Name: visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00
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我们感谢罗伯特纳尔准备飞行食品培养基。这项工作得到了 NIH 补助金 NS070644 R.S.M. 的支持, 并由 ALS 协会 (#256)、FRM (#AJE20170537445) 和 ATIP 艾文莉项目资助 J.E。

1. 腿部解剖和固定
<ol><li>采用玻璃多孔板, 用70% 乙醇填充适当数量的水井。添加 15–20 CO2-麻醉苍蝇 (无论是性别和任何年龄) 对每个井和使用刷子, 轻轻地将苍蝇放入乙醇溶液, 直到苍蝇完全淹没。 注意: 这一步是去除角质层的疏水性。不要洗涤超过1分钟, 因为这增加了角质层的自动荧光。</li>
	<li>在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中用0.3% 非离子表面活性剂洗涤剂溶液冲洗苍蝇3次。在这个溶液...

<ol>
	<li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).</li><li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons.">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li><li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes.">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila.">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila:+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map.">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).</li></ol>

成人果蝇的角质层和其他含有许多深色色素的节肢动物, 是观察其体内结构的主要障碍。此外, 它是强自动荧光, 这是由固定更糟。这两个特点是非常困难的观察荧光染料或分子体内的动物与外骨骼。
我们所描述的程序和我们在实验室中经常使用的过程会产生轴突轨迹的清晰和详细的图像, 以及它们在成年果蝇腿上的末端终点。重要的是, 没有从腿部角质层发出的荧光的?...

像脊椎动物肢体,果蝇成人腿被组织成段。每只苍蝇腿包含14个肌肉, 其中每一个包括多个肌肉纤维1,2。成人腿 MNs 的细胞体位于 T1 (前胸), T2 (mesothoracic) 和 T3 (metathoracic) 神经节的两侧的腹神经线 (VNC), 结构类似于脊椎动物脊髓 (图 1)。有大约 50 MNs 在每个神经节, 目标肌肉在四段的同侧腿 (髋, 粗隆, 股骨和胫骨) (图 1)3。重要的是, 每一个成人腿 MN 有一个独特的形态特征, 是高度定型的动物之间3,4。所有这些独特的 MNs 来自11干细胞, 称为果蝇 (国家统计局) 生产腿部 MNs 在幼虫阶段3,4。在幼虫阶段结束时, 所有未成熟的分裂后 MNs 在蜕变过程中区分, 以获得其特定的树突状轴和突索末端目标, 它们定义了其独特的形态学3,4。以前, 我们测试了一个假设, 即转录因子组合编码 (TFs) 指定每个果蝇成人腿 MN5的独特形态。作为一个模型, 我们使用血统 B, 其中一个 11 NB 血统, 产生七的 MNs, 并证明了 TFs 的组合代码表示在分裂后成人腿 MNs 指示他们的个人形态。通过 reprograming MNs 的 TF 代码, 我们能够以可预测的方式切换锰形态。我们调用这些 tfs: mTFs (形态学 TFs)5。
成人 MNs 形态学分析的最具挑战性的部分之一是通过高分辨率的厚和自动荧光角质层可视化轴突。我们通常标签轴突与膜标签 GFP 表示在 MNs 与二进制表达系统, 如DVglut-Gal4/UAS-mCD8::GFP或DVglut-QF/QUAS mCD8::GFP, 其中DVglut是一个强大的驱动程序表示在运动神经元6。通过将这些工具与其他克隆技术 (如镶嵌分析与阻遏标记 (MARCM)7、cis MARCM8或 MARCMbow5) 相结合, 我们可以将 GFP 表达限制为 MNs 的亚群进行表型分析轴突更容易。我们已经生成了一个协议, 以保持腿部锰轴突形态学完好的成像和随后的3D 重建通过解决成人果蝇腿固有的特定问题, 如 (1) 固定的成人腿的内部结构不影响轴突形态学、内源性荧光表达和腿部肌肉, (2) 腿的安装, 以保持盖玻片下的整体结构和适当的成像方向, 和 (3) 图像处理获得角质层背景以及轴突荧光信号。虽然该协议已被详细用于检测锰轴突的荧光表达, 但它可以应用于可视化节肢动物中腿部 neuromusculature 的其他成分。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E/6550DF/17</td>
			<td>Absolute analytical reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonionic&#160;surfactant&#160;detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Triton X-100, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass multi-well plate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71563-01</td>
			<td>9 cavity Pyrex, 100x85 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 229-1</td>
			<td>Glycerol (Molecular Biology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Sun Jin Lab Co</td>
			<td>IS006</td>
			<td>iSpacer, four wells, around 12 &#956;L working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square 22x22 mm coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FIS#12-541-B</td>
			<td>No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 
			25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ 
			silicon/glycerol/water 
			immersion) (420852-9871-000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-Image software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Amira 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle

神经元规范的大部分工作都是在基因和生理上易于处理的模型 (如C) 中进行的。线虫,果蝇幼虫和鱼类, 它们都从事波动运动 (如爬行或游泳) 作为他们的主要运动模式。然而, 对单个运动神经元 (MN) 规范 (至少在告知疾病治疗方面) 的更复杂的理解要求一个同样易于驾驭的系统, 更好地模拟复杂的基于附属物的运动方案。脊椎动物。成人果蝇运动系统, 负责步行满足所有这些标准与轻松, 因为在这个模型中, 它是可能的研究一个小数目的容易分辨的腿 MNs (大约 50 MNs 每腿) 的规格都使用一个巨大的一系列强大的基因工具, 以及基于附属物的运动方案的生理环境。在这里, 我们描述一个协议, 以可视化腿部肌肉神经支配在成人苍蝇。

如图 4所示, 此过程允许在成人果蝇腿中使用 GFP 标记的轴突, 以及它们的末端芯棒成像。重要的是, 没有从腿部角质层发出的荧光的任何污染得到一个干净的 GFP 信号。然后, 从角质层的信号可以与 GFP 信号结合, 以确定轴突在腿部的定位 (图 4E、图 1和视频 1)。关键的是, 获得良好的固定腿是很重要的?...

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Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

