios desencapados estão tocando dentro do colector.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construir o coletor de bola caindo (1 por canal sendo construído) como mostrado na Figura 5
	<ol>
<li>Com um colector de coletor com fios, uma tampa e uma seção de 24 x 30 cm de plástico corrugado, use cola quente para conectar a base da unidade (vermelho, verde e luz cinzenta componentes da Figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use uma seção 8 x 27 cm de plástico corrugado para adicionar uma rampa de bola caindo para o coletor (componente cinzento escuro da Figura 5). Os final cap e coletor de múltiplos projetos incluem bordas para garantir o correto posicionamento. Verifique se há uma transição harmoniosa entre a rampa para o coletor para evitar engarrafamentos durante o uso.</li>
	<li>Construa o processador central para o sistema (conforme detalhado na Figura 6).<ol>
<li>Imprima uma placa de circuito de impresso personalizado para a construção do sistema. Todos os arquivos necessários para impressão de placa PCB estão disponíveis em dados complementares.</li>
		<li>Solda cabeçalhos femininos sobre os através de-buracos rotulados para as seguintes instalações: Arduino Nano, temp, relógio, módulo SD e cristal líquido (LCD) tela (2 x 5 área do através de-furo sem rótulo no canto superior esquerdo da placa do PWB).</li>
		<li>Encaixar e seis tomadas RJ45 ao longo da borda inferior da placa do PWB de solda.</li>
		<li>Solda, resistores de pulldown seis 470 k Ohms nos locais do através de-furo localizados logo acima das tomadas RJ45.</li>
		<li>Instale o Arduino Nano, DHT-temperatura e sensor de umidade, relógio e módulo de SD da placa PCB. DHT-temperatura e umidade sensor deve ser testado antes do uso em experiências para garantir a precisão.</li>
		<li>Conecte um fio de 10-conector fita ao conector da placa do PWB tela LCD. Solde a outra extremidade do fio da fita para a tela de LCD para que os pinos de tela correspondem aos pinos do Arduino, como observado na Figura 4. Mais detalhes nos cabos de LCD estão disponíveis em https://Learn.adafruit.com/character-lcds/wiring-a-character-lcd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Programação de sistema<ol>
<li>Baixe e instale a versão mais recente do Arduino IDE para o sistema operacional correto de www.arduino.cc.</li>
		<li>Na primeira utilização, instale as bibliotecas do Arduino para o relógio de tempo real (github.com/adafruit/RTClib) e o sensor de temperatura/umidade (github.com/adafruit/DHT-sensor-library). Ajuste o relógio para a hora local atual usando o script de ds1307 incluído com a biblioteca.</li>
		<li>Carregar o sistema Arduino script, disponível em dados complementares.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sistema de utilização
<ol><li>Monte o sistema, conforme mostrado na Figura 7. Para cada canal sendo usado, um coletor de bola caindo (montado na etapa 1.4) deve ser flanqueado em ambos os lados por uma plataforma de cremalheira (montada na etapa 5.1). Use fita de empacotamento para unir peças e criar uma borda arredondada suave na plataforma de cremalheira.</li>
	<li>Configure os canais não utilizados para evitar falsos sinais positivos. Desde que o sistema se baseia em um sinal baixo para detectar um evento (detetor infravermelho não receber um sinal do emissor infravermelho), canais não utilizados devem ser configurados apropriadamente para evitar falsos sinais positivos. Isso pode ser conseguido de duas maneiras.<ol>
<li>Desative os canais não utilizados no software comentando os loops correspondente para os canais não utilizados. No Arduino IDE, isso pode ser feito adicionando "/ *" antes dos loops desnecessários e "* /" na sua extremidade.</li>
		<li>Desative os canais não utilizados através de uma acomodação simples hardware. Simplesmente juntos solde fios #6 e #8 (geralmente os marrons e sólidos verdes arames sólidos de um cabo de gato comercialmente disponíveis 6) e insira o conector RJ45 vazio no processador central.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cremalheiras de tubo carga e lugar imediatamente antes da execução de um experimento.<ol>
<li>Garantir que todos os furos de contenham um tubo de microcentrifugadora de 0,5 mL com a tampa removida, e que os tubos de cabem confortavelmente.</li>
