Name: visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00
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ロバート ・ ルナールにありがとうはえの食糧媒体の準備します。この作品は R.S.M. に NIH グラント NS070644 によってサポートされていると J.E. に ALS 協会 (#256)、FRM (#AJE20170537445)、ATIP アベニール プログラムから資金調達

1. 足の解剖と固定
<ol><li>ガラスのウェル プレートと塗りつぶし 70% エタノールと井戸の適切な数を取る。15-20 CO2を追加-それぞれに (セックスとあらゆる年齢のいずれか) の麻酔をかけられたハエも、ブラシを使用して軽くエタノール溶液にハエ ハエが完全に水中に沈むまで。 注: この手順は、キューティクルの疎水性を取り除くことです。これはキューティクルの自己蛍光を増加...

<ol>
	<li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).</li><li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons.">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li><li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes.">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila.">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila:+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map.">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).</li></ol>

多くの暗い顔料を含んだ大人のショウジョウバエと他の節足動物のキューティクルは、自分の体の内部構造を表示するための主要な障害です。さらに、それは強く固定によって悪化している自動蛍光です。これらの 2 つの機能は、蛍光染料または外骨格を持つ動物の体内分子の観測は非常に問題になります。
手順については、ラボで日常的に使用する軸索軌道と大人の<e...

脊椎動物の四肢のようなショウジョウバエの大人の脚は、セグメントに編成されます。各フライの脚には、複数の筋線維1,2を含む 14 の筋肉が含まれています。大人の脚 MNs の細胞体は、T1 (老熟)、(キリギリス)、T2 と T3 (誘発) 大脳腹側神経索 (VNC) 脊椎脊髄 (図 1) に類似した構造の両側にあります。対象筋 (coxa、転子、大腿骨、脛骨) の同側の脚の 4 つのセグメント (図 1)3、各神経節約 50 MNs があります。重要なは、それぞれ個々 の大人の脚 MN は、動物3,4間のステレオタイプが強くユニークな形態の id です。これらのすべてのユニークな MNs は神経芽細胞 (NBs) 幼生3,4脚 MNs の生産と呼ばれる 11 の幹細胞から派生しました。すべて幼虫の段階の終わりに彼らの特定樹状アーバーと、ユニークな形態の3、4を定義する軸索ターミナルのターゲットを取得する変態未熟な後 MNs を区別します。以前転写因子 (TFs) の組合せのコードが各ショウジョウバエ大人の脚は MN5のユニークな形態を指定する仮説をテストしました。モデルとして系統 B、MNs のうち 7 つを生成し、TFs 後大人の脚 MNs で表現の組合せコードが彼らの個々 の形態を指定することを示した 11 NB 系統の 1 つを使用しました。MNs の TF のコードを reprograming に予測可能な方法で MN の形態を切り替えることがきました。我々 はこれらの TFs を呼び出す: Mtf (形態 TFs)5。
大人の MNs の形態学的分析の最も困難な部分の 1 つは高解像度の厚さと自動蛍光キューティクルを介して軸索を視覚化します。我々 は通常DVglut Gal4などのバイナリ表現システムと MNs で表される膜タグ GFP と軸索をラベル/UA mCD8::GFPまたはDVglut QF/擬 mCD8::GFP, DVglutが強いドライバーで表されます運動ニューロン6。抑制型マーカー (MARCM)7、cis MARCM8、または MARCMbow5とモザイク解析など他のクローン技術と、これらのツールを組み合わせて、我々 は表現型の分析を行う MNs のサブポピュレーションを GFP 発現を制限できます。簡単に軸索。大人の脚の内部構造の (1) の固定など大人のショウジョウバエ脚に固有の特定の問題に取り組むことによって脚 MN 軸索形態のイメージングおよび後続の三次元再構成のためそのままを維持するためにプロトコルを生成します。軸索形態、内因性の蛍光式、脚の筋肉に影響を与えずに観察の下でそしてイメージング、および (3) 画像のキューティクルを取得する処理のための適切な方向の全体的な構造を維持するために脚の (2) の取付背景として軸索の蛍光信号。このプロトコルは、MN 軸索における蛍光発現の検出のために詳述されている、間は、節足動物の脚 neuromusculature の他のコンポーネントの可視化に適用できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E/6550DF/17</td>
			<td>Absolute analytical reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonionic&#160;surfactant&#160;detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Triton X-100, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass multi-well plate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71563-01</td>
			<td>9 cavity Pyrex, 100x85 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 229-1</td>
			<td>Glycerol (Molecular Biology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Sun Jin Lab Co</td>
			<td>IS006</td>
			<td>iSpacer, four wells, around 12 &#956;L working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square 22x22 mm coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FIS#12-541-B</td>
			<td>No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 
			25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ 
			silicon/glycerol/water 
			immersion) (420852-9871-000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-Image software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Amira 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle

神経の仕様の仕事の大半は、 Cなどの遺伝学的および生理学的にも扱いやすいモデルで行われています。線虫、ショウジョウバエの幼虫、魚、すべての歩行の彼らの主なモードとして (のようなクロールまたは水泳) 波動運動に従事します。しかしより個々 の運動ニューロン (MN) の仕様の理解を洗練された-少なくとも疾患の治療に知らせるという点で-より良いモデルの複雑な付加物に基づいた歩行スキームを均等に扱いやすいシステムを要求脊椎動物。アダルトショウジョウバエ運動システム歩いて担当を満たしているこれらすべての条件は、簡単にこのモデルでは、少数の容易に識別脚 MNs (足あたり約 50 MNs) の仕様を検討することが可能だから両方を使って広大です強力な遺伝学的ツールと付属物に基づいた歩行スキームの生理のコンテキストでは配列です。ここで大人のフライで脚筋の神経支配を視覚化するプロトコルについて述べる。

図 4に示すとおり、この手順はそのターミナル アーバーと共に大人のショウジョウバエ脚で GFP 標識軸索の優れたイメージングをできます。重要なの脚キューティクルによって放出される蛍光から任意の汚染のないクリーンな GFP 信号が得られます。キューティクルからの信号は、GFP 信号 (ビデオ 1、図 1、<strong class=...

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Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

ここで固定、取付け、イメージング、およびイメージ作成後の手順でショウジョウバエの大人の足に蛍光タンパク質を持つ軸索ターゲットを視覚化するプロトコルについて述べる。

