Name: visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle
Uploaded: 2018-10-30T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle at JoVE.com

Мы благодарим Роберт Ренар для подготовки среднего покупать продукты питания. Эта работа было поддержано NIH Грант NS070644 R.S.M. и финансирования от ALS ассоциация (#256), FRM (#AJE20170537445) и программа ATIP-Avenir ю.е.

1. ноги диссекции и фиксация
<ol><li>Возьмите стеклянную пластину и несколькими хорошо и заполнить соответствующее количество скважин с 70% этиловом спирте. Добавить 15 – 20 CO2-наркотизированных мух (и либо пола любого возраста) каждому хорошо и с помощью кисти, аккуратно промокните мух...

<ol>
	<li>Miller, A., Demerec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+internal+anatomy+and+histology+of+the+imago+of+Drosophila+melanogaster.">The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster.</a> Biology of Drosophila. , 420-531 (1950).</li><li>Soler, C., Ladddada, L., Jagla, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+muscles+and+tendons+of+the+Drosophila+leg.">Coordinated development of muscles and tendons of the Drosophila leg.</a> Development. 131 (24), 6041-6051 (2004).</li><li>Baek, M., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+and+Birth+Date+Specify+Motor+Neuron+Targeting+and+Dendritic+Architecture+in+adult+Drosophila.">Lineage and Birth Date Specify Motor Neuron Targeting and Dendritic Architecture in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 29 (21), 6904-6916 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Rathore, K., VijayRaghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+and+architecture+of+Drosophila+leg+motoneurons.">Developmental origins and architecture of Drosophila leg motoneurons.</a> Journal of Comparative Neurology. 520 (8), 1629-1649 (2012).</li><li>Enriquez, J., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Individual+Adult+Motor+Neuron+Morphologies+by+Combinatorial+Transcription+Factor+Codes.">Specification of Individual Adult Motor Neuron Morphologies by Combinatorial Transcription Factor Codes.</a> Neuron. 86 (4), 955-970 (2015).</li><li>Mahr, A., Aberle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+pattern+of+the+Drosophila+vesicular+glutamate+transporter:+a+marker+protein+for+motoneurons+and+glutamatergic+centers+in+the+brain.">The expression pattern of the Drosophila vesicular glutamate transporter: a marker protein for motoneurons and glutamatergic centers in the brain.</a> Gene Expression Patterns. 6 (3), 299-309 (2006).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+(MARCM)+for+Drosophila+neural+development.">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends in Neuroscience. 24 (5), 251-254 (2001).</li><li>Enriquez, J., Rio, L. Q., Blazeski, R., Bellemin, S., Godement, P., Mason, C. A., Mann, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differing+Strategies+Despite+Shared+Lineages+of+Motor+Neurons+and+Glia+to+Achieve+Robust+Development+of+an+Adult+Neuropil+in+Drosophila.">Differing Strategies Despite Shared Lineages of Motor Neurons and Glia to Achieve Robust Development of an Adult Neuropil in Drosophila.</a> Neuron. 97 (3), 538-554 (2018).</li><li>Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globally+optimal+stitching+of+tiled+3D+microscopic+image+acquisitions.">Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions.</a> Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).</li><li>Brierley, D. J., Blanc, E., Reddy, O. V., Vijayraghavan, K., Williams, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+targeting+in+the+leg+neuropil+of+Drosophila:+the+role+of+midline+signalling+molecules+in+generating+a+myotopic+map.">Dendritic targeting in the leg neuropil of Drosophila: the role of midline signalling molecules in generating a myotopic map.</a> PLoS Biology. 7 (9), e1000199 (2009).</li></ol>

Кутикула взрослых дрозофилы и других членистоногих, который содержит много темные пигменты, является основным препятствием для просмотра структуры внутри своего тела. Кроме того это сильно авто люминесцентная, которая усугубляется фиксации. Эти две функции являются весьма проблемат?...