		<li>Encha cada tubo com uma célula de ninhada inseto, caso pupa ou casulo, uma pelota de airsoft e finalmente um metal BB. Certifique-se de que lado a borda lisa (cap) da célula ninhada está virada para a pelota de airsoft e metal BB. Fixe a placa do cremalheira tubo, com a borda arredondada para baixo do rack, com parafusos de nylon de ¼ de polegada.</li>
		<li>Cremalheiras de tubo de lugar na plataforma de cremalheira, com a abertura virada para o coletor de bola cair. As cremalheiras devem ser colocadas no limite da plataforma para que um metal BB pode cair livremente o coletor sem saltar contra outra porção da estrutura (Figura 7). Ao colocar o rack, comece com a abertura virada para cima e depois rodar suavemente no lugar para garantir que BBS metais não são liberados. Os racks são projetados para que os tubos vão inclinar ligeiramente para trás quando corretamente colocado, reduzindo a chance de libertação acidental de BBs do metal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Insira um cartão SD no adaptador e em seguida, iniciar o processador central conectando um conector micro-USB para o Arduino e a outra ponta em qualquer adaptador USB adequado. A tela de LCD exibirá números de um a seis quando estiver pronto. Deixe cair um único metal BB no coletor de bola de cada canal e o relógio para a contagem correspondente aparecer na tela e para a hora correta exibir na parte inferior da tela.<ol>
<li>Se a hora correta não for exibida, repita as etapas 1.6.3 e 1.6.4 para redefinir o relógio.</li>
		<li>Se o teste metal BB não é gravado, o coletor é bloqueado. Verificar visualmente se há bloqueio e reiniciar o sistema.</li>
		<li>Se um canal "conta" um evento cada segundo, isso indica que o canal não está conectado corretamente. Verifique todas as conexões e reiniciar o sistema.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. experiência final e análise de dados
<ol><li>Findo o surgimento (ver resultados e figuras 8 e 9 para obter exemplos de escala de tempo), desligue o aparelho desconectando o Arduino. Cremalheiras podem ser desmontadas e limpo para reutilização.</li>
	<li>Durante o experimento, os dados são armazenados no cartão SD em um vírgulas Arquivo (CSV) acessível por linguagem de programação de R. Use o cartão SD para transferir dados para o computador e RStudio para geração automática de parcelas de bolha dos dados.<ol>
<li>Dados do evento e a temperatura são salvos no mesmo arquivo para integridade de dados. Daí, algum processamento deve ser concluído antes da análise. Importe o ficheiro delimitado por vírgulas para um programa de planilha. Colunas I e J são a data e hora da emergência para abelhas; torná-los colunas A e B cortando e colando colunas A-E em uma segunda planilha e salvar como um arquivo separado, isto é os dados de temperatura.</li>
		<li>"Coluna de título A com, data" coluna B "Tempo" e classificar os dados pela coluna A, em seguida, por B. salvar como um CSV. arquivo.</li>
		<li>Baixe e instale a versão mais recente do RStudio de https://www.r-project.org/. Ajudar com usando RStudio para envio e análise de dados pode ser encontrado aqui em https://cran.r-project.org/doc/manuals/r-release/R-intro.html.</li>
		<li>Usando o script R disponível nos dados complementares, carregar os dados em RStudio. Alterar o destino de trabalho no script R para combinar onde o excel *. Arquivo CSV está localizado. Execute o script e selecione o arquivo de dados para analisar. Digite "conspiração" para o console de R. O enredo de bolha será localizado no destino de trabalho chamado "Alta resolução"; Renomeie esse arquivo para salvar como um arquivo tiff de alta resolução (300 dpi).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lankinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geographical+variation+in+circadian+eclosion+rhythm+and+photoperiodic+adult+diapause+in+Drosophila+littoralis.">Geographical variation in circadian eclosion rhythm and photoperiodic adult diapause in Drosophila littoralis.</a> Journal of Comparative Physiology A. 159, 123-142 (1986).</li><li>Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+circadian+eclosion+rhythm+between+non-diapause+and+diapause+pupae+in+the+onion+fly,+Delia+antiqua.">Comparison of the circadian eclosion rhythm between non-diapause and diapause pupae in the onion fly, Delia antiqua.</a> Journal of Insect Physiology. 48, 83-89 (2002).</li><li>Zimmerman, W. F., Pittendrigh, C. S., Pavlidis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+compensation+of+the+circadian+oscillation+in+Drosophila+pseudoobscura+and+its+entrainment+by+temperature+cycles.">Temperature compensation of the circadian oscillation in Drosophila pseudoobscura and its entrainment by temperature cycles.