通过成人角质层可视化果蝇腿运动神经元轴突

在这里, 我们描述了一个协议, 通过固定, 安装, 成像和后成像步骤, 可视化的荧光灯蛋白在果蝇成人腿的轴突靶向。

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

这种方法可以很容易地适应观察来自其他荧光蛋白的信号，或可用于成像轴子在其他成人中。这种技术的主要优势有助于轴子及其终端轴的出色的三维重建和可视化。首先用70%乙醇在玻璃多孔板中填充适当数量的井。用刷子将15至20种任何年龄或性别的二氧化碳麻醉苍蝇添加到每口井中，然后轻轻地将苍蝇放入乙醇中，直到它们完全被淹没。不超过一分钟后，用磷酸盐缓冲盐水中的0.3%非离子表面活性剂洗涤剂溶液冲洗苍蝇三次，每次洗涤至少10分钟。最后一次洗涤后，用钳子去除每只苍蝇的头部和腹部，而不损坏胸段或腿部，并使用一对细钳的尖端轻轻地，但牢牢地施加压力到考克斯胸结，以分离一条腿从胸段。将腿部放在新多井板的一个井中，在冰上含有新鲜准备好的4%甲醛，在4摄氏度下过夜孵育。重要的是轻轻地将腿推入固定缓冲液，而不让它们漂浮以获得固定良好的腿。第二天，用新鲜0.3%的非离子表面活性剂洗涤剂溶液洗腿五次，每次洗涤20分钟。上次洗涤后，用安装介质更换洗涤剂，将腿部保持至少 24 小时。第二天，在玻璃显微镜幻灯片的涂层端旁边加入约20微升70%甘油，用22到22毫米盖玻片覆盖甘油。接下来，在盖玻片右侧加入约 10 微升的安装介质系列，并在 10 微升线右侧应用第二条 30 微升安装介质。使用精细钳子，将一条腿从多孔板以介质滴向外部上、下方向的 10 微升安装介质条。重复，直到六到八条腿被安装和对齐，并在腿上放置第二个盖玻片，使第二个盖玻片稍微放在第一个盖玻片上。然后在盖玻片的每个角落使用指甲油，以确保它们就位。要成像腿部，请同时使用 488 纳米激光器和两个探测器设置第一个轨道，以获得 GFP 和角质层自动荧光。选择 20 到 25 倍的油浸目标，将分辨率设置为 1024 x 1024 像素，深度为 12 位，将 z 间距设置为 1 微米。将幻灯片加载到显微镜阶段，并使用相同的激光功率对两个探测器，调整第一个探测器的增益以获得明亮的 GFP 信号，并调整第二个探测器，以确保某些具有高角质层信号的区域在此探测器中产生饱和信号。然后，如果腿已伸出或太大，无法在单个帧中成像，则使用磁贴或位置选项对腿进行图像图像。对于图像处理，请打开 ImageJ 斐济中的共生堆栈，并使用 Bio 格式插件打开任何非 TIFF 格式的图像。要拆分通道，请选择"图像、颜色"和"分割通道"。要从 GFP 信号中减去角质层信号，请打开"过程"和"图像计算器"，并从探测器中选择堆栈作为图像一。在操作窗口中，选择从探测器二中减去轨道作为图像二，以便只获得内源性 GFP 信号。使用图像、堆栈、Z 保护为内生 GFP 信号生成最大强度投影。使用亮度控制窗口中的控件调整亮度和对比度。然后生成角质层的平均强度，然后是图像、颜色和合并通道，以将 GFP 堆栈与从探测器 2 获得的仅角质层堆栈合并回来。这将导致由组织特异性 GFP 信号以及角质层信号组成的 RGB 图像，以帮助识别腿部段内的轴孔轴。要使用宏，请打开共和堆栈，然后单击"图像、调整"和"亮度/对比度"。然后单击"插件"和"宏运行"以运行宏并按照说明操作。当要求在图像计算器窗口中指定操作时，请选择图像 1 作为堆栈 1。在操作窗口中，选择"减法"。选择图像二作为堆栈二。当被要求调整对比度时，使用亮度控制窗口中的控件调整 GFP 最大投影图像和角质层平均投影的亮度对比度，以生成显示绿色 GFP 和灰色角质层两个信号的 RGB 合并图像。然后合并堆栈 1 和堆栈 2 的结果，生成可以在下一阶段使用的组合 GFP 和角质层堆栈。要以三维方式可视化腿部，请打开相应的 3D 软件程序中的 RGB 堆栈。在弹出式对话窗口中，选择模式转换部分中的所有通道，并输入从上一分析中获得的体子的大小。在通道一模块中，右键单击并选择"显示"和"Volren"。然后左键单击 Volren 模块。在"属性"部分中，左键单击"高级"并选择 DDR。然后调整伽玛值以查看角质层背景。在通道二模块中，右键单击并选择"显示卷"。然后左键单击 Volren 模块，编辑并选择 VolrenGreen.col。使用此过程，来自角质层的信号可以与 GFP 信号结合，以识别轴在腿部内的定位。获得固定良好的腿是至关重要的。在正确固定的腿，腿内的内部结构是统一的颜色和气管，这是黑暗的，是可见的。在固定不良的腿部，暗物质存在于焦油和头骨中，气管系统在股骨和考克斯中不清晰可见。我们在这里描述的程序克服了通过高分辨率的厚和自动荧光角质层检测运动神经元轴子中荧光表达的挑战。因此，获得的干净和详细的荧光信号使我们能够使用三维成像程序可视化和量化轴翁树干的三维特征。因此，这项技术将使我们能够使用成人果蝇作为模型，不仅研究运动神经元的发展，而且研究，了解退行性疾病，如 ERAS 对运动系统集成的影响。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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科研

发育生物学

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