Как позвоночных конечности дрозофилы взрослых ноги делится на сегменты. Каждый полет нога содержит 14 мышцы, каждая из которых включает в себя несколько мышечных волокон1,2. Клетки тела взрослых ноги MNs расположены в Т1 (prothoracic), (mesothoracic) T2 и T3 (metathoracic) ганглиев на каждой стороне воспалении брюшины шнура (VNC), структурный аналог позвоночных спинного мозга (рис. 1). Есть примерно 50 MNs в каждом ганглии, какие целевые мышцы в четырех сегментах ипсилатеральной ноге (coxa, вертела, бедра и голени) (рис. 1)3. Важно отметить, что каждый индивидуальный Взрослый ноги MN имеет уникальный морфологической идентификации, который весьма стереотипно между животных3,4. Все эти уникальные MNs являются производными от 11 стволовых клеток, называемых нейробласты (НБС) производства ногу MNs в личиночной стадии3,4. В конце все личиночной стадии незрелых Постмитотические MNs дифференцировать во время метаморфозы приобретать их конкретных дендритных беседки и аксональной терминала цели, которые определяют их уникальной морфологии3,4. Ранее мы тестировали гипотеза, комбинаторные код транскрипционных факторов (TFs) определяет уникальный морфология каждой дрозофилы ноги MN5взрослых. Как модель мы использовали линии B, один из 11 линий NB, которые производит семь из МНБ и продемонстрировал, что комбинаторной кода TFs, выраженные в Постмитотические взрослых ногу MNs диктует свои индивидуальные морфологии. Reprograming код TF МНБ мы были в состоянии переключиться MN морфологии на предсказуемой основе. Мы называем эти TFs: mTFs (морфологические TFs)5.
Одна из самых сложных частей морфологического анализа взрослых MNs является визуализировать аксоны через толстые и авто люминесцентные кутикулы с высоким разрешением. Мы обычно ярлык аксоны с меткой мембраны GFP, что выражается в MNs с системой двоичного выражения, такие как DVglut-Gal4/бла mCD8::GFP или DVglut-QF / QUAS mCD8::GFP, где DVglut — это сильное драйвер, выраженных в 6мотонейронов. Объединив эти инструменты с другими клоновых методы, как анализ мозаика с repressible маркер (MARCM)7,8стран СНГ MARCM или MARCMbow5, мы можем ограничить экспрессия гена GFP в субпопуляции МНБ фенотипического анализа аксонов проще. Мы породили протокол для того, чтобы держать ноги MN аксональное морфология нетронутыми для изображений и последующих 3D-реконструкции путем решения конкретных проблем, присущих взрослых дрозофилы ноги как (1) фиксация внутренних структур взрослых ноги не затрагивая аксона морфологии, эндогенного флуоресцентные выражение и мускулатура ноги, (2) монтаж ноги, чтобы сохранить общую структуру под coverslip и соответствующей ориентации для обработки для получения кутикулы изображений изображений и (3) фон, а также аксональное флуоресцентного сигнала. Хотя этот протокол был подробно для обнаружения флуоресцентные выражения в MN аксонов, он может применяться для визуализации другие компоненты ноги neuromusculature в членистоногих.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>E/6550DF/17</td>
			<td>Absolute analytical reagent grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nonionic&#160;surfactant&#160;detergent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>Triton X-100, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6521</td>
			<td>Jewelers forceps, Dumont No. 5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass multi-well plate</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71563-01</td>
			<td>9 cavity Pyrex, 100x85 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>28908</td>
			<td>Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP 229-1</td>
			<td>Glycerol (Molecular Biology)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Sun Jin Lab Co</td>
			<td>IS006</td>
			<td>iSpacer, four wells, around 12 &#956;L working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square 22x22 mm coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FIS#12-541-B</td>
			<td>No.1.5 -0.16 to 0.19mm thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM780; objective used LD LCI Plan-Apochromat 
			25x/0,8 Imm Korr DIC M27 (oil/ 
			silicon/glycerol/water 
			immersion) (420852-9871-000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imaging software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>ZEN 2011</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D-Image software</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Amira 6.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualize drosophila leg motor neuron axons through the adult cuticle

Большая часть работы по нейрональных спецификации были проведены в генетически и физиологически шансов справиться с возникающими моделей, таких как C. Элеганс, дрозофилы личинок и рыбы, которые занимаются волнообразно движений (как обход или плавание) как их основной режим локомоции. Однако, более сложный понимание спецификации индивидуального двигательного нейрона (MN) — по крайней мере с точки зрения информирования терапии болезни — требует столь же шансов справиться с возникающими системы, которая лучше моделирует комплекс на базе придаток локомоции схемы позвоночных животных. Взрослых дрозофилы опорно-двигательного аппарата отвечает за ходьба отвечает всем из этих критериев с легкостью, поскольку в этой модели это можно изучить спецификации небольшое количество легко отличить ноги MNs (примерно 50 MNs на ноги) как с использованием обширной массив из мощных инструментов генетических и в контексте физиологические системы на основе придаток локомоции. Здесь мы описываем протокол для визуализации иннервации мышц ног в взрослых летать.