</a> Journal of Insect Physiology. 14, 669-684 (1968).</li><li>Yocum, G. D., Rinehart, J. P., Yocum, I. S., Kemp, W. P., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoperiodism+synchronizes+emergence+in+the+alfalfa+leafcutting+bee+(Hymenoptera:+Megachilidae).">Thermoperiodism synchronizes emergence in the alfalfa leafcutting bee (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Environmental Entomology. 45, 245-251 (2016).</li><li>Bennett, M. M., Rinehart, J. P., Yocum, G. D., Doetkott, C., Greenlee, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+for+cavity+nesters:+Investigating+relevant+Zeitgebers+for+emerging+leafcutting+bees,+Megachile+rotundata+(Hymenoptera:+Megachilidae).">Cues for cavity nesters: Investigating relevant Zeitgebers for emerging leafcutting bees, Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae).</a> Journal of Experimental Biology. 221, jeb175406 (2018).</li><li>Miyazaki, Y., Goto, S. G., Tanaka, K., Saito, O., Watari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoperiodic+regulation+of+the+circadian+eclosion+rhythm+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis.">Thermoperiodic regulation of the circadian eclosion rhythm in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 57, 1249-1258 (2011).</li><li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+background+light+conditions+on+thermoperiodic+eclosion+rhythm+of+onion+fly+Delia+antiqua.">Effects of background light conditions on thermoperiodic eclosion rhythm of onion fly Delia antiqua.</a> Entomological Science. 17, 191-197 (2014).</li><li>Greenberg, S. M., Armstrong, J. S., Setamou, M., Coleman, R. J., Liu, T. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms+of+feeding,+oviposition,+and+emergence+of+the+boll+weevil+(Coleoptera:+Curculionidae).">Circadian rhythms of feeding, oviposition, and emergence of the boll weevil (Coleoptera: Curculionidae).</a> Insect Science. 13, 461-467 (2006).</li><li>Yocum, G. D., Zdarek, J., Joplin, K. H., Lee, R. E., Smith, D. C., Manter, K. D., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+the+eclosion+rhythm+and+eclosion+behavior+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis,+by+low+and+high+temperature+stress.">Alteration of the eclosion rhythm and eclosion behavior in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis, by low and high temperature stress.</a> Journal of Insect Physiology. 40, 13-21 (1994).</li><li>Winfree, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+view+of+resetting+a+circadian+clock.">Integrated view of resetting a circadian clock.</a> Journal of Theoretical Biology. 28, 327-374 (1970).</li><li>Watari, Y., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interacting+effect+of+thermoperiod+and+photoperiod+on+the+eclosion+rhythm+in+the+onion+fly,+Delia+antiqua+supports+the+two-oscillator+model.">Interacting effect of thermoperiod and photoperiod on the eclosion rhythm in the onion fly, Delia antiqua supports the two-oscillator model.</a> Journal of Insect Physiology. 56, 1192-1197 (2010).</li><li>Short, C. A., Meuti, M. E., Zhang, Q., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entrainment+of+eclosion+and+preliminary+ontogeny+of+circadian+clock+gene+expression+in+the+flesh+fly,+Sarcophaga+crassipalpis.">Entrainment of eclosion and preliminary ontogeny of circadian clock gene expression in the flesh fly, Sarcophaga crassipalpis.</a> Journal of Insect Physiology. 93, 28-35 (2016).</li></ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Apresentamos um protocolo para a montagem e utilização de um sistema que permite a medição precisa do tempo de aparecimento de insetos. Este sistema resolve dois problemas, o que limitou a projetos anteriores: automação parcial e tamanho de amostra limitada. Nós resolvemos estes problemas ao automatizar a coleta de dados utilizando microcontroladores, que também nos permitiram aumentar o tamanho da amostra por meio de múltiplos canais. O projeto atual tem seis canais que podem conter um total de 1200 abelhas. Canais adicionais podem ser adicionados ou subtraídos se necessário, permitindo que não só para o tamanho de amostra maior, mas também para simultaneamente a investigar os efeitos de vários tratamentos. Passos críticos, modificações, limitações e aplicações futuras são discutidas abaixo.