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

この方法は、他の蛍光タンパク質からのシグナルを観察するために容易に適応することができ、または他の成人の軸索を画像化するために使用することができこの技術の主な利点は、軸索およびそれらの末端アーバーの優れた3次元の再構築および視覚化を容易にする。ガラスマルチウェルプレートに適切な数のウェルを70%エタノールで充填することで始めます。ブラシを使用して、任意の年齢または性別の15〜20個の二酸化炭素麻酔付きハエを各井戸に加え、ハエが完全に水没するまでエタノールにそっと手を出します。1分以上後、1回の洗浄につき少なくとも10分間、リン酸緩衝生理食塩水中に0.3%非イオン性界面活性剤溶液でハエを3回洗い流します。最後の洗浄後、胸部または脚を損傷することなく、各フライの頭と腹部を取り除くために鉗子を使用し、細かい鉗子のペアの先端を使用して、コクサ胸部接合部に穏やかにしっかりと圧力をかけ、胸部セグメントから片方の脚を取り外します。準備した新しいマルチウェルプレートの1つの井戸に足を置き、氷の上に4%パラホルムアルデヒドを入れ、摂氏4度で一晩インキュベーションします。脚を浮かべずに固定バッファに優しく押し込んで、足を固定して得ることが重要です。翌日、1回20分間、新鮮な0.3%非イオン界面活性剤洗浄剤溶液で5回脚を洗浄します。最後の洗浄後、洗剤を取り付け媒体に交換し、脚を取り付け媒体に少なくとも24時間置き換えます。翌日、ガラス顕微鏡スライドのコーティングされた端に約20マイクロリットルの70%グリセロールを加え、グリセロールを22 x 22ミリのカバースリップで覆います。次に、カバースリップの右側に取り付け媒体の約10マイクロリットルラインを加え、10マイクロリットルラインの右側に2番目の30マイクロリットルの取り付け媒体を適用します。細かい鉗子を使用して、片方の脚を媒体の滴でマルチウェルプレートから、外付け側の上方向または下向きの10マイクロリットルの取り付け媒体に移します。6~8本の脚が取り付けられ、整列するまで繰り返し、2番目のカバースリップが最初のカバースリップの上にわずかに置くように脚の上に2番目のカバースリップを置きます。その後、カバーリップの各コーナーでマニキュアを使用して、それらを所定の位置に固定します。脚を画像化するには、488ナノメートルのレーザーと2つの検出器を同時に使用して、GFPとキューティクルの両方の蛍光を得るための最初のトラックを設定します。20 ~25倍の油浸しの目的を選択し、解像度を 12 ビット深度の 1024 x 1024 ピクセルに設定し、Z 間隔を 1 マイクロメートルに設定します。スライドを顕微鏡ステージにロードし、両方の検出器に同じレーザーパワーを使用して、最初の検出器のゲインを調整して明るいGFP信号を得て、2番目の検出器を調整して、キューティクル信号の高い領域の一部がこの検出器で飽和信号を生成するようにします。次に、タイルまたは位置のオプションを使用して脚をイメージ化し、脚が伸びるか大きすぎて 1 つのフレームでイメージ化できない場合に脚全体をキャプチャします。画像処理の場合は、ImageJ Fiji で共焦点スタックを開き、Bio-Formats プラグインを使用して、TIFF 形式でない画像を開きます。チャンネルを分割するには、[画像]、[カラー]、[スプリット チャンネル] の順に選択します。GFP 信号からキューティクル信号を引くには、プロセスと画像計算機を開き、画像 1 として探知器からスタックを選択します。操作ウィンドウで、減算を選択し、内因性のGFP信号のみが得られるように、検出器2からトラックを画像2として選択します。画像、スタック、Z保護を使用して、内因性GFP信号の最大強度投影を生成します。明るさとコントラストを調整するには、明るさコントロール ウィンドウのコントロールを使用します。次に、キューティクルの平均強度を生成し、続いて画像、カラー、およびマージチャンネルを生成して、GFPスタックを検出器2から取得したキューティクルのみのスタックにマージします。これは、組織特異的なGFP信号と、脚のセグメント内の軸索の樹状を識別するのに役立つキューティクル信号で構成されるRGB画像になります。マクロを使用するには、コンフォーカル スタックを開き、[イメージ]、[調整]、[明るさ/コントラスト] をクリックします。次に、[プラグインとマクロの実行] をクリックしてマクロを実行し、指示に従います。画像計算ウィンドウで操作を指定するように求められたら、イメージ 1 をスタック 1 として選択します。操作ウィンドウで、減算を選択します。スタック 2 としてイメージ 2 を選択します。コントラストを調整するように求められたら、明るさコントロールウィンドウのコントロールを使用して、GFP の最大投影画像の明るさのコントラストを調整し、キューティクルの平均投影を調整して、GFP を緑色で示す RGB 合成画像とグレーのキューティクルを示す両方の信号の RGB マージ画像を生成します。次に、スタック 1 とスタック 2 の結果をマージして、次のステージで使用できる GFP とキューティクル スタックを組み合わせて生成します。脚を 3 次元で視覚化するには、適切な 3D ソフトウェア プログラムで RGB スタックを開きます。ポップアップダイアログウィンドウで、モード変換セクションですべてのチャンネルを選択し、前の分析から取得したボクセルのサイズを入力します。チャンネル 1 モジュールで右クリックし、[表示とボレン]を選択します。その後、Volrenモジュールを左クリックします。[プロパティ]セクションで、[詳細設定]を左クリックし、[DDR]を選択します。次にガンマ値を調整して、キューティクルの背景を確認します。チャンネル 2 モジュールで右クリックし、[表示][Volren を表示]を選択します。次に、ボレンモジュールを左クリックして編集し、ボレングリーン.colを選択します。この手順を使用すると、キューティクルからの信号をGFP信号と組み合わせて、脚内の軸索の位置を特定することができます。脚を固定することは非常に重要です。適切に固定された脚では、脚の内部構造は均一な色で、暗い気管が見えます。不十分な固定脚では、暗い材料がタルサスおよび脛骨に存在し、気管系は大腿骨およびコクサではっきりと見えない。ここで説明した手順は、高分解能の高い太くてオート蛍光性のキューティクルを通して運動ニューロン軸索の蛍光発現を検出するという課題を克服するものである。そこで、得られたクリーンで詳細な蛍光信号により、3Dイメージングプログラムを用いて軸索の立体的特徴を可視化し、定量化することができます。そこでこの技術により、成人ショウジョウバエをモデルとして使用して、運動ニューロンの発達を研究するだけでなく、ERASなどの変性疾患が統合された運動システムに及ぼす影響を理解することができます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

のライブイメージング<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイ

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

分化およびアポトーシス恒常性を通じアダルト生物における脂肪細胞の数の調節のメカニズム

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

リンパ腺や血球中を調べるための方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

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郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

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解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

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ショウジョウバエメラノガスターの胚から成人への生存率を評価する直接的かつ簡単な方法

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

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回虫カエモルハブ炎エレガンスからの特定ニューロン集団の分離

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

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親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...