Как показано на рисунке 4, эта процедура позволяет отличные снимки GFP-меченых аксоны в взрослых дрозофилы ноги, вместе с их терминала беседки. Главное чистый сигнал GFP получается без любого загрязнения от флуоресценции, испускаемых кутикулу ног. Си?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle at JoVE.com

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Визуализировать дрозофилы ноги мотонейрона аксоны через взрослых кутикулы

Здесь мы описываем протокол для визуализации аксональное ориентации с флуоресцентными белка в взрослых ноги дрозофилы , фиксации, монтаж, обработка изображений и шаги пост изображений.

The majority of work on the neuronal specification has been carried out in genetically and physiologically tractable models such as C. elegans, Drosophila ...

Этот метод может быть легко адаптирован для наблюдения сигналов от других флуоресцентных белков или может быть использован для изображения аксонов у других взрослых Основное преимущество этой техники облегчает отличную трехмерную реконструкцию и визуализацию аксонов и их терминальных беседок. Начните с заполнения соответствующего количества скважин в стеклянной пластине с 70% этанола. Используйте кисть, чтобы добавить от 15 до 20 углекислого газа анестезии мух любого возраста или пола, чтобы каждый хорошо и осторожно мазок мух в этанол, пока они полностью погружены.После не более чем одной минуты, промыть мух в три раза с 0,3%non-ionic сурфактант моющего средства раствора в фосфат-буферный солевой раствор, по крайней мере 10 минут за стирку. После последней стирки используйте типсы, чтобы удалить голову и живот каждой мухи, не повреждая грудной сегмент или ноги, и используйте кончик пары тонких типсов, чтобы мягко, но твердо оказать давление на кокса-грудную клетку, чтобы отделить одну ногу от грудного сегмента. Поместите ноги в один колодец новой пластины из нескольких хорошо, содержащей свежеприготовленные 4%paraformaldehyde на льду для ночной инкубации при четырех градусах по Цельсию.Важно, чтобы подтолкнуть ноги мягко в буфер фиксации, не давая им плавать, чтобы получить хорошо закрепленные ноги. На следующий день, мыть ноги пять раз в свежем 0,3%non-ionic surfactant моющее средство решение в течение 20 минут за стирку. После последнего мытья, заменить моющее средство с монтажом среды и держать ноги в монтажной среде, по крайней мере 24 часов.На следующий день добавьте около 20 микролитров 70%глицерола рядом с покрытым концом слайда стеклянного микроскопа и накройте глицерол 22 на 22 миллиметра крышкой. Затем добавьте около 10 микролитров линии монтажной среды справа от крышки и нанесите вторую 30-микролитровую линию монтажной среды справа от линии 10 микролитров. Используя тонкие типсы, перенесите одну ногу из пластины с мульти-хорошо в капле среднего до 10 микролитровой полосы монтажной среды во внешней стороне вверх или вниз ориентации.Повторите до тех пор, пока шесть-восемь ног были установлены и выровнены и место второй coverslip над ногами так, что второй coverslip лежит немного на первом coverslip. Затем используйте лак для ногтей в каждом углу крышки, чтобы обеспечить их на месте. Для изображения ног, используйте 488 нанометровый лазер и два детектора одновременно, чтобы создать первый трек для получения как GFP и кутикулы автоматической флуоресценции.Выберите цель погружения масла от 20 до 25X и установите разрешение до 1024 на 1024 пикселей с 12-битной глубиной и установите интервал z до одного микрометра. Загрузите слайд на сцену микроскопа и используя одинаковую лазерную мощность для обоих детекторов, отрегулируйте усиление первого детектора, чтобы получить яркий сигнал GFP, и отрегулируйте второй детектор, чтобы убедиться, что некоторые области с высоким сигналом кутикулы производят насыщенный сигнал в этом детекторе. Затем изображение ноги с помощью плитки или позиции вариантов для захвата всей ноги, если нога расширена или слишком велика, чтобы быть изображены в одном кадре.Для обработки изображений откройте конфокальный стек в ImageJ Fiji и используйте плагин Bio-Formats, чтобы открыть любые изображения, которые не находятся в формате TIFF. Чтобы разделить каналы, выберите каналы Изображения, Цвета и Сплита. Чтобы вычесть сигнал кутикулы из сигнала GFP, откройте калькулятор процесса и изображения и выберите стек из детектора один в качестве изображения.В окне операции выберите вычесть и выбрать трек из детектора два, как изображение два, так что только эндогенный сигнал GFP будет получен. Используйте изображение, стеки, защиту для генерации максимальной интенсивности проекции для эндогенного сигнала GFP. Используйте элементы управления в окне управления яркостью для регулировки яркости и контрастности.