A única parte do sistema que não é automatizado é carregar os cestos com células ninhadas e metais BBs airsoft pelotas no início do experimento. Embora os racks são projetados para que eles se apoiam volta ligeiramente para impedir BBs metais quando as prateleiras são cuidados na posição vertical, em pé deve ser tomada quando da colocação das prateleiras para impedir a libertação acidental de BBs metais. Além disso, certifique-se que os racks estão alinhados com a borda da plataforma, então a trajetória de queda do metal BB alinha com a pista. Finalmente, os restos de folha devem ser limpo limpo da pista, e o trem de pouso segurando o BBs metal de experiências anteriores deve ser limpo para evitar o bloqueio do sensor. Dados é automaticamente registrados para um cartão SD como um arquivo CSV, e o roteiro é escrito para que o Arduino não funcionará a menos que um cartão SD está presente. O arquivo de dados é manualmente importado para RStudio e visualizada usando o script R mencionado anteriormente. Este script automaticamente os dados como uma trama de bolha do gráfico e identificar o tempo médio e dia de emergência. O script do Arduino é escrito para acrescentar dados de evento para o final do arquivo, o que evita perda de dados em caso de falha de energia. No entanto, isso também significa que, uma vez que os dados são extraídos a partir do cartão SD, todos os arquivos devem ser cancelados antes do próximo experimento.
Modificações para os arquivos do SketchUp podem ser feitas para ajustar o tamanho das prateleiras para insetos de diferentes tamanhos, com tubos de tamanhos diferentes, sendo usados nas prateleiras modificadas. Além disso, o tamanho da pelota airsoft é importante porque impede que o inseto saindo do tubo, e pelotas de tamanhos diferentes podem ser necessários também. Uma grande variedade de alterações pode ser feita para o script de R para alterar a aparência das parcelas de bolha e outros parâmetros do gráficos.
Reduzimos o risco de falsos positivos em escrever um código de estabilização que desativa qualquer determinado canal por um segundo, depois de um metal que BB é detectado evitando assim um único metal BB sejam contados como vários pontos de dados. Embora, isso cria a possibilidade de um ponto de dados sendo perdido, se muitas abelhas emergem de uma só vez, mas o fato de que os canais são independentes reduz este risco. Outra limitação do sistema atual é que pontos de dados individuais não são perceptíveis, ou seja, um metal quedo BB não pode ser rastreada até um indivíduo específico. Além disso, o atual sistema medidas de emergência mas não eclosão ritmos em M. rotundata, mas iria medir ritmos de eclosão em espécie onde o surgimento e a eclosão são sinônimos. Finalmente, o projeto atual não é à prova de intempéries, limitando seu uso a ambientes controlados.
Futuras aplicações incluem examinar os efeitos de outras pistas ambientais bióticos e abióticos para surgimento de temporização de M. rotundata. Além disso, porque os insetos ocupam diversos ambientes, Dicas ambientais relevantes variam entre as espécies. Assim, a incorporação de mais espécies de insetos é importante investigar sistemas como circadianos evoluídos através de táxons. Pouco é conhecido sobre as condições de desenvolvimento como afetam o momento de emergência de adultos; Portanto, nosso sistema pode ser usado para decifrar os efeitos dos tratamentos na emergência. Além disso, combinações de pistas ambientais podem afetar insetos respostas, assim, futuros experimentos devem incorporar múltiplas pistas ambientais para entender seus efeitos relativos sobre emergência. Por último, a implantação no campo para observar como configurações naturais mediam ritmos de emergência é de interesse. A facilidade de uso deste sistema, e sua combinação exclusiva de fabricação aditiva, programação de código-fonte aberto e traços biológicos observáveis, seja um candidato para uso em ambiente educacional.

Medir precisamente o momento da emersão de insetos terrestre em configurações experimentais é notoriamente difícil e requer algum grau de automação. Vários mecanismos foram concebidos no passado, incorporando também um princípio de "bola cair", usando bolas caindo e sensores ou uma "estrondo-caixa" usando um funil-tipo sistema1,2,3. Há duas limitações com projetos existentes: coleta de dados 1) é apenas parcialmente automatizada e 2) tamanho da amostra ou o número de insetos emergentes que pode ser detectado é limitado. Esses problemas diminuem a precisão da coleta de dados, o que é importante estudar o momento da eclosão e/ou surgimento de padrões. Resolvemos estes problemas através da concepção de um sistema automatizado e não limitado pelo tamanho da amostra, permitindo ao usuário Visualizar melhor ritmos de emergência em resposta aos sinais ambientais.
Nosso sistema é uma melhoria para o princípio de bola caindo, a versão mais recente dos quais usados sensores infravermelhos para detectar o surgimento de insetos em incrementos de seis minutos2. Nosso sistema ainda usa sensores de infravermelhos, mas também incorpora um microcontrolador Arduino para gravar a data e hora de cada evento de emergência para o segundo mais próximo. Dados são armazenados automaticamente para um cartão digital seguro (SD), que pode ser exportado como um arquivo delimitado por vírgulas para análise. A análise é automatizada usando um script personalizado de R, que graficamente os dados como uma trama de bolha e identificar o tempo médio e dia de emergência.
Múltiplos canais permitem ao usuário maior flexibilidade na aquisição de dados. Por exemplo, o nosso projeto de canal múltiplo não só minimiza o impacto de um sensor "entupido", mas também pode ser usado para aumentar o tamanho da amostra. Além disso, vários canais permitem que o usuário designar os tratamentos de canais específicos para que eles podem executar simultaneamente em um experimento. Usando todos os seis canais permite aproximadamente 1200 abelhas emergentes ser gravado em uma única experiência. A nosso conhecimento, este é o maior tamanho de amostra de qualquer sistema atual medindo o surgimento de insetos e nos permitiu observar padrões de emergência numa escala em resposta aos sinais ambientais. Finalmente, nosso sistema beneficia do facto de que a maioria das peças são 3D imprimido. Isso cria precisamente tamanhos componentes, que reduz a probabilidade de erros que ocorrem (tais como detector entupimento) durante as operações. Ele também permite a personalização para outros sistemas de pesquisa.
O objetivo do presente protocolo é um sistema automatizado e preciso para medir o surgimento de insetos, para investigar questões em cronobiologia e estresse fisiologia de compilação personalizada. Este sistema tem sido e continuará a ser, a crítica na investigação de questões relacionadas aos padrões de emergência de insetos em resposta aos sinais ambientais. Aqui descrevemos a montagem e utilização para a deteção de surgimento da abelha cortadeiras alfafa, Chalicodoma rotundata nas configurações experimentais em laboratório. O sistema é automatizado usando um microcontrolador programável e personalizável usando 3D peças impressas. Racks impressos segura no lugar de tubos contendo células de ninho de abelha seguindo um BB de metal. Após o surgimento, o BB metal é liberado do rack, passando através de um sensor infravermelho, gravar a data e a hora do surgimento de um cartão SD. O projeto atual é otimizado para M. rotundata, mas com pequenos ajustes pode ser adaptado para outras espécies de insetos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PLA printer filament</td>
			<td>www.lulzbot.com</td>
			<td>various</td>
			<td>Catalog number varies by color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>www.daigger.com</td>
			<td>EF4254C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4.5 mm size &#34;bb&#34; metal pellets</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00419C1IA</td>
			<td>Daisy 4.5 mm metal size bb pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.0 mm plastic &#34;softair&#34; pellets</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B003QNELYE</td>
			<td>Crosman 6 mm airsoft pellets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic corregated sheet</td>
			<td>www.lowes.com</td>
			<td>345710</td>
			<td>Corrugated plastic sheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infrared emmiter/detector pair</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00XPSIT3O</td>
			<td>5 mm diameter, 940 nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>120 ohm resisitors</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B01MSZK8DV</td>
			<td>120 ohm, 1/4 watt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22 GA hookup wire</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>1311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RJ45 jacks</td>
			<td>www.sparkfun.com</td>
			<td>PRT-00643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom PCB board</td>
			<td>www.pcbexpress.com</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Can be printed from files included in the supplimental data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino Nano v 3.0</td>
			<td>www.roboshop.com</td>
			<td>RB-Gra-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card module</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>DFR0071</td>
			<td>DFRobot SD card module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real Time Clock module</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>264</td>
			<td>DS1307 real time clock breakout board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature/humidity sensor</td>
			<td>www.tinyosshop.com</td>
			<td>G4F4494F29ED05</td>
			<td>DHT11 temperature/humidity sensor on breakout board</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>470k ohm resistors</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00EV2R39Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female headers</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>598</td>
			<td>Break off to desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male headers</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>392</td>
			<td>Break off to desired length</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ribbon wire</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00X77964O</td>
			<td>10 wire ribbon wire with connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LCD screen</td>
			<td>www.adafruit.com</td>
			<td>198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cat6 cable</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00N2VISLW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SD card</td>
			<td>www.amazon.com</td>
			<td>B00E9W1URM</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a precise and autonomous system for the detection of insect emergence patterns

Sistemas existentes para medir os padrões de emergência de insetos têm limitações; Eles são apenas parcialmente automatizados e são limitados no número máximo de insetos emergentes podem detectar. Para obter uma medição precisa do surgimento de insetos, é necessário para sistemas ser capaz de medir um grande número de insetos emergentes e semi-automático. Abordámos estas questões por projetar e construir um sistema que é automatizado e pode medir o surgimento de até 1200 insetos. Nós modificamos o sistema de "bola cair" existente usando Arduino Microcontroladores para automatizar a coleta de dados e expandir o tamanho da amostra através de múltiplos canais de dados. Múltiplos canais de dados permitem que o usuário não só aumentar o seu tamanho de amostra, mas também permite vários tratamentos a ser executados simultaneamente em uma única experiência. Além disso, criamos um script R para visualizar automaticamente os dados como uma trama de bolha, enquanto também calcular a mediano dia e hora da emergência. O sistema atual foi concebido utilizando a impressão 3D, assim o usuário pode modificar o sistema de ser ajustados para diferentes espécies de insetos. O objetivo do presente protocolo é investigar questões importantes na fisiologia cronobiologia e stress, usando este sistema automatizado e preciso para medir os padrões de aparecimento de insetos.