Затем создайте среднюю интенсивность кутикулы, а затем Каналы изображения, цвета и слияния, чтобы объединить стек GFP обратно с стеком только для кутикулы, приобретенным у детектора два. Это приведет к RGB изображение состоит из ткани конкретных GFP сигнала, а также кутикулы сигнал, чтобы помочь определить аксон беседки в ногах сегментов. Чтобы использовать макрос, откройте конфокальный стек и нажмите изображение, отрегулируйте и яркость/контрастность.Затем нажмите Plugin и Macro Run, чтобы запустить макрос и следуйте инструкциям. При просьбе указать операцию в окне калькулятора изображений выберите изображение в качестве стека. В окне операции выберите вычитание.Выберите изображение два в качестве стека два. Когда вас просят настроить контрастность, используйте элементы управления в окне управления яркостью, чтобы настроить контрастность яркости максимального проекционного изображения GFP и средней проекции кутикулы для создания RGB объединенного изображения обоих сигналов, показывающих GFP зеленым цветом, и кутикулы серым цветом. Затем объединить результаты стека один и стек два для создания комбинированного GFP и кутикулы стек, который может быть использован на следующем этапе.Чтобы визуализировать ноги в трех измерениях, откройте стек RGB в соответствующей 3D-программе. В окне всплывающего диалога выберите все каналы в разделе преобразования режима и введите размер воксела, полученного из предыдущего анализа. В модуле первого канала нажмите правой кнопкой мыши и выберите Дисплей и Volren.Затем слева нажмите на модуль Volren. В разделе Свойства слева нажмите на Расширенный и выберите DDR. Затем отрегулируйте гамма-значение, чтобы увидеть фон кутикулы.В модуле канала два, право нажмите и выберите дисплей Volren. Затем слева нажмите на модуль Volren, редактировать и выберите volrenGreen.col. Используя эту процедуру, сигнал от кутикулы может быть объединен с сигналом GFP для определения позиционирования аксонов в ногах.Критически важно получить хорошо закрепленные ноги. В правильно закрепленных ногах, внутренние структуры внутри ног имеют равномерный цвет и трахеи, которые темные, видны. В плохо закрепленных ногах, темный материал присутствует в tarsus и голени и трахеальной системы не ясно видны в бедренной кости и кокса.Процедура, которую мы описали здесь, преодолевает проблему обнаружения флуоресцентного экспрессии в аксонах моторных нейронов через толстую и автоматическую флуоресцентную кутикулу с высоким разрешением. Таким образом, полученный чистый и подробный флуоресцентный сигнал позволяет нам визуализировать и количественно визуализировать трехмерную особенность аксонов с помощью 3D-программ визуализации. Таким образом, этот метод позволит нам использовать взрослую дрозофилу в качестве модели не только для изучения развития моторного нейрона, но и для изучения, чтобы понять влияние дегенеративных заболеваний, таких как ERAS на локомотивную систему интегрированы.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Live-визуализация<em&gt; Drosophila</em&gt; Куколки глаз

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Mechanism of Regulation of Adipocyte Numbers in Adult Organisms Through Differentiation and Apoptosis Homeostasis

Механизм регулирования адипоцитов числа в взрослом организме через дифференциацию и Апоптоз гомеостаза

Considering that adipose tissue (AT) is an endocrine organ, it can influence whole body metabolism. Excessive energy storage leads to the dysregulation of ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Методы Изучить лимфа железой и гемоцитах в<em&gt; Drosophila</em&gt; личинки

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Генерация генетически модифицированных мышей посредством микроинъекции ооцитов

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Рассечение и Immunofluorescent окрашивание гриб тело и фоторецепторных нейронов в мозге взрослого Drosophila melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Размораживание, культивирования и Cryopreserving дрозофила клеточных линий

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Прямой и простой метод для оценки Drosophila меланогастер'S жизнеспособность от эмбриона к взрослому

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Изоляция конкретных популяций нейронов от roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

Ретроградная трассировка дрозофилических мотонейронов с использованием липофильных флуоресцентных красителей

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...