Surgimento de M. rotundata é assíncrono sem exposição a uma sinalização ambiental, com o surgimento de ocorre uniformemente durante todo o dia4. No entanto, quando expostos a uma onda quadrada de thermoperiod (thermoperiod de 4° C), surgimento se torna síncrono para o thermophase4,5. Este resultado é semelhante a outros estudos onde insetos foram encontrados usar thermoperiod sugestões para regular a emergência, incluindo a mosca de carne Sarcophaga crassipalpis6, a mosca da cebola Delia atiqua7 e o bicudo Anthonomus grandis grandis8. Um estudo demonstrou que o stress durante o desenvolvimento afeta a sincronia de emergência de adultos em S. crassipaplpis9. Aqui, apresentamos resultados de M. rotundata que foram expostos a um estresse durante o desenvolvimento, para testar a hipótese de que este tratamento faz com que a dessincronização de emergência de adultos.
Correr bem-sucedida
O usuário deve prestar atenção a tela de LCD antes de abrir a incubadora para certificar-se de insetos já não estão surgindo. Uma vez concluído o experimento, o cartão SD é removido e os dados podem ser exportados em RStudio como um arquivo delimitado por vírgula para ser visualizado como uma trama de bolha, como descrito anteriormente. Figura 8 mostra o surgimento de abelha sob uma thermoperiod de 4 ° C após a exposição a um estresse térmico durante o desenvolvimento. A mira vermelha indica o tempo mediano e dia de surgimento e o nome do arquivo é o título. Este script R deve ser usado para visualizar os dados, mas não deve servir como a única análise. Para analisar a resposta de emergência a uma sinalização ambiental, os dados podem ser analisados para ritmicidade (Ver análise).
Complicação
Quando um sensor está entupido com BBs metais, a falta de um sinal é repetidamente contada, dando origem a vários pontos de dados falsos. A Figura 9 demonstra o mesmo conjunto de dados apresentado na Figura 8, mas com um dos seis canais entupidos com BBs, criando assim a grande bolha no gráfico. No caso de um sensor entupido, dados deste canal podem ser facilmente removidos da análise. Incorporar vários canais em um experimento é benéfico em minimizar o impacto de um sensor entupido.
Análise
Analisar dados de presença de sincronização pode ser feito através do cálculo "parâmetro R," uma estatística escalar que identifica se a emergência é rítmica ou arrítmicos10,11,12. Isto é feito calculando-se o maior número de adultos emergentes em uma janela de 8 horas, dividindo este número pelo número de adultos emergentes fora da janela de 8 horas, então multiplicando por 100. Todos os indivíduos que surgiram devem ser agrupados para calcular o número de adultos emergentes para cada hora do dia. A gama teórica de parâmetro R é de 0 (todos surgimento ocorre dentro do portão) a 200 (surgimento é distribuído uniformemente ao longo do dia)10. R valores < 60 são considerados emergência rítmica, 60 < R < 90 são fracamente rítmica e R > 90 são arrítmicos. Valores de R > 150 indicar uniform distribuição de emergência10. A Figura 8 mostra essa emergência é rítmica com o parâmetro R = 20,21 < 60. Devido ao fato de que este tipo de dados é distribuído ao redor de um relógio de 24 horas a repetição, estatísticas circulares devem ser empregadas para uma análise mais robusta (descrita em detalhes no Bennett et al, 20185). Isso pode ser feito através de pacotes de estatísticas circulares disponíveis para RStudio (pacote 'circular'-CRAN. R-Project.org).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig1.jpg"> Figura 1: aditivo fabricado componentes. Usando o filamento PLA, 3D imprimir as peças necessárias para o sistema. Para cada canal a ser construída, partes necessárias são 1 distribuidor de coletor (verde), 1 tampa de extremidade (vermelha), plataforma 6 suporta (laranja), tubo 4 rack placas base (roxas) e 4 placas de rosto de cremalheira tubo (amarelo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig2.jpg"> Figura 2: montagem de plataforma de cremalheira de tubo. Use cola quente para montar duas plataformas de cremalheira tubo por canal sendo construído. Utilize três suportes de plataforma (mostrados em laranja) com uma seção de plástico corrugado (mostrado em cinza). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig3.jpg"> Figura 3: radiografia colector coletor. Inserir um detector infravermelho uma tomada de entrada para o coletor (mostrado em azul) e o emissor na segunda tomada (mostrado em vermelho). Alimentar os fios detector através do canal de cabeamento (mostrado em amarelo) e puxar todos os quatro fios através do furo de acesso (destaque em verde). Assegure-se de que sem fios desencapados estão tocando, usando cola quente para fixá-los no lugar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig4.jpg"> Figura 4: conector fiação. Diagrama de fiação para o jack RJ45 antes da aposição para o distribuidor do coletor, como visto da parte inferior da tabela de fiação para ligar a tela de LCD para o processador central e jack. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig5.jpg"> Figura 5: montagem do coletor da esfera. Usando uma tampa (mostrado em vermelho), distribuidor de um coletor (mostrado em verde) e um 24 x 30 cm o pedaço de plástico corrugado (mostrado em cinza claro) montar o shell do conjunto do coletor de bola. Use um pedaço de plástico corrugado (mostrado em cinza escuro) 8 x 27 cm para adicionar uma rampa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig6.jpg"> Figura 6: Processador Central do PWB. A placa PCB para o processador central consiste de uma camada de fundo (representada em verde), uma camada superior (representada em vermelho) e uma camada de serigrafia (representados em azul). Solda femininos cabeçalhos para buracos todos de passagem, exceto aqueles para as tomadas RJ45 (ao longo do fundo) e para os resistores suspenso (directamente sobre as almofadas de RJ45). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig7.jpg"> Figura 7: montagem Final. Quando em uso, os aparelhos devem ser montados com uma plataforma de cremalheira tubo em ambos os lados de cada coletor de bola sendo usado. Cremalheiras de tubo com faceplates anexados devem ser posicionadas para que eles estão no limite da plataforma de cremalheira tubo, reduzindo a possibilidade de queda BBs saltando fora do aparelho. A pegada do aparato montado é aproximadamente 25 cm x 35 cm, com uma altura de 20 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig7large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig8.jpg"> Figura 8: gráfico de uma execução experimental típica após transformação em R. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig8large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58362/58362fig9.jpg"> Figura 9: gráfico de um experimento que sofria de um detector de entupido, como mostrado pela bolha relativamente grande, no dia 4. O canal entupido pode ser removido a partir da análise, preservando os restantes pontos de dados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58362/58362fig9large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Precise and Autonomous System for the Detection of Insect Emergence Patterns

Medição dos padrões de emergência de insetos requer precisão. Os sistemas existentes são apenas semi-automático e amostra tamanho é limitado. Abordámos a estas questões, criando um sistema usando microcontroladores para medir precisamente o tempo de aparecimento de um grande número de insetos emergentes.

Um sistema autónomo e preciso para a detecção de padrões de emergência de insetos

Existing systems to measure insect emergence patterns have limitations; they are only partially automated and are limited in the maximum number of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da cronobiologia e fisiologia do estresse, como quais pistas afetam o momento de emergência de insetos. A principal vantagem dessa técnica é que ela é automatizada, e pode ser usada para medir o surgimento de um grande número de insetos. As seguintes partes são necessárias para cada canal que está sendo construído.Um coletor coletor, uma tampa de extremidade, seis suportes de plataforma, quatro placas base de rack de tubo, e quatro placas faciais de rack de tubo. Com três suportes de plataforma e um pedaço de plástico ondulado de 33 por 30 centímetros, use cola quente para montar duas plataformas de rack de tubo por canal que está sendo construído. Instale eletrônicos no coletor, soldando pela primeira vez um resistor de 120 ohm para o ânodo do emissor infravermelho e do detector infravermelho e um comprimento de cinco centímetros de fio elétrico de 22 bitolas para ambos os cátodos.Insira cuidadosamente o detector em uma tomada do coletor e o emissor na segunda tomada. Ambos os componentes devem caber feio. Alimente os fios do detector através do canal de cabeamento e puxe ambos os fios através do orifício de acesso.Solde todos os quatro fios para uma tomada de ethernet RJ45 usando a linha de trás dos pinos. Ambos os ânodos devem ser soldados para o pino mais à esquerda, o cátodo do emissor para o pino mais à direita, e o cátodo do detector para qualquer um dos pinos centrais. Fixar a tomada RJ45 sobre o orifício de acesso coletor com cola quente, garantindo que nenhum fio nu esteja tocando dentro do coletor.Em seguida, inicie a construção do processador central para o sistema soldando cabeçalhos femininos nos furos rotulados para arduino nano, temp, clock e módulo SD. Além disso, solde um cabeçalho feminino no buraco de dois por cinco sem rótulo no canto superior esquerdo da placa PCB para a tela LCD. Entre e solde seis tomadas RJ45 ao longo da borda inferior da placa PCB.Soldar seis resistores de 470 quilos ohm pull-down em locais de buracos, localizados logo acima das tomadas RJ45. Instale o sensor Arduino nano, DHT de temperatura e umidade, relógio e módulo SD na placa PCB. Finalmente, conecte um fio de fita de dez conectores ao conector de tela LCD da placa PCB.Uma vez que o sistema de detecção tenha sido montado, carregue e coloque dois racks imediatamente antes de executar um experimento. Primeiro, certifique-se de que todos os orifícios no rack contêm um tubo de microcentrífugo de 0,5 mililitro com a tampa removida, e que os tubos se encaixam feio. Encha cada tubo com uma célula de ninhada de inseto, certificando-se de que o lado da borda plana esteja voltado para a abertura.Em seguida, adicione uma pelota macia de ar, e finalmente, um BB de metal. Em seguida, use parafusos de nylon de 25 cm para fixar a placa facial do rack de tubo, com a borda arredondada em direção à parte inferior do rack. Coloca os racks de tubo na plataforma do rack. Comece com as aberturas voltadas para cima e, em seguida, gire suavemente no lugar para garantir que os BBs metálicos não sejam liberados.Racks devem ser colocados na borda da plataforma para que um BB de metal possa cair livremente no coletor sem saltar contra outra parte da estrutura. Insira um cartão SD no adaptador e, em seguida, inicie o processador central conectando um conector micro-USB no Arduino e a outra extremidade em qualquer adaptador USB apropriado. A tela LCD exibirá números de um a seis quando estiver pronta.Solte um único BB de metal no coletor de bolas de cada canal e observe que a contagem correspondente apareça na tela e para que a hora correta seja exibida na parte inferior da tela. Depois de todos os insetos terem emergido, desabasse o aparelho desligando o Arduino. Os racks podem ser desmontados e limpos para reutilização.Durante o experimento de emergência, os dados são armazenados no cartão SD em um arquivo delimitado por vírgula. Use o cartão SD para transferir dados para o computador e o RStudio para gerar automaticamente gráficos de bolhas dos dados. Os dados de eventos e de temperatura são salvos no mesmo arquivo para integridade de dados.Antes da análise, importe o arquivo delimitado de vírgula em um programa de planilha. As colunas I e J são a data e a hora do surgimento das abelhas. Faça-as colunas A e B cortando e colando colunas A a E em uma segunda planilha, e salve como um arquivo separado de dados de temperatura para análise suplementar.Esta figura mostra o surgimento de abelhas sob um período termotítlico de quatro graus Celsius após a exposição a um estresse frio durante o desenvolvimento. Esta figura mostra o mesmo conjunto de dados que apenas visto, mas com um dos seis canais entupidos com BBs, criando a grande bolha no gráfico como a falta de sinal é repetidamente contada. Os dados deste canal podem ser removidos justificadamente da análise.Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de verificar todas as peças soldadas para ter certeza de que as conexões estão funcionando. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da cronobiologia e fisiologia do estresse explorarem quais pistas afetam o momento de emergência em abelhas solitárias.

Research

JoVE Journal

